歸芪益母湯耐缺氧及抗氧化作用的實(shí)驗(yàn)研究
許小琴1韋旭斌1劉學(xué)忠2李金貴2胡仲明1柳巨雄1王治1張玉國(guó)1
（1.解放軍軍需大學(xué) 軍事獸醫(yī)系，吉林 長(zhǎng)春 130062；2.揚(yáng)州大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009）
關(guān)鍵詞：歸芪益母湯；中藥復(fù)方；耐缺氧；抗氧化
歸芪益母湯是出自清代的一首用于治療勞役過(guò)度所致氣血俱虛及產(chǎn)后血瘀腹痛的方劑，全方由當(dāng)歸、黃芪、益母草3味中藥組成，具有氣血雙補(bǔ)與活血化瘀功效，因藥味組成較少，在臨床上應(yīng)用并不廣泛。然而，我們?cè)趯?duì)其進(jìn)行中藥藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，卻意外地發(fā)現(xiàn)該方具有極強(qiáng)的增強(qiáng)機(jī)體耐缺氧能力的作用，為了進(jìn)一步確證其藥效并闡明作用機(jī)理，本試驗(yàn)觀察了該方對(duì)小鼠耐缺氧能力的影響及抗氧化作用。
1、材料與方法
1.1 材料
1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)ICR小鼠、雌雄各半，體重19~21g。由白求恩醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心及揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
1.1.2 藥品歸芪益母湯注射液：中藥當(dāng)歸、黃芪、益母草（購(gòu)自吉林大藥房），經(jīng)15倍去離子水浸泡，煎煮2次（30min/次），過(guò)濾，合并兩次濾液濃縮至密度為1.20~1.25，冷至30℃時(shí)緩慢加入乙醇，使醇含量達(dá)70%，充分?jǐn)嚢瑁o置過(guò)夜，濾取上清液，水浴回收乙醇至無(wú)醇味，用蒸留水調(diào)至1g/ml生藥，以40%氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.0，再3000r/min離心10min，取上清經(jīng)高壓滅菌消毒后備用。鈉石炭：上海五四化學(xué)試劑廠出品；硫代巴比妥酸（TBA）：Sigma公司出品（上海試劑二廠分裝），1，3，3-四乙氧基丙烷（TEP）：Sigma公司出品（上海試劑二廠分裝）；30%雙氧水溶液：上海焱晨實(shí)業(yè)有限公司出品；其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 常壓缺氧實(shí)驗(yàn)[1]
1.2.1.1急性實(shí)驗(yàn)將40只小鼠隨機(jī)分成藥物組和對(duì)照組，每組20只，兩組小鼠按每10g體重0.2ml劑量腹腔注射分別給予歸芪益母湯注射液和生理鹽水，于給藥后15min將每只小鼠置于盛有5g鈉石灰的250ml廣口瓶中，加蓋密封，記錄存活時(shí)間（從密封至停止呼吸的時(shí)間）。
1.2.1.2慢性實(shí)驗(yàn)將60只小鼠隨機(jī)分成試藥低劑量組、高劑量組及對(duì)照組，每組20只，給藥各組小鼠每天分別給予歸芪益母湯（2g/ml，制法同注射液）0.4ml/10g、0.2ml/10g體重灌胃，對(duì)照組給生理鹽水，連續(xù)5天，于末次給藥后30min將小鼠裝瓶，作同上實(shí)驗(yàn)。
1.2.2 減壓缺氧實(shí)驗(yàn)將20只小鼠隨機(jī)分成藥物組和對(duì)照組，每組10只按0.2ml/10g體重劑量腹腔注射，分別給予歸芪益母湯注射液和生理鹽水，于給藥后15min將10只小鼠同時(shí)置于盛有50g鈉石灰的2000ml打開(kāi)蓋的玻璃干燥器中，干燥器蓋的氣閥（關(guān)閉）用橡膠管通過(guò)玻璃平衡瓶（20000ml）與抽氣泵相連，抽氣達(dá)26.7kpa（200mmHg）時(shí)，停止抽氣，將干燥器蓋密封后，打開(kāi)氣閥，待干燥器與平衡瓶?jī)?nèi)氣壓平衡時(shí)關(guān)閉氣閥開(kāi)始試驗(yàn)，記錄各小鼠存活時(shí)間。
