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畜牧人

標題: 牛血清在細胞培養中的作用與質量要求 [打印本頁]

作者: huang080808 時間: 2007-6-3 20:59
標題: 牛血清在細胞培養中的作用與質量要求
牛血清在細胞培養中的作用與質量要求- - 現代生物技術一般認為包括基因工程技術、細胞工程技術、酶工程技術和發酵工程技術，而這些技術的發展幾乎都與細胞培養有密切關系，特別是在醫藥領域的發展，細胞培養更具有特殊的作用和價值。比如基因工程藥物或疫苗在研究生產過程中很多是通過細胞培養來實現的。基因工程乙肝疫苗很多是以[size=+0]CHO細胞作為載體；細胞工程中更是離不細胞培養，雜交瘤單克隆抗體，完全是通過細胞培養來實現的，既使是現在飛速發展的基因工程抗體也離不開細胞培養。正在倍受重視的基因治療、體細胞治療也要經過細胞培養過程才能實現，發酵工程和酶工程有的也與細胞培養密切相關。總之，細胞培養在整個生物技術產業的發展中起到了很關鍵的核心作用。細胞培養的發展，培養基的質量又是關鍵，而培養基的主要成份中動物血清對細胞的生長繁殖發揮著重要甚至是難以替代的作用。在動物血清的應用中牛血清又是最為廣泛的，所以牛血清是醫藥生物技術產品中重要的原材料之一。保證牛血清質量也是促進生物制品質量提高的重要環節。

一、[size=+0] 牛血清在細胞培養基中的主要功能
牛血清是細胞培養中用量最大的天然培養基，含有豐富的細胞生長必須的營養成份，具有極為重要的功能。
[size=+0]1.提供對維持細胞指數生長的激素，基礎培養基中沒有或量很少的營養物，以及主要的低分子營養物。
[size=+0]2. 提供結合蛋白，能識別維生素、脂類、金屬和其他激素等，能結合或調變它們所結合的物質活力。
[size=+0]3.有些情況下結合蛋白質能與有毒金屬和熱原質結合，起到解毒作用。
[size=+0]4.是細胞貼壁、鋪展在塑料培養基質上所需因子來源。
[size=+0]5.起酸堿度緩沖液作用。
[size=+0]6.提供蛋白酶抑制劑，使在細胞傳代時使剩余胰蛋白酶失活，保護細胞不受傷害。
二、[size=+0] 牛血清的主要成份
血清是一種很復雜的混合物，其組成成份雖大部分已為人所知，但還有一部分尚不清楚，而且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養條件不同而異。
[size=+0]1.蛋白質是牛血清中主要成份。除包括可攜帶金屬離子、脂肪酸和自身是激素類蛋白外主要還有白蛋白，球蛋白。
纖維粘連素[size=+0] 細胞促進細胞附著；α[size=+0]2 巨球蛋白[size=+0] 抑制胰蛋白酶的作用；胎牛血清中含胎球蛋白[size=+0] 促細胞附著；轉鐵蛋白[size=+0] 能結合鐵離子，減少其毒性和被細胞利用。
[size=+0]2.多肽：血小板促生長因子能促細胞分裂，是多肽家庭的主要成員之一，是主要的促細胞增殖因子；成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子、神經細胞生長因子等，血清中含量雖很少，但對細胞生長也有一定作用。
[size=+0]3.激素：激素對細胞的作用是多方面的。
胰島素：促進細胞攝取葡萄糖和氨基酸，與促細胞分裂有關。類胰島素生長因子：能與細胞表達的胰島素受體結合，從而有胰島素同樣的作用。促生長激素：促細胞增殖效應。氫化可的松：血清中含有定量的該成分，它可能兼有促細胞貼附和增殖作用，但有人證明，血清中的氫化可的松，如細胞密度高時可能有抑制細胞的作用和誘導其發生分化。
[size=+0]4其他成份
氨基酸、葡萄糖、酮酸等對多種營養成分的合成培養基意義不大。與蛋白相結合狀態的微量元素對細胞培養有意義。
三、[size=+0] 牛血清的質量要求
隨著科學技術的發展和生活水平的不斷提高對生物醫藥產品的質量要求也越來越高，所以對制備工藝中所涉及到的各種原材料的質量標準要求也越來越高，特別是對用于細胞培養基中的主要天然成份――牛血清的質量要求也不斷提高。牛血清包括胎牛血清、新生牛血清和成牛血清。
（一）、[size=+0]WHO公布的《用動物細胞體外培養生產生物制品規程》中的要求：
[size=+0]1. 牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家。并應具備適當的監測系統。
[size=+0]2.有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群。
[size=+0]3.證明所用牛血清中不含對所生產疫苗病毒的抑制物。
[size=+0]4.血清要通過濾膜過濾除菌，保證無菌。
[size=+0]5.無細菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國家要求無細菌噬菌體污染。
[size=+0]6.對細胞有良好的支持繁殖作用。
（二）、我國在對牛血清的質量[size=+0]2000年版《中國生物制品主要原輔料質控標準》中提出比較嚴格的標準要求。包括蛋白質含量，細菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細菌內毒素，支持細胞增殖檢查。
