PXF與黃芩白術對LPS誘導流產小鼠的保胎作用 及子宮內IL-10含量的變化研究 鐘秀會，史萬玉，宮新城，翟向和，張鐵，李紹華，褚素敏 （河北農業大學動物科技學院，保定 071001） |
關鍵詞：細菌脂多糖；PXF； IL-10；中藥；流產 機體免疫系統能夠成功地排斥異體組織移植物、并有效地清除侵入體內的各種病原。那么，胚胎在發育過程中，由于帶有來自父體的基因，會表達父體抗原。這種帶有一半同種異體抗原的胎兒理應受到母體免疫系統的排斥。然而，事實上正常妊娠的母體對胎兒并不表現排斥反應。這不僅是由于胎盤屏障的保護作用，更重要的是，在母體胎兒界面產生的免疫調節因子有保護胎兒的作用［1］。 盡管如此，妊娠并不象人們所期望的那樣一帆風順。哺乳動物已著床的胚胎至發育到正常分娩期間，約有40～60%會發生胚胎丟失，其中2/3(約67%)發生在妊娠早期，這在人和家畜均如此［2］。生殖免疫學觀點認為，這些胚胎丟失或流產與妊娠母體Th1細胞因子反應增強有關[3]。Th1細胞因子反應以細胞免疫功能增強，產生腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-2（IL-2）、γ-干擾素（IFN-γ）等細胞因子為特征，對妊娠有負面影響［4］。IL-2，TNF-α，IFN-γ增多，均可導致孕鼠流產［5］。白細胞介素-10（IL-10）屬Th2細胞因子，有保護胎兒、促進胎盤生長等作用［4］。 試驗證明，細菌產生的內毒素細菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)靜脈注射可誘導多種品系的孕鼠流產［6］。并發現LPS誘導流產與子宮內產生TNF-α有關［5、6］。LPS誘導流產(或胚胎吸收)與子宮內IL—10含量有何關系?值得研究。 中藥黃芩白術配伍，被歷史上金元時期的名醫朱丹溪譽為“安胎圣藥”。許多安胎方劑中均伍用黃芩白術。其安胎效果已被千百年來的醫療實踐所證明。但從生殖免疫學角度分析，黃芩白術在母體子宮與胎兒界面發揮怎樣的調節作用?鮮見前人研究報道。 本試驗用LPS誘發母鼠流產，ELISA方法測定子宮勻漿Th2細胞因子IL~10的含量，從分子免疫學角度分析了LPS誘導流產的機理，以及TNF-α阻斷劑PXF和黃芩白術的保胎效果。? 1材料和方法? 1.1 試驗動物? 8周齡~10周齡未經產昆明小鼠，常規飼養，每日光照12h，自由采食和飲水。經適應環境1周后，陰道涂片法進行發情鑒定。發情母鼠與公鼠1：1合籠過夜，次日清晨檢出陰栓者，定為孕0d。 1.2藥物及試劑? LPS，美國Sigma公司產品(由大腸桿菌制備)。用pH7.4、0.01M的PBS稀釋成0.5μg/ml(PBS經細菌濾器過濾)，置4℃冰箱中備用。 黃芩白術湯，市售中藥飲片黃芩白術，按1：1混合，切碎，加自來水浸泡1h。水煎2次，合并濾汁，濃縮至每ml含生藥1g。? 小鼠IL-10 ELISA測試盒，美國Endogen公司產品。? Pentoxifylline(PXF)，美國Sigma公司產品，溶于過濾的PBS（5.75mg/ml）中。? 1.3動物分組及處理? 試驗分5組（每組動物數見表1）。A、B、C、D組母鼠于孕7d時尾靜脈注入LPS 0.1μg(0.2ml)，E組注入PBS 0.2ml。B組小鼠于孕5、6、7d各腹腔注射PXF，每鼠每天1.15mg。C組小鼠于孕5、6、7d各灌服黃芩白術湯1ml。D組小鼠各灌服PBS 1ml(見表1)。所有試驗鼠均于孕9d剖殺。 1.4胚胎吸收率(死亡率)和流產率計算? 發生吸收或死亡的胚胎體積變小，顏色紫黑，出血壞死，甚者溶化成血團塊。尸體解剖鏡下觀察模糊一片，沒有胎膜結構。正常胚胎個體較大，粉紅色。鏡下觀察胎膜及胎兒輪廊清晰，透光度好、無出血、瘀血現象。? 胚胎吸收率按下述方法計算［7］。即：? R/(V+R)×100%? R為被吸收的胚胎數，V為活的(Viable)胚胎數。? 流產率=發生流產的母鼠數/試驗組母鼠總數×100%? 1.5子宮IL-10的ELISA測定?孕鼠均于孕9d時頸椎脫臼致死。每鼠取左側子宮角的1/2，作為免疫組織化學染色用（結果另報）。