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畜牧人

標(biāo)題: 槐花水煎液抗SLT-Ⅱe致RIMMVECs損傷的保護(hù)效果研究 [打印本頁]

作者: 貔貅 時(shí)間: 2007-11-2 14:19
標(biāo)題: 槐花水煎液抗SLT-Ⅱe致RIMMVECs損傷的保護(hù)效果研究
　志賀樣毒素Ⅱ型變異體(Shiga like toxin，SLT-Ⅱe）主要由出血性大腸桿菌(EHEC)產(chǎn)生，為豬水腫病的主要毒力因子。目前的研究表明，微血管內(nèi)皮細(xì)胞上帶有的SLT-Ⅱe特異性受體[2]，且SLT-Ⅱe能抑制大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（rat intestinal mucosa microvascular endothelial cells, RIMMVECs）的增殖，并可對(duì)其造成一定損傷。本試驗(yàn)通過對(duì)不同濃度槐花水煎液單獨(dú)及與SLT-Ⅱe共同作用后，RIMMVECs的增殖率及NO分泌量的觀察，探討中藥抗SLT-Ⅱe的作用機(jī)理，為防治豬水腫病的中藥篩選和中藥抗細(xì)菌毒素的機(jī)理研究提供理論依據(jù)。　　1．材料與方法
　　1.1材料
　　DMEM（Gibico）；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（Gibico）；SLT-Ⅱe液（揚(yáng)州大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)）；槐花（購自北京同仁堂藥店）；大鼠腸粘膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（北京農(nóng)學(xué)院中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供）；NO試劑盒（深圳晶美）；噻唑藍(lán)（MTT，Amresco）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma）；所有試劑均經(jīng)過0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌。
　　1.2儀器
　　培養(yǎng)板（Costar）；96孔酶標(biāo)板（Costar）；CO2培養(yǎng)箱（Sanyo)；熒光倒置數(shù)碼顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀（BioRad）；分光光度計(jì)(Unico)
　　1.3方法
　　1.3.1細(xì)胞傳代接種：選取第10代的細(xì)胞進(jìn)行消化，所得細(xì)胞液用完全培養(yǎng)基稀釋，將細(xì)胞密度調(diào)整到5×104 ?個(gè)/mL，充分混勻后接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)孔接種200 μl，然后置入CO2 培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)48 h。
　　1.3.2 藥液處理：精確稱量干燥槐花100 g ，常法煎煮兩次。經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成1︰1濃度的藥液。4℃保存。使用前，用維持培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。
　　1.3.3 槐花對(duì)RIMMVECs的效用試驗(yàn)：細(xì)胞傳代至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待細(xì)胞生長到80%鋪滿培養(yǎng)孔底壁，選取5組共25孔的細(xì)胞用于試驗(yàn)。吸棄原培養(yǎng)基，在各組中分別加入含100.0、10.0、1.0、0.1、0 mg/mL槐花的維持培養(yǎng)基200μl，記為槐花1組、槐花2組、槐花3組、槐花4組和空白組。37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置入CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。吸出全部細(xì)胞培養(yǎng)液，3000 rpm離心10 min，將上清液移入新的小離心管中，封口，-20 ℃冰箱保存。依試劑盒說明書完成細(xì)胞上清液中NO的測定。在吸凈細(xì)胞上清夜的各孔細(xì)胞中加入5 mg/mL的MTT 30 ml及150 ml的DMEM維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，輕輕吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入150 μl DMSO，37 ℃孵育30 min 以上，使細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶充分溶解，于酶標(biāo)儀570 nm波長測定細(xì)胞增殖率（OD值）。
　　1.3.4 槐花抗SLT-Ⅱe對(duì)RIMMVECs損傷的作用試驗(yàn)：細(xì)胞處理同前，選取5組共25孔細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，分別記為空白組、毒素組、毒素+槐花1組、毒素+槐花2組、毒素+槐花3組。各組加入含不同成分的維持培養(yǎng)基200 μl，各組所含毒素及槐花濃度如下：空白組：維持培養(yǎng)基；毒素組：維持培養(yǎng)基中SLT-Ⅱe 含量為10.0 μg/mL；毒素+槐花1組：維持培養(yǎng)基中含SLT-Ⅱe 10.0 μg/mL，槐花5.0 mg/mL；毒素+槐花2組：維持培養(yǎng)基中含SLT-Ⅱe 10.0 μg/mL，槐花0.5mg/mL；毒素+槐花3組：維持培養(yǎng)基中含SLT-Ⅱe 10.0 μg/mL，槐花0.05 mg/mL。增殖率及 NO分泌量的測定同上。
　　1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
　　試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，試驗(yàn)組間差異采用t檢驗(yàn)法
　　2．結(jié)果
　　2.1 槐花對(duì)RIMMVECs的增殖效果試驗(yàn)
　　由表1可以看出，不同濃度槐花水煎液作用于RIMMVECs 24 h后，槐花1組（100 mg/ mL）、槐花2組（10 mg/ mL）、槐花3組（1 mg/ mL）OD值均小于空白組，且差異極顯著，對(duì)RIMVECs增殖呈抑制作用，三組之間差異亦極顯著。槐花4組（0.1 mg/ mL）OD值大于空白對(duì)照組，且差異極顯著，表現(xiàn)出對(duì)RIMVECs的保護(hù)、增殖作用，增殖率達(dá)14.67%。