1.2.3化學(xué)物質(zhì)缺氧實(shí)驗(yàn)將30只小鼠隨機(jī)分成藥物組和對(duì)照組，每組15只，分別腹腔注射0.2ml/10g體重劑量的藥物和生理鹽水，15min后每鼠再腹腔注射10mg/kg體重劑量的氰化鉀，記錄存活時(shí)間（從氰化鉀注射完畢至停止呼吸的時(shí)間）。
1.2.4紅細(xì)胞和血紅蛋白的測(cè)定取32只小鼠斷尾失血造成人工血虛模型，于斷尾時(shí)和失血24小時(shí)后，每鼠眼底采血25μl置于事先放有血細(xì)胞稀釋液的指型管中，用AL818全自動(dòng)血液分析儀（瑞士）進(jìn)行紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白量測(cè)定。在證實(shí)失血模型成功后，將小鼠隨機(jī)分為2組，每組16只，分別給予試藥（2g/ml）和生理鹽水，按0.2ml/10g體重灌胃，連續(xù)7天。于末次給藥后30min，再次采血測(cè)定。
1.2.5急性缺氧再暴露后丙二醛（MDA）生成試驗(yàn)
取30只小鼠隨機(jī)分成藥物組、生理鹽水對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組10只，前二組分別于缺氧實(shí)驗(yàn)前6h和30min按0.2ml/10g體重腹腔注射藥液和生理鹽水，到時(shí)間后，將二組小鼠置于4000ml干燥器中，加蓋密封30min，再打開(kāi)密封蓋使小鼠暴露在空氣中2h；空白對(duì)照組小鼠不作任何處理，三組小鼠分別采用斷頭采血分離血清，按改良八木國(guó)夫法[2]測(cè)定MDA。
1.2.6 H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)
小鼠斷頭取血，用生理鹽水洗滌3次，制成5%紅細(xì)胞懸液。試管中分別加入80μl、40μl、20μl藥液及40μl生理鹽水，每組平行8管，再向每管加入5%紅細(xì)胞懸液1ml，然后加入H2O2使其終濃度為2mmol/L，于37℃溫育誘導(dǎo)溶血1h，離心取上清液，用生理鹽水40倍稀釋后，在756紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上測(cè)定波長(zhǎng)415nm處的OD值。
1.2.7超氧陰離子（O2-）生成試驗(yàn)（鄰苯三酚自氧化法測(cè)定）取50mmol/L Tris-HCL緩沖液（pH8.2）3ml于試管中，加入0.1ml藥液（分別含生藥60mg/ml和30mg/ml）或生理鹽水，混勻后加入0.3ml的7mmol/L鄰苯三酚，反應(yīng)4min后加入150μl的10mol/L HCl終止反應(yīng)，每組平行8管于420nm處測(cè)OD值。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（
）表示，采用ｔ檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異統(tǒng)計(jì)。2、結(jié)果
2.1常壓缺氧存活時(shí)間
從表1可見(jiàn)歸芪益母湯無(wú)論是急性腹腔注射或是慢性灌胃給藥都能提高小鼠耐缺氧能力，分別與對(duì)照組間存在顯著差異（P＜0.01），而灌胃給藥高、低劑量組間無(wú)顯著差異。
表1歸芪益母湯對(duì)小鼠常壓耐缺氧能力的影響（，n=20）
，n=20）組別 | 劑量 （ml/10g） | 給藥 途徑 | 存活時(shí)間 （min） | 增加 率（%） |
急性生理鹽水組 | 0.2 | ip | 37.21±7.76 |  |
急性歸芪益母湯組 | 0.2 | ip | 78.22±14.52* | 110.21 |
慢性生理鹽水組 | 0.2 | ig | 38.29±12.34 | |
慢性高劑量藥物組 | 0.4 | ig | 55.63±16.86△ | 45.29 |
慢性低劑量藥物組 | 0.2 | ig | 56.68±20.33△ | 48.03 |
*急性組內(nèi)P＜0.01，△慢性試驗(yàn)中藥物組與生理鹽水對(duì)照組間P＜0.01
2.2 減壓缺氧存活時(shí)間