取右側子宮角和左側子宮角剩余的1/2勻漿。剪除子宮系膜及脂肪，縱向切開子宮角，剝去胎兒。剪碎子宮角，加入含PMSF(蛋白酶抑制劑)0.75μg/ml的PBS(pH7.6)適量，冰水中勻漿，20000g 4℃離心15min，移取上清液分裝備用。IL-10含量的ELISA測定按試劑盒說明書操作。 各樣品中IL-10的含量以每mg蛋白中所含IL-10的pg數來表示。蛋白含量系用UV-754型紫外可見分光光度計(上海第三分析儀器廠)測定280nm、260nm的OD值，依下列公式計算而得： 蛋白濃度(mg/ml)=1.45×OD280nm—0.74×OD260nm? 1．6統計分析? 用t測驗計算各組間細胞因子含量的差異顯著性。胚胎吸收率和流產率用X2檢驗。? 2結果? 2.1LPS誘導孕鼠流產的效果? 試驗A組，5只孕鼠有1只死胎已全部排出(注射LPS第2d便看到由陰道口排出死胎)，其余4只母鼠子宮內胎兒已全部死亡，并開始溶化，呈紫黑色，不易分辨個數。胚胎吸收率100%。B組小鼠注入PXF，5只孕鼠無一流產。多數胚胎存活，僅有少量死胎。胚胎吸收率為15%。C組小鼠灌服中藥，再尾靜脈注射LPS，6只孕鼠有2只發生流產。其中1只母鼠子宮內已無胎兒。其它母鼠子宮內偶見瘀血的死胎。胚胎吸收率35%。與B組相比，差異不顯著。D組用PBS做對照，5只母鼠有4只流產。胚胎吸收率89%。E組于孕7d尾靜脈注射PBS，5只母鼠均未流產。詳見表1。 2.2IL-10的含量變化? 注射PBS的對照小鼠，子宮IL-10含量相對比較恒定，個體間差異不大。平均值為32.253±8.773pg/mg蛋白。靜注LPS誘導流產小鼠(A組)，IL-10含量降至很低，為10.959±5.324pg/mg，約為正常值的1/3。B組小鼠事先注入PXF，再注射LPS，IL-10含量接近正常水平。說明用PXF阻斷TNF-α的產生，能夠阻止LPS的作用。C組小鼠預先灌服中藥，IL-10含量水平與PXF處理組相接近。見表2。 ??表1 各處理組小鼠的胚胎吸收率及流產率 妊娠天數 組別中藥或PXFLPS 靜注流產率（%）胚胎吸收率（%） A（n=5）LPS (7)100(5/5)100(47/47) B (n=5)PXF(5,6,7)LPS (7)0(0/5) *15(11/72)a,b C (n=6)中藥(5,6,7)LPS(7)33(2/6)35(28/79)a,b D (n=5)PBS(5,6,7)LPS(7)80(4/5)89(59/66) E (n=5)PBS (7)0(0/5) *3(2/63)a 注：1胚胎吸收率比較：a;與A組相比P＜0.01；b;與D組比，P＜0.01. 其余組間差異不顯著。?2. 流產率比較?*與A組相比P＜0.05，其余組間差異不顯著。?表2LPS誘導流產小鼠子宮IL-10含量 組別12345X+SD A7.6386.9935.54818.91115.70310.959+5.324 B23.09126.94755.77534.37413.23730.685+14.277** C40.71421.08322.92123.83728.67827.447+7.093** D3.64911.80516.30916.3695.15810.664+5.383 E22.72029.96036.40547.09225.08932.253+8.773** 注：IL-10含量為每mg蛋白中的pg數。**，和A,D組比較, P<0.013討論? Gendron等研究發現，妊娠早期鼠胚對LPS非常敏感。LPS對早期孕鼠似乎有部位特異性， LPS處理的小鼠，其它組織不表現任何病變［8］。LPS誘導流產機制是通過巨噬細胞（Mφ）釋放TNF-α，TNF-α直接作用于胎盤血管，導致出血壞死。如TNF-α促使肉瘤組織出血壞死、萎縮消失便是通過這種類似機制［9］。在早產婦女的羊水中檢出了LPS和TNF-α［10］。用人工重組TNF—α處理大鼠導致胎盤壞死［11］。Tangri等將胎盤細胞和淋巴細胞混合培養，發現與正常胎盤細胞相比，即將流產小鼠的胎盤能刺激淋巴細胞產生更多的TNF-α［12］。