鐘秀會，史萬玉，宮新城，翟向和，張鐵，馬愛團，褚素敏 （河北農業大學動物科技學院，保定071001） | |
摘要：本試驗用細菌脂多糖（LPS）尾靜脈注射（每鼠0.1μg），誘導昆明小鼠流產，ELISA（酶聯免疫）方法測定子宮勻漿中IL-10（白細胞介素-10）的含量。發現LPS誘導流產小鼠子宮內IL-10含量降低。PXF或黃芩白術顯著抑制LPS的作用，使母鼠胚胎吸收率降低，子宮中IL-10含量回升。試驗結果表明，PXF或黃芩白術的保胎作用與上調子宮胎兒界面Th2細胞因子IL-10的含量有關。 關鍵詞：細菌脂多糖；PXF； IL-10；中藥；流產 中圖分類號：S853.7 文獻標示碼：A文章編號：0366-6964（2005）0 （本文已經被畜牧獸醫學報錄用，2005年5期發表） 機體免疫系統能夠成功地排斥異體組織移植物、并有效地清除侵入體內的各種病原。那么，胚胎在發育過程中，由于帶有來自父體的基因，會表達父體抗原。這種帶有一半同種異體抗原的胎兒理應受到母體免疫系統的排斥。然而，事實上正常妊娠的母體對胎兒并不表現排斥反應。這不僅是由于胎盤屏障的保護作用，更重要的是，在母體胎兒界面產生的免疫調節因子有保護胎兒的作用［1］。 盡管如此，妊娠并不象人們所期望的那樣一帆風順。哺乳動物已著床的胚胎至發育到正常分娩期間，約有40～60%會發生胚胎丟失，其中2/3(約67%)發生在妊娠早期，這在人和家畜均如此［2］。生殖免疫學觀點認為，這些胚胎丟失或流產與妊娠母體Th1細胞因子反應增強有關[3]。Th1細胞因子反應以細胞免疫功能增強，產生腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-2（IL-2）、γ-干擾素（IFN-γ）等細胞因子為特征，對妊娠有負面影響［4］。IL-2，TNF-α，IFN-γ增多，均可導致孕鼠流產［5］。白細胞介素-10（IL-10）屬Th2細胞因子，有保護胎兒、促進胎盤生長等作用［4］。 試驗證明，細菌產生的內毒素細菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)靜脈注射可誘導多種品系的孕鼠流產［6］。并發現LPS誘導流產與子宮內產生TNF-α有關［5、6］。LPS誘導流產(或胚胎吸收)與子宮內IL—10含量有何關系?值得研究。 中藥黃芩白術配伍，被歷史上金元時期的名醫朱丹溪譽為“安胎圣藥”。許多安胎方劑中均伍用黃芩白術。其安胎效果已被千百年來的醫療實踐所證明。但從生殖免疫學角度分析，黃芩白術在母體子宮與胎兒界面發揮怎樣的調節作用鮮見前人研究報道。 本試驗用LPS誘發母鼠流產，ELISA方法測定子宮勻漿Th2細胞因子IL~10的含量，從分子免疫學角度分析了LPS誘導流產的機理，以及TNF-α阻斷劑PXF和黃芩白術的保胎效果。? 1材料和方法? 1.1 試驗動物? 8周齡~10周齡未經產昆明小鼠，常規飼養，每日光照12h，自由采食和飲水。經適應環境1周后，陰道涂片法進行發情鑒定。發情母鼠與公鼠1：1合籠過夜，次日清晨檢出陰栓者，定為孕0d。 1.2藥物及試劑? LPS，美國Sigma公司產品(由大腸桿菌制備)。用pH7.4、0.01M的PBS稀釋成0.5μg/ml(PBS經細菌濾器過濾)，置4℃冰箱中備用。 黃芩白術湯，市售中藥飲片黃芩白術，按1：1混合，切碎，加自來水浸泡1h。水煎2次，合并濾汁，濃縮至每ml含生藥1g。? 小鼠IL-10 ELISA測試盒，美國Endogen公司產品。? Pentoxifylline(PXF)，美國Sigma公司產品，溶于過濾的PBS（5.75mg/ml）中。? 1.3動物分組及處理? 試驗分5組（每組動物數見表1）。A、B、C、D組母鼠于孕7d時尾靜脈注入LPS 0.1μg(0.2ml)，E組注入PBS 0.2ml。B組小鼠于孕5、6、7d各腹腔注射PXF，每鼠每天1.15mg。C組小鼠于孕5、6、7d各灌服黃芩白術湯1ml。D組小鼠各灌服PBS 1ml(見表1)。所有試驗鼠均于孕9d剖殺。 1.4胚胎吸收率(死亡率)和流產率計算? 發生吸收或死亡的胚胎體積變小，顏色紫黑，出血壞死，甚者溶化成血團塊。尸體解剖鏡下觀察模糊一片，沒有胎膜結構。正常胚胎個體較大，粉紅色。鏡下觀察胎膜及胎兒輪廊清晰，透光度好、無出血、瘀血現象。? 胚胎吸收率按下述方法計算［7］。即：R/(V+R)×100%?R為被吸收的胚胎數，V為活的(Viable)胚胎數。? 流產率=發生流產的母鼠數/試驗組母鼠總數×100%? 