 導讀 【研究意義】豆粕是大豆加工副產品，富含多種營養物質，其中蛋白質含量為40%—50%，脂肪為1%—2%，碳水化合物約為10%—15%，且較魚粉價格低，是目前最廣泛使用的植物性蛋白質飼料原料。但豆粕中存在多種抗營養因子如胰蛋白酶抑制因子、抗原蛋白、寡糖等，會造成畜禽生產性能和飼料利用率降低。目前消除豆粕中抗營養因子的主要方法包括物理法、化學法、微生物發酵法及添加酶制劑法，其中微生物發酵法安全、健康、高效，可最大限度地降解豆粕中的抗營養因子，并產生乳酸、維生素、益生菌等活性物質。然而由于發酵菌種、發酵工藝及豆粕本身特性的差異，目前市場上發酵豆粕產品質量良莠不齊。基于此，有必要對現行市場上流通的豆粕和發酵豆粕中的抗營養因子水平進行調查分析，為其在飼料中的合理使用提供數據依據。 【前人研究進展】目前研究發現發酵可明顯降低豆粕中胰蛋白酶抑制因子、植酸、大豆凝集素、寡糖、抗原蛋白、脲酶的含量。Hirabayashi 等使用宇佐美曲霉發酵豆粕，發現發酵后豆粕中的植酸全部被降解。Feng 等使用產蛋白酶菌—米曲霉發酵豆粕，可完全消除豆粕中胰蛋白酶抑制因子。此外發酵還可以提高粗蛋白質、氨基酸、多種活性物質的含量，同時產生特殊氣味，提高動物適口性。 【本研究切入點】本研究分析了6 種對動物健康和發育有較大影響的抗營養因子，包括熱不穩定性的胰蛋白酶抑制因子、脲酶和熱穩定性大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、棉籽糖以及水蘇糖。其中脲酶活性是評價豆粕營養價值的主要指標；胰蛋白酶抑制因子受其分析方法的限制少有人檢測，往往是通過脲酶活性對其進行間接評價。本研究發現脲酶含量并不能客觀反映胰蛋白酶抑制因子的變化。棉籽糖和水蘇糖占低聚糖總量的90%，具有熱穩定性，加熱不能使其失活，同時不同的發酵工藝對兩種低聚糖的消除情況也不盡相同；大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白是兩種主要的抗原蛋白，不能通過簡單的加熱使其鈍化。因此有必要對市場流通的豆粕及發酵豆粕中上述6 種抗營養因子的含量水平進行調查分析。 【擬解決的關鍵問題】采用HPLC 測定棉籽糖和水蘇糖含量，應用ELISA 法對β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子的含量進行測定，而脲酶采用國標方法進行測定。比較豆粕與發酵豆粕中主要抗營養因子含量，總結二者中抗營養因子含量的正常值范圍，對當前市場上的豆粕及發酵豆粕質量進行分析。 1材料與方法 1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀、高速離心機、渦旋儀、旋轉蒸發儀、酸度計、水浴鍋、酶標儀。大豆胰蛋白酶抑制因子定量檢測試劑盒、大豆球蛋白定量檢測試劑盒、β-伴大豆球蛋白定量檢測試劑盒。棉籽糖和水蘇糖標準品（純度99.5%），乙醇水溶液（濃度為70%），試驗用水為Millipore 純水系統制得的高純水，乙腈為HPLC 純；尿素緩沖液pH 7.0±0.1（稱取8.95 g 磷酸氫二鈉，3.4 g 磷酸二氫鉀溶于水，再將30 g 尿素溶在此緩沖液中）、鹽酸溶液C（HCl）=0.1 mol·L-（1 稱取8.3 mL鹽酸用水稀釋至1 000 mL）、氫氧化鈉標準溶液C（NaOH）=0.1 mol·L-1（稱取4 gNaOH 用水稀釋至1 000 mL）。 