這些研究資料都表明，TNF-α可導致流產。LPS誘導小鼠胚胎吸收，子宮勻漿中TNF-α含量升高[13]。 用PXF預先給小鼠腹腔注射，阻止了LPS誘導的胚胎吸收，Th2細胞因子IL-10上升(表2)。PXF是一種TNF-α合成抑制劑，能夠抑制預致敏的巨噬細胞中TNF-α mRNA的表達和TNF-α的合成[14]，降低LPS和TNF-α以及其它細胞因子對中性白細胞的活化作用［15］。Gendron等用PXF預先注射母鼠，再用LPS誘發流產，結果PXF阻止了子宮中TNF-α的升高(阻斷90%)和胚胎吸收的發生［8］。Chaouat等也獲得類似結果，并證明TNF-α和IFN-γ在誘導胎吸收方面有協同作用［16］。本試驗中PXF阻斷了LPS誘導流產的效果，說明LPS誘導流產與TNF-α有密切關系。? IL-10屬有益胚胎發育的細胞因子，在保護胎兒免受攻擊方面起著至關重要的作用［1］。妊娠期間，IL-10進行性地下調IFN-γ。在母體蛻膜組織和/或胎盤中可合成IL-10［1,12］。Chaouat等的試驗說明了Th2細胞因子IL—10對維持正常妊娠的保護作用：流產小鼠胎盤中IL-10含量低，IFN-γ、TNF-α含量高；非特異性免疫提高了小鼠胎盤IL-10含量和胚胎成活率；人工重組IL-10注射使母鼠胚胎吸收率顯著降低，抗IL-10抗體提高了胚胎吸收率；給小鼠注入羊滋養層蛋白oTP，減少了胚胎吸收率，同時小鼠胎盤中IL-10水平上升［16］。Rivera等最近研究發現，低劑量LPS注射誘導鼠發生胚胎吸收，而注射外源性IL-10則顯著降低了注射LPS所引起的胚胎吸收率［17］。在人類，用男性白細胞免疫復發性流產婦女，9人中有7人受孕，并正常分娩。測得IL-2和IFN-γ產生量降低，IL-10分泌量增多，同時NK、LAK細胞毒性明顯下降［18］。婦女正常妊娠IL-10水平上升，IL-2和IFN-γ下降。病理妊娠時IL-10水平低下，而IL-2、IFN-γ水平較高［19］。這些研究資料都說明IL-10與正常妊娠的正相關關系。IL-10抑制Th1細胞和NK細胞產生TNF、IFN-γ，IL-1等［12］，可能是維持Th2反應和母體妊娠正常的重要途徑。曾有報道認為，LPS誘導流產與IL-1有一定關系。用LPS注射使100%小鼠發生流產，事先注入IL-1受體抗體，則使胎兒死亡率由100%降至30%［20］。本試驗中，LPS誘導小鼠胚胎吸收，子宮IL-10水平低于正常，用PXF或中藥保胎，則使IL-10水平回升。說明了IL-10在維持正常妊娠中有重要作用。本研究直接測定了LPS誘導流產小鼠子宮胎盤組織中IL-10的含量，這一點未見前人報道。? 黃芩白術的安胎作用似乎適合于妊娠早期。《本草疏證》這樣論述黃芩白術的安胎作用，“初妊之時，胎元未旺，吸血不多，則下焦血旺，氣反上逆，是為惡阻。惡阻則中焦之氣不變赤而為水，是白術在所必需矣。血盛能致氣盛，氣盛能生火，黃芩泄氣分之火而不傷血者也。”此處“初妊之時”似指妊娠早期，而“血旺”“血盛”以致于“氣盛生火”，可否理解成胚胎著床期的炎性反應階段?黃芩白術配伍，寒溫并用，補瀉兼顧，似能調整妊娠初期的炎性反應。現代研究認為，黃芩傷害肥大細胞的酶激活系統，抑制過敏性介質的釋放，抑制炎性反應和毛細血管通透性［21］。我們在前期研究中發現，子宮肥大細胞數量增多與胚胎丟失有密切關系。本試驗結果觀察到，流產的胎兒有出血瘀血現象，說明胎盤組織毛細血管通透性增大。使用黃芩白術預防組(C組)則胎兒生長正常，顏色粉紅，沒有瘀血現象。白術作為健脾補氣藥，可增加抗體生成，還可用于治療風濕癥。現代醫學觀點認為，類風濕性關節炎屬于細胞介導的自身免疫病。妊娠時母體免疫系統以Th2反應(抗體介導的免疫)為主，細胞免疫功能受抑制，因而類風濕性關節炎癥狀減輕［4］。白術能夠治療風濕癥說明可能對細胞介導的免疫有某種抑制作用。本試驗結果表明，PXF和黃芩白術能夠阻抑LPS誘發的流產，使子宮內IL-10水平上升，從而有利于正常妊娠。? |
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