　　表1 槐花對(duì)RIMMVECs的增殖效果試驗(yàn)

組別	X ± S	增殖率%	統(tǒng)計(jì)結(jié)果
空白組	1.60±0.07	—	B? b
槐花1組	0.04±0.02	-97.81	E? e
槐花2組	0.70±0.08	-55.96	D? d
槐花3組	1.24±0.07	-22.49	B? b
槐花4組	1.83±0.08	14.67	A? a

　　注：各組間不含有相同大寫字母表明差異極顯著p＜0.01，各組間不含有相同小寫字母表明差異顯著p＜0.05
　　2.2 槐花對(duì)RIMMVECs分泌NO的影響
由表2可以看出，槐花1組與槐花2組對(duì)RIMVECs作用24h后，所測NO分泌量與空白對(duì)照組比較，差異極顯著，與槐花其他兩組比較差異極顯著，二者之間差異亦極顯著。槐花3組NO分泌量與空白對(duì)照組比較，無明顯差異。槐花4組NO分泌量分泌與空白對(duì)照組比較，差異顯著（P＜0.05）。但槐花3、4組間無明顯差異。

表2? 槐花水煎液對(duì)RIMMVECs分泌NO的影響（X±S μmol/L，n = 5）組

組別	X ± S	統(tǒng)計(jì)結(jié)果
空白組	10.02±1.10	C?? d
槐花1組	66.01±2.32	A ??a
槐花2組	17.21±1.40	B?? b
槐花3組	12.02±1.80	C ?cd
槐花4組	12.50±1.64	C ??c

　　注:? 各組間不含有相同大寫字母表明差異極顯著P<0.01，各組間不含有相同小寫字母表明差異顯著P<0.05
　　2.3 槐花水煎液與SLT-Ⅱe共同作用對(duì)RIMMVECs增殖率的影響
　　由表3可以看出，當(dāng)SLT-Ⅱe濃度為10 μg/mL時(shí)，毒素作用細(xì)胞24 h后，MTT法測細(xì)胞增殖率OD值低于空白對(duì)照組，二者相比較，差異極顯著，其對(duì)細(xì)胞增殖抑制率達(dá)29.07%。對(duì)于槐花組，毒素+槐花1組OD值與空白對(duì)照組比較差異顯著，與毒素組比較差異不顯著。毒素+槐花2組與空白對(duì)照組比較差異不顯著，與毒素組比較差異顯著。毒素+槐花3組與空白對(duì)照組比較，差異顯著，與毒素組比較差異極顯著。槐花3個(gè)組OD值則隨著槐花濃度增加呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢。槐花三個(gè)組之間比較差異均極顯著。其中只有毒素+槐花2組與槐花三個(gè)組比較無明顯差異，其他兩組均差異極顯著。