1.2 樣品來源 樣品來源：山東、河南、天津、北京、遼寧、黑龍江、河北、江蘇、浙江、重慶10 個省（市、自治區）經營和使用環節的65 批次豆粕；山東、河南、廣東、北京、浙江、江西、江蘇、湖北、上海、天津、遼寧、四川、福建13 個省（市、自治區）經營和使用環節的54 批次發酵豆粕。取樣地區和數量見表1。  1.3 樣品測定方法 1.3.1 棉籽糖和水蘇糖的測定 參考文獻并進行單因素試驗，對提取方法、料液比、提取液濃度進行優化，最終確定試驗方案。該試驗的優化及試驗方案另文撰寫。 1.3.2 脲酶的測定 參照GB/T8622-2006《飼料用大豆制品中脲酶活性的測定》測定豆粕和發酵豆粕中的脲酶。 1.3.3 大豆球蛋白，β-伴大豆球蛋白，胰蛋白酶抑制因子的測定 ELISA 測定過程參照產品說明書進行。具體過程如下：稱取一定質量樣品（抗原蛋白0.300 g，胰蛋白酶抑制因子0.100 g，均精確到0.001 g）于50 mL 離心管中，加入30 mL 提取液，于25℃振蕩16 h，靜置2 min 后，離心5 min（4 000 r/min），取上清液并稀釋70 倍。將樣品盒標準品對應微孔按序編號，每個樣品和標準液平行測定兩次，記錄校準孔和樣品孔所在的位置，經過加樣、洗板、加酶標試劑、顯色，加終止液后于450/630 nm 雙波下讀取吸光度值。按照下列公式計算吸光率：百分吸光率(%)=B/B0×100%其中，B 為校準品或樣品的平均吸光度值，B0 是標準品1 的平均吸光度值。校準曲線的繪制：以校準品百分吸光率為縱坐標，以校準品濃度的對數為橫坐標，繪制標準曲線。 1.4 數據分析 試驗數據采用Excel 2012 進行統計并采用百分位數法進行分析。 2結果 2.1 豆粕和發酵豆粕中大豆球蛋白的含量分析 利用ELISA 試劑盒分析豆粕和發酵豆粕中大豆球蛋白，結果見表2。發酵豆粕中大豆球蛋白平均含量比豆粕減少57.7%。從圖1-a 可明顯看出，90%的豆粕中大豆球蛋白含量聚集在60—180 mg·g-1 范圍內，而90%的發酵豆粕中的大豆球蛋白含量主要集中在0—120 mg·g-1。采用百分位數法對數據進行分析，得出豆粕P90（90%的檢測值小于P90）是177.3 mg·g-1，發酵豆粕中大豆球蛋白含量的百分位數值P90 是109.4mg·g-1。可以推斷出豆粕中的大豆球蛋白含量正常值范圍在58.9—P90（177.3 mg·g-1）之間，發酵豆粕中大豆球蛋白含量正常值范圍為ND—P90（109.4 mg·g-1）。 2.2 豆粕和發酵豆粕中β-伴大豆球蛋白的含量分析 結合表2 發酵豆粕中β-伴大豆球蛋白平均含量相較于豆粕降低了63.2%。圖1-b 揭示了豆粕和發酵豆粕中β-伴大豆球蛋白含量聚集范圍及變化趨勢，所調查的65 批次豆粕中β-伴大豆球蛋白含量主要集中在42.8—150 mg·g-1范圍內，含量百分比約85%，而54批次的發酵豆粕中的β-伴大豆球蛋白含量主要聚集在0—60 mg·g-1 范圍內，所占百分比為83%。采用百分位數法對數據進行統計分析，得出豆粕中β-伴大豆球蛋白百分位數值P85 是147.2 mg·g-1，而發酵豆粕中β-伴大豆球蛋白百分位數值P85 是53.8 mg·g-1，由這些數據可以判斷豆粕及發酵豆粕中β-伴大豆球蛋白含量正常值范圍分別為42.8—P85（147.2 mg·g-1）和ND—P85（61.8 mg·g-1）。 