從表2可見(jiàn)歸芪益母湯注射液腹腔注射能顯著地延長(zhǎng)小鼠在減壓缺氧的存活時(shí)間，且藥物組與生理鹽水對(duì)照組比P＜0.01異顯著（P＜0.01）。
表2歸芪益母湯對(duì)小鼠減壓耐缺氧能力的影響（，n=10）
，n=10）組別 | 劑量 （ml/10g） | 給藥 途徑 | 存活時(shí)間 （min） | 增加 率（%） |
生理鹽水對(duì)照組 | 0.2 | ip | 14.67±3.65 | |
歸芪益母湯組 | 0.2 | ip | 25.89±4.67* | 76.48 |
* P＜0.01
2.3 化學(xué)物質(zhì)所致缺氧存活時(shí)間從表3可見(jiàn)，歸芪益母湯腹腔注射具有拮抗氰化鉀抑制呼吸酶的作用，從而明顯地延長(zhǎng)氰化鉀所致缺氧小鼠的存活時(shí)間，與生理鹽水對(duì)照組比較具有極顯著性差異（P＜0.01）。
表3歸芪益母湯對(duì)小鼠耐氰化鉀所致缺氧能力影響（，n=15）
，n=15）組別 | 存活時(shí)間（min） | 增加率（%） |
生理鹽水組 | 2.52±0.45 | |
歸芪益母湯組 | 8.59±2.71* | 240.87 |
* P＜0.001
2.4 對(duì)血虛小鼠紅細(xì)胞及血紅蛋白的影響由表4可見(jiàn)，血虛模型小鼠的紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白與首日失血前的正常值間存在顯著差異（P＜0.01），說(shuō)明所建血虛模型成功。血虛小鼠給予歸芪益母湯1周后，其紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白的恢復(fù)率明顯高于生理鹽水對(duì)照組（P＜0.01），說(shuō)明歸芪益母湯具有促進(jìn)血虛動(dòng)物紅細(xì)胞和血紅蛋白增生的作用。
表4歸芪益母湯對(duì)小鼠紅細(xì)胞及血紅蛋白的影響（，n=16）
，n=16）組別 | 紅細(xì)胞數(shù) （1×1012/L） | 紅細(xì)胞恢復(fù)率（%） | 血紅蛋白（g/L） | H恢復(fù)率（%） |
正常組 | 8.12±0.76 | | 140.83±12.53 | |
血虛模型組 | 6.01±0.53* | | 114.46±11.22* | |
歸芪益母湯組 | 7.81±0.48△ | 96.18 | 137.83±13.22 | 97.87 |
生理鹽水組 | 7.04±0.38 | 86.69 | 125.01±11.15 | 88.77 |
*血虛模型組與正常組比較P＜0.001，△歸芪益母湯組與生理鹽水組比較P＜0.01
2.5 對(duì)小鼠急性缺氧再暴露后MDA生成的影響從表5可見(jiàn)，空白對(duì)照組與生理鹽水組相比，MDA的生成有顯著性差異（P＜0.01），說(shuō)明小鼠急性缺氧再暴露后，體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物的形成明顯增加。而歸芪益母湯組與生理鹽組相比，MDA的形成顯著減少，且有顯著性差異（P＜0.01），但與空白對(duì)照組相比則無(wú)明顯差異（P＞0.05）。說(shuō)明歸芪益母湯能夠抑制小鼠因急性缺氧再暴露誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化增強(qiáng)的作用。
表5對(duì)小鼠急性缺氧再暴露后MDA生成的影響（，n=10）
，n=10）組別 | MDA(nmol/ml) | 增生率（%） |
空白對(duì)照組 | 13.87±3.70 | |
生理鹽水組 | 29.57±1.76△ | 113.19 |
歸芪益母湯組 | 15.93±1.37*○ | 14.85 |
2.6 對(duì)H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞溶血的影響
從表6可見(jiàn)，歸芪益母湯對(duì)H2O2氧化紅細(xì)胞膜誘導(dǎo)的溶血有顯著的抑制作，且有明顯的劑量依賴性，IC50為32.1mg/ml。
表6歸芪益母湯對(duì)H2O2誘導(dǎo)小鼠紅細(xì)胞溶血的影響（）