表3 槐花水煎液與SLT-Ⅱe共同作用對(duì)RIMMVECs增殖率的影響

組別	X ± S	增殖率%	統(tǒng)計(jì)結(jié)果
空白組	2.40±0.10	0	A? ?a
毒素組	1.70±0.11	-29.07	C?? c
毒素+槐花1組	1.72±0.09	-28.39	C?? c
毒素+槐花2組	2.30±0.07	-4.20	A?? a
毒素+槐花3組	2.00±0.14	-16.60	B?? b

　　注:? 各組間不含有相同大寫字母表明差異極顯著P<0.01，各組間不含有相同小寫字母表明差異顯著P<0.05
　　2.3 槐花水煎液與SLT-Ⅱe共同作用對(duì)RIMMVECs分泌NO的影響
　　由表4和圖4可以看出，當(dāng)SLT-Ⅱe濃度為10 μg/mL時(shí)，毒素作用RIMMVECs 24 h后，細(xì)胞上清液中NO的分泌量與空白對(duì)照組比較增加明顯，且差異極顯著。對(duì)于槐花組，毒素+槐花1組、毒素+槐花2組與空白組比較差異極顯著，而與毒素組比較無顯著差異。毒素+槐花3組與空白組比較差異不顯著，但與毒素組比較差異極顯著。槐花組相應(yīng)的NO分泌量隨槐花濃度的降低而逐漸降低，三個(gè)組之間，毒素+槐花1組與毒素+槐花2組比較無顯著差異，與毒素+槐花3組比較差異顯著，毒素+槐花2組與毒素+槐花3組間比較差異顯著。

表4 槐花水煎液與SLT-Ⅱe共同作用對(duì)RIMMVECs分泌NO的影響

組別	X ± S	統(tǒng)計(jì)結(jié)果
空白組	14.20±2.31	C ???d
毒素組	24.32±4.16	A ???a
毒素+槐花1組	22.95±1.73	A ???ab
毒素+槐花2組	20.57±1.77	AB ?bc
毒素+槐花3組	17.95±2.19	BC ??d

　　3．分析與討論
　　傳統(tǒng)中(獸)醫(yī)的觀點(diǎn)認(rèn)為，豬水腫病的病因內(nèi)為高蛋白飼料完谷不化，郁積為熱毒；外來六淫之邪夾攻，濕毒熱邪無以發(fā)泄所致[2]。槐花藥性微寒、味苦、歸肝、大腸經(jīng)。具有涼血、止血的功效,用于便血、痔血、血痢、崩漏等 [3]。通過本試驗(yàn)中槐花對(duì)RIMMVECs的效用試驗(yàn)的結(jié)果可以看出，槐花水煎液對(duì)RIMMVECs具有較強(qiáng)的毒性作用，在24 h內(nèi)，1.0 mg/mL以上的槐花劑量組均可以明顯抑制RIMMVECs的增殖，直到濃度為0.1 mg/mL才表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞的增殖作用。而槐花各組對(duì)RIMMVECs分泌NO均高于空白組，但由于槐花水煎液本身具有一定的色澤影響，故排除槐花1組、槐花2組。而從槐花3組、槐花4組的結(jié)果仍略高于空白對(duì)照組，結(jié)合槐花組對(duì)細(xì)胞增殖率的試驗(yàn)結(jié)果，可以推測槐花對(duì)細(xì)胞NO的分泌呈微上調(diào)的趨勢。而從槐花水煎液與SLT-Ⅱe共同作用RIMMVECs后細(xì)胞增殖率的結(jié)果可以看出，在濃度為0.5 mg/mL和0.05 mg/mL時(shí)，槐花水煎液明顯的改善了因SLT-Ⅱe作用而導(dǎo)致的細(xì)胞增殖抑制，表明槐花水煎液可以起到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用，其中0.5 mg/mL濃度組效果更好。而5.0mg/mL濃度組的細(xì)胞增殖率較低則很可能是由于槐花在該濃度下仍具有細(xì)胞毒性所致。而從NO分泌的角度來看，毒素+槐花3組表現(xiàn)出明顯的抑制SLT-Ⅱe作用后細(xì)胞分泌NO增加的作用。槐花對(duì)NO分泌的調(diào)控與細(xì)胞增殖結(jié)果并不完全一致，其對(duì)抗SLT-Ⅱe、保護(hù)RIMMVECs的作用機(jī)理尚有待進(jìn)一步研究。

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