2.3 豆粕和發酵豆粕中胰蛋白酶抑制因子的含量分析 胰蛋白抑制因子平均含量在發酵豆粕中比在豆粕中降低了59.1%（表2），此結果與陳斌在微生物發酵對豆粕中抗營養因子及營養價值的影響中的胰蛋白酶抑制因子下降了50.4%的結果相近。從圖1-c 中可以看出發酵豆粕和豆粕中胰蛋白酶抑制因子含量變化趨勢及主要集中范圍，二者均較低且主要分布在0—40 mg·g-1 范圍內，但發酵豆粕中的胰蛋白酶抑制因子比豆粕中的胰蛋白酶抑制因子低，其中80%的發酵豆粕中胰蛋白酶抑制因子含量在0—10 mg·g-1，而80%豆粕胰蛋白酶抑制因子的含量主要聚集在0—30mg·g-1，豆粕中胰蛋白酶抑制因子P80 為28.6 mg·g-1，發酵豆粕中胰蛋白酶抑制因子P80 為9.9 mg·g-1，采用百分位數法分析進一步表明發酵豆粕中的胰蛋白酶抑制因子含量降低，豆粕及發酵豆粕胰蛋白抑制因子含量正常值范圍應為ND—P80（28.6 mg·g-1）、ND—P80（9.9 mg·g-1）。 2.4 豆粕和發酵豆粕中低聚糖的含量分析 液相色譜檢測低聚糖方法最小檢出限為0.01mg·g-1，發酵豆粕中棉籽糖平均含量比豆粕減少了82.5%、水蘇糖平均含量降低了82.5%（表2）。從圖1-d 中可以看出90%的發酵豆粕中棉籽糖含量在0—6mg·g-1 范圍內，而90%豆粕中棉籽糖的含量在6—15mg·g-1 范圍內。86%的豆粕中水蘇糖含量在21—42mg·g-1 范圍內，而87%的發酵豆粕中水蘇糖含量在0—14 mg·g-1 范圍內。采用百分位數法對這一結果進行分析，豆粕中的棉籽糖含量P90 為13.79 mg·g-1，而棉籽糖在發酵豆粕的含量P90為4.65 mg·g-1 。豆粕P85中的水蘇糖含量為33.29 mg·g-1，發酵豆粕中水蘇糖含量P85 為11.58 mg·g-1，以上數據充分說明了發酵豆粕中  圖1 豆粕及發酵豆粕中抗營養因子含量百分比（大豆球蛋白：a；β-伴大豆球蛋白：b；胰蛋白酶抑制因子：c；棉籽糖：d；水蘇糖：e）  低聚糖含量普遍低于豆粕。豆粕和發酵豆粕中棉籽糖含量正常值范圍為ND—P90（13.79 mg·g-1）、ND—P90（4.65 mg·g-1），水蘇糖的含量正常值范圍為ND—P85（33.29 mg·g-1）、ND—P85（11.58 mg·g-1）。 2.5 豆粕和發酵豆粕中脲酶的活性分析 采用百分位數法對數據進行統計分析，得出豆粕中脲酶百分位數值P90是0.19 U·g-1，P97 是0.40 U·g-1，符合國家標準規定的飼用豆粕的脲酶含量為0.02—0.45 U·g-1，由這些數據可以判定，豆粕中脲酶含量正常值范圍應在ND—P97（0.40 U·g-1）之間。發酵豆粕中的脲酶未檢出，結果表明發酵可以顯著降低脲酶活性。 3討 論 本次調查抽取的65 批次豆粕和54 批次發酵豆粕經檢測分析表明發酵豆粕所含的不同種類的抗營養因子的量比豆粕低，但不乏部分發酵豆粕中抗營養因子含量居高的現象，可能是加工程度、發酵工藝、大豆品種的問題。 3.1 與現有報道中抗營養因子的含量比較 本抽樣調查的65 批次豆粕中大豆球蛋白含量正常值范圍為58.9—177.3 mg·g-1，小于文獻總結的豆粕中的含量400 mg·g-1，而54 批次的發酵豆粕中大豆球蛋白含量正常值范圍為≤109.34 mg·g-1，超出了文獻中的含量范圍＜0.02 mg·g-1，說明現行市場中的發酵豆粕中大豆球蛋白含量普遍居高。