（三）、美國對牛血清的質量要求：[size=+0]Gibco 和[size=+0]Sigma二家主要的美國牛血清供應商的牛血清都已進入到我國市場，他們對其質量標準要求都極為嚴格，從血清來源到產品質量都有明確規定。
[size=+0]1）[size=+0] 血清來源：可從世界各國收集胎牛血清，但是必須符合他的質量標準和美國農業部進口要求。地方當局還不清楚本地是否有牛海綿狀病毒流行的血清不收集，有說明血清質量的證明資料：包括收集過程的全部資料、檢驗結果和交付情況。
[size=+0]2）血清的收集：胎牛血清是心臟穿刺取血，新生牛（[size=+0]10～[size=+0]14天）和小牛（[size=+0]10個月內）血清靜脈取血。血清采集條件必須符合工業生產的標準：低溫下采集、一次分離、分離后立即混合凍存。符合要求的血清[size=+0]56℃水浴[size=+0]30分鐘滅活。
[size=+0]3）血清的制備：
[size=+0]a. 超低[size=+0]IgG胎牛血清：通過親和層析工藝去除胎牛血清中的γ球蛋白，使[size=+0]FBS γ球蛋白含量減到最低，一般[size=+0]IgG≤[size=+0]5ug/ml，生物學活性不變。
[size=+0]b. 血清透析：用[size=+0]12000～[size=+0]14000分子量的透析膜在[size=+0]0.15M NaCl中透析直到使葡萄糖含量＜[size=+0]0.5mg/ml（用葡萄糖氧化酶／過氧化酶方法測定）。
[size=+0]c. γ－射線照射：已經證明γ－射線照射可以有效滅活血清中可能污染的病毒、支原體。照射劑量為[size=+0]30～[size=+0]45KG。而且這個劑量的γ－射線照射不會改變血清的理化性質和對細胞培養的影響。
[size=+0]4）除菌過濾[size=+0]:經過上述處理的粗制血清再經過一系列除菌濾膜過濾包括[size=+0]0.2微米（[size=+0]micron）和[size=+0]0.1微米濾膜。[size=+0]FBS要通過三層[size=+0]0.1微米濾膜，其他血清可通過[size=+0]0.2微米濾膜。
[size=+0]4.終產品血清質量
[size=+0]1）化學檢定：滲透壓[size=+0]pH
蛋白含量――電泳法
白蛋白[size=+0] 球蛋白[size=+0] 血紅蛋白隨著牛年齡增加血清中總蛋白含量相應增加，總的血清蛋白含量可以確定產品規格和年齡。
[size=+0]2）[size=+0] 微生物學檢查：細菌、真菌符合[size=+0]USP標準。
支原體：在支原體專業培養基上培養了[size=+0]3～[size=+0]4周，培養溫度[size=+0]36℃±[size=+0]2℃分別在需氧和厭氧條件下進行，有的還需要在支原體瓊脂培養皿上傳[size=+0]4次，[size=+0]Hoechst熒光素[size=+0]DNA染色檢查那些培養法無法檢出的支原體如豬鼻支原體等。
病毒檢查：
牛蘭舌病毒[size=+0] Bovin blue tongue
牛腺病毒[size=+0] Bovine Adenovirus
牛細小病毒[size=+0] Bovine Parvovirus
牛病毒性腹泄病毒[size=+0] Bovine Viral Diarhea Virus
犬病病毒[size=+0] Rabies
呼腸弧病毒[size=+0] Reovirus
牛呼吸道合胞病毒[size=+0] BRSV
副流感病毒Ⅲ型[size=+0] Parainfluenza
檢查方法：
已證明無外源因子污染的牛細胞培養物，在細胞生長液中加[size=+0]15％待測血清，連傳[size=+0]3代共[size=+0]21天。陰性對照細胞培養液中加[size=+0]15％已知無病毒污染的牛血清，與試驗組同條件下進行。在觀察期內注意細胞形態變化或細胞病變。在觀察期內第[size=+0]14天待檢樣品和對照樣品用標準病毒檢測方法檢查。如待檢細胞培養物經胰酶消化后分種到[size=+0]6個含蓋玻片的容器內。陰性對照樣品按同樣方法。再將牛腹泄病毒、牛細小病毒、牛腺病毒、狂犬病毒和呼腸弧病毒分別加入待檢培養物蓋玻片容器內作為陽性對照，再培養[size=+0]7天，用熒光抗體技術進行檢查。細胞病變或病毒引起的其他改變通過蘇木精或伊紅染色進行觀察。取另外一個待檢細胞培養瓶用人"[size=+0]O"紅細胞、豚鼠紅細胞和新鮮雞紅細胞作血球吸附病毒檢查。試驗在[size=+0]2～[size=+0]8℃和[size=+0]20～[size=+0]24℃進行。陰性對照細胞預先感染副流感Ⅲ型病毒作為陽性對照。未感染的細胞作為陰性對照。
[size=+0]3）內毒素檢測
用鱟試劑檢查。
[size=+0]4）細菌噬菌體檢查
主要檢查[size=+0]E.Coli(C300 or K-12)噬菌體。
[size=+0]5）激素含量測定
每批[size=+0]FBS對某些激素含量都要進行測定，包括：雌二醇、胰島素、孕硐、睪丸素、甲狀腺素等。