）藥物劑量 | MDA(nMoL/ml) | 增生率（%） | |
生理鹽水組 | 0.936±0.030 | ||
歸 芪 益 母 湯 | 40mg/ml | 0.293±0.044* | 68.70 |
20mg/ml | 0.593±0.026* | 36.65 | |
10mg/ml | 0.706±0.048* | 24.59 | |
*各藥物組與生理鹽水組比較P＜0.01
2.7 對(duì)超氧陰離子（O2-）生成的影響從表7可見(jiàn)，歸芪益母湯在體外對(duì)超氧陰離子的生成具有顯著的抑制作用，并呈現(xiàn)明顯劑量效應(yīng)，60mg/ml劑量組與30mg/ml劑量組之間亦存在顯著性差異（P＜0.01）。
表7歸芪益母湯對(duì)O2-生成的影響（）
）藥物劑量 | OD值（420nm） | 抑制率（%） | |
生理鹽水組 | 0.231±0.005 | | |
歸 芪 益 母 湯 | 30mg/ml | 0.151±0.003* | 34.63 |
60mg/ml | 0.095±0.008*△ | 58.87 | |
* 歸芪益母湯組與生理鹽水組比較P＜0.01
△60mg/ml組與30mg/ml組比較P＜0.01
3、討論3.1 歸芪益母湯是以大補(bǔ)脾肺之氣的黃芪為主，以當(dāng)歸養(yǎng)血補(bǔ)血，益母草活血祛瘀，是臨床治療勞役過(guò)度所致的氣血俱虛及產(chǎn)后血虛、瘀滯腹痛等癥的常用方劑。本次實(shí)驗(yàn)研究表明，歸芪益母湯對(duì)小鼠的常壓缺氧、減壓缺氧、氰化鉀所致組織缺氧等都有顯著地延長(zhǎng)存活時(shí)間的功能，與對(duì)照組相比都具有顯著性差異。其中，效果是以腹腔注射給藥法最理想，如常壓注射組、氰化鉀缺氧實(shí)驗(yàn)中分別提高耐受率達(dá)110.21%和240.87%。有關(guān)黃芪、當(dāng)歸[3-6]具有提高小鼠耐氧能的報(bào)道較多，但提高能力僅在25%~45%之間。說(shuō)明歸芪益母在提高小鼠耐缺氧能力方面和組方的合理性方面有獨(dú)特之處。
3.2 正常動(dòng)物體在有氧代謝過(guò)程中，氧化還原反應(yīng)伴有超氧陰離子自由基（O2-）、羥自由基（OH? ）乃至H2O2等自由基的生成。體內(nèi)又存在酶及非酶類清除自由基的完整體系，能夠直接清除自由基及其毒性。然而當(dāng)動(dòng)物體缺血缺氧時(shí)能引起組織呼吸受阻，能量代謝障礙等一系列變化，當(dāng)豐富的血氧再供給時(shí)，可造成缺血、缺氧組織大量自由基的瞬時(shí)產(chǎn)生，從而遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)機(jī)體清除自由基的能力，致使產(chǎn)生多量自由基而引起組織損傷及病理改變[2-8]。自由基可直接破壞細(xì)胞膜的成分，引起脂質(zhì)過(guò)氧化瀑布效應(yīng)，損傷膜結(jié)構(gòu)及其功能。另一方面，可引發(fā)一系列自由基反應(yīng)，形成的產(chǎn)物直接破壞蛋白質(zhì)和DNA，使蛋白質(zhì)和DNA交聯(lián)而喪失活性功能，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9]。本文體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，歸芪益母湯對(duì)O2-的產(chǎn)生有顯著抑制作用，對(duì)H2O2氧化細(xì)胞膜所誘發(fā)的溶血亦具有明顯的抑制作用；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，歸芪益母湯對(duì)小鼠缺氧后再暴露所引起的過(guò)氧化脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生具有極顯著的抑制作用，這說(shuō)明歸芪益母湯在體內(nèi)能抑制自由基的產(chǎn)生，減少因自由基及其產(chǎn)物所引起的各種損傷，從而保證組織正常活力，這可能亦是其提高小鼠耐缺氧能力的分子機(jī)理之一，但作用的確切分子機(jī)理還需作進(jìn)一步的研究探討。