豆粕中β-伴大豆球蛋白含量正常值范圍是42.8—185.8 mg·g-1，89%的豆粕在≤155 mg·g-1范圍內，而其在發酵豆粕中的含量正常值范圍為≤61.8 mg·g-1，超過了文獻中的的含量范圍≤0.01 mg·g-1。胰蛋白酶抑制因子含量正常值范圍為≤28.6 mg·g-1，與胰蛋白酶抑制因子在豆粕中的含量為2%左右一致。豆粕中棉籽糖含量正常值范圍為≤13.79 mg·g-1，接近1%，豆粕中水蘇糖含量正常值范圍≤33.29 mg·g-1 與文獻報道基本一致，發酵豆粕的棉籽糖含量正常值范圍為≤4.65 mg·g-1，發酵豆粕中水蘇糖含量正常值范圍為≤11.58 mg·g-1，合計為≤16.23 mg·g-1，與現有報道中＜0.9%有一定的出入。豆粕中脲酶活性范圍≤0.40 U·g-1，發酵之后脲酶活性未檢出，則說明發酵之后脲酶完全降解，該結果與現有研究中關于黑曲霉發酵豆粕中脲酶全部被降解的結果相一致。根據研究結果，豆粕中抗營養因子含量基本與現有研究結果相符，但發酵豆粕中抗原蛋白的含量居高，表明現在的發酵工藝對胰蛋白酶抑制因子、低聚糖、脲酶的鈍化水平高于對抗原蛋白的消除水平。此外，不同的發酵豆粕中同種抗營養因子含量差異較大，部分產品的抗營養因子含量與豆粕相當，因此發酵工藝，豆粕質量是影響發酵后抗營養因子鈍化程度的重要原因。 3.2 抗營養因子鈍化情況的比較 抗營養因子在發酵過程中鈍化機理不同導致其消除程度也會有差異。大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子含量降低的程度趨于一致，分別為57.71%、63.2%、59.08%。這可能是由于豆粕中的蛋白質經微生物發酵分解，使抗原蛋白和胰蛋白酶抑制因子含量下降。 3.3 抗營養因子之間的含量比較 研究結果發現，在豆粕和發酵豆粕中，6 種抗營養因子含量排序均為大豆球蛋白＞β-伴大豆球蛋白＞胰蛋白酶抑制因子＞水蘇糖＞棉籽糖＞脲酶，與現有研究報道相一致。有研究表明，仔豬腸道對日糧抗原過敏，從而導致腸道損傷，是仔豬斷奶后腹瀉和生長發育受阻的一項主要原因。胰蛋白酶抑制因子的抗營養作用主要表現在抑制動物生長，降低胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶活性，影響營養物質的消化，并造成胰腺腫大等方面，但目前豆粕的質量評價只通過測定脲酶活性間接反映胰蛋白酶抑制因子的含量，但脲酶活性是豆粕中起最低抗營養作用的因素且在發酵過程中脲酶可基本全部降解，不能準確反映胰蛋白酶抑制因子鈍化情況。此外，過量的大豆寡糖，易引起動物腹鳴、腹脹、腹瀉，雖然含量低于前3 個抗營養因子，但其抗營養效應顯著為保證動物健康。綜上，有必要對這6 種抗營養因子進行鈍化并對其含量進行測定。 4結 論 本研究調查分析了市場中的65 批次豆粕和54 批次的發酵豆粕，其中主要抗營養因子進行了含量分析。結果表明，發酵豆粕中的抗營養因子含量低于豆粕，由于不同廠家使用菌種種類、菌種數目、加工工藝的不同其含量不完全相同，建議對豆粕質量評價指標中加入對動物影響較大的大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子等抗營養因子的含量分析，更全面地測定并反映豆粕及發酵豆粕的質量。同時本研究中推斷出抗營養因子的含量正常值范圍，有助于了解現行市場的豆粕和發酵豆粕的抗營養因子含量水平，并對飼料企業和養殖行業對豆粕及發酵豆粕的選擇有指導意義。 （來源：中國農業科學；作者：楊玉娟, 姚怡莎, 秦玉昌等） |
京公網安備 11010802025824號