[size=+0]6）血紅蛋白檢測血紅蛋白與氧合血紅蛋白的比≥[size=+0]70％，血紅蛋白含量≤[size=+0]mg15/dl。
[size=+0]7）細胞生長效果測定
[size=+0]a.細胞克隆效果測定
細胞選擇：[size=+0]Sp20/Ag-14 或[size=+0]P3X63-Ag8.653血清濃度與細胞數[size=+0]:10％血清／[size=+0]1個細胞／孔[size=+0] 4％血清／[size=+0]5個細胞／孔細胞培養基[size=+0]RPMI－[size=+0]1640，[size=+0] 96孔培養盤[size=+0]36℃±[size=+0]2℃，[size=+0]5％二氧化碳培養[size=+0]10～[size=+0]15天。試驗中選擇一個已知參考牛血清作對照。克隆效率計算：克隆效率＝[size=+0](陽性孔平均數[size=+0]/ 培養孔總數[size=+0]) X100％[size=+0]
相對克隆效率＝待測血清克隆效率[size=+0]/參考血清克隆效率
[size=+0]b.貼壁效率試驗：
人的傳代細胞作每批血清的貼壁效率試驗，[size=+0]A549（人肺癌細胞）該細胞可以反應出低濃度血清的貼壁變化。采用[size=+0]6孔培養盤每批血清用兩種濃度和兩種不同的細胞接種數即[size=+0]10％血清――[size=+0]100細胞／孔，[size=+0]4％血清[size=+0]200介細胞／孔。放[size=+0]36℃±[size=+0]2℃，濕潤[size=+0]5％二氧化碳培養箱培養[size=+0]10～[size=+0]14天，計算著色細胞克隆，確定貼壁效率。從這兩種不同血清濃度來確立實驗血清支持細胞貼壁生長的水平，分析兩種試驗條件下平均貼壁效率。
貼壁效率（％）＝[size=+0](每孔克隆平均數[size=+0]/ 每孔活存的培養細胞平均數[size=+0]) X100％
相對貼壁效率＝被測血清貼壁效率[size=+0]/參考血清貼壁效率
[size=+0]c. 二倍體纖維細胞促生長試驗
人二倍體細胞株[size=+0] WI28 MRc5
[size=+0]25cm2細胞培養瓶，[size=+0]5％血清，每瓶接種[size=+0]1.5X105細胞連傳[size=+0]3代，每代血清濃度和接種細胞數相同，每代培養[size=+0]7天，每代接種二個細胞瓶，[size=+0]36℃±[size=+0]2℃培養。以同樣條件用已知參考血清進行平行培養。每代收獲細胞計數，計算每批待檢血清與參考血清的相對生長率（[size=+0]RGR）。
[size=+0]RGR＝[size=+0](試驗血清每瓶細胞平均數[size=+0]/ 參考血清每瓶細胞平均數[size=+0]) X100％
牛血清主要質量要求（[size=+0]Sigma）[size=+0]
胎牛血清[size=+0] 新生牛血清[size=+0] 成牛血清[size=+0]
牛齡[size=+0] 胎[size=+0] 10～[size=+0]14天[size=+0] ＜[size=+0]10個月[size=+0]
無菌[size=+0] －[size=+0] －[size=+0] －[size=+0] 病毒[size=+0] －[size=+0] －[size=+0] －[size=+0] 支原體[size=+0] －[size=+0] －[size=+0] －噬菌體[size=+0] －[size=+0] －[size=+0] －[size=+0] 內毒素（[size=+0]ng/ml）[size=+0] ≤[size=+0]1.0 ≤[size=+0]10.0 ≤[size=+0]10(15) 血紅蛋白（[size=+0]g%）[size=+0] 3.0～[size=+0]4.5 3.5～[size=+0]6.0 5.0～[size=+0]8.5 pH 6.7～[size=+0]8.0 7.0～[size=+0]8.0 7.0～[size=+0]8.0 滲透壓（[size=+0]mom/Kg H2O）[size=+0] 240～[size=+0]340 240～[size=+0]340 240～[size=+0]340
新的藥品管理法即將公布，新的藥品管理法對生物制品提出更嚴格的質量要求。特別是我國即將加入[size=+0]WTO，會有更多的國外生物制品進入中國市場，我國的生物制品也希望更多地走向國際市場，所以在制品質量上要求會更高，產品的市場競爭應主要靠質量競爭。所以對產品中的主要原材料的質量要求也會越來越嚴格。如實驗動物我國[size=+0]SDA已提出嚴格的質量標準，并提出全國各使用部門達到標準的期限。為了貫徹[size=+0]2000年版《中國生物制品規程》標委會修訂了《中國生物制品主要原輔材料質控標準》其中包括了生產用牛血清的質控要求，這是一個最低要求，和國外產品的要求還有差距，希望各牛血清生產單位和使用單位，自己能制定出更高更嚴格的標準，以進一步提高我國生物制品質量。

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