1.5子宮IL-10的ELISA測定 孕鼠均于孕9d時頸椎脫臼致死。每鼠取左側子宮角的1/2，作為免疫組織化學染色用（結果另報）。取右側子宮角和左側子宮角剩余的1/2勻漿。剪除子宮系膜及脂肪，縱向切開子宮角，剝去胎兒。剪碎子宮角，加入含PMSF(蛋白酶抑制劑)0.75μg/ml的PBS(pH7.6)適量，冰水中勻漿，20000g4℃離心15min，移取上清液分裝備用。IL-10含量的ELISA測定按試劑盒說明書操作。 各樣品中IL-10的含量以每mg蛋白中所含IL-10的pg數來表示。蛋白含量系用UV-754型紫外可見分光光度計(上海第三分析儀器廠)測定280nm、260nm的OD值，依下列公式計算而得： 蛋白濃度(mg/ml)=1.45×OD280nm—0.74×OD260nm? 1．6統計分析? 用t測驗計算各組間細胞因子含量的差異顯著性。胚胎吸收率和流產率用X2檢驗。? 2結果? 2.1LPS誘導孕鼠流產的效果? 試驗A組，5只孕鼠有1只死胎已全部排出(注射LPS第2d便看到由陰道口排出死胎)，其余4只母鼠子宮內胎兒已全部死亡，并開始溶化，呈紫黑色，不易分辨個數。胚胎吸收率100%。B組小鼠注入PXF，5只孕鼠無一流產。多數胚胎存活，僅有少量死胎。胚胎吸收率為15%。C組小鼠灌服中藥，再尾靜脈注射LPS，6只孕鼠有2只發生流產。其中1只母鼠子宮內已無胎兒。其它母鼠子宮內偶見瘀血的死胎。胚胎吸收率35%。與B組相比，差異不顯著。D組用PBS做對照，5只母鼠有4只流產。胚胎吸收率89%。E組于孕7d尾靜脈注射PBS，5只母鼠均未流產。詳見表1。 2.2IL-10的含量變化? 注射PBS的對照小鼠，子宮IL-10含量相對比較恒定，個體間差異不大。平均值為32.253±8.773pg/mg蛋白。靜注LPS誘導流產小鼠(A組)，IL-10含量降至很低，為10.959±5.324pg/mg，約為正常值的1/3。B組小鼠事先注入PXF，再注射LPS，IL-10含量接近正常水平。說明用PXF阻斷TNF-α的產生，能夠阻止LPS的作用。C組小鼠預先灌服中藥，IL-10含量水平與PXF處理組相接近。見表2。 （圖表略） 3討論? Gendron等研究發現，妊娠早期鼠胚對LPS非常敏感。LPS對早期孕鼠似乎有部位特異性， LPS處理的小鼠，其它組織不表現任何病變［8］。LPS誘導流產機制是通過巨噬細胞（Mφ）釋放TNF-α，TNF-α直接作用于胎盤血管，導致出血壞死。如TNF-α促使肉瘤組織出血壞死、萎縮消失便是通過這種類似機制［9］。在早產婦女的羊水中檢出了LPS和TNF-α［10］。用人工重組TNF—α處理大鼠導致胎盤壞死［11］。Tangri等將胎盤細胞和淋巴細胞混合培養，發現與正常胎盤細胞相比，即將流產小鼠的胎盤能刺激淋巴細胞產生更多的TNF-α［12］。這些研究資料都表明，TNF-α可導致流產。LPS誘導小鼠胚胎吸收，子宮勻漿中TNF-α含量升高[13]。 用PXF預先給小鼠腹腔注射，阻止了LPS誘導的胚胎吸收，Th2細胞因子IL-10上升(表2)。PXF是一種TNF-α合成抑制劑，能夠抑制預致敏的巨噬細胞中TNF-α mRNA的表達和TNF-α的合成[14]，降低LPS和TNF-α以及其它細胞因子對中性白細胞的活化作用［15］。Gendron等用PXF預先注射母鼠，再用LPS誘發流產，結果PXF阻止了子宮中TNF-α的升高(阻斷90%)和胚胎吸收的發生［8］。Chaouat等也獲得類似結果，并證明TNF-α和IFN-γ在誘導胎吸收方面有協同作用［16］。本試驗中PXF阻斷了LPS誘導流產的效果，說明LPS誘導流產與TNF-α有密切關系。? IL-10屬有益胚胎發育的細胞因子，在保護胎兒免受攻擊方面起著至關重要的作用［1］。妊娠期間，IL-10進行性地下調IFN-γ。在母體蛻膜組織和/或胎盤中可合成IL-10［1,12］。Chaouat等的試驗說明了Th2細胞因子IL—10對維持正常妊娠的保護作用：流產小鼠胎盤中IL-10含量低，IFN-γ、TNF-α含量高；非特異性免疫提高了小鼠胎盤IL-10含量和胚胎成活率；人工重組IL-10注射使母鼠胚胎吸收率顯著降低，抗IL-10抗體提高了胚胎吸收率；給小鼠注入羊滋養層蛋白oTP，減少了胚胎吸收率，同時小鼠胎盤中IL-10水平上升［16］。Rivera等最近研究發現，低劑量LPS注射誘導鼠發生胚胎吸收，而注射外源性IL-10則顯著降低了注射LPS所引起的胚胎吸收率［17］。在人類，用男性白細胞免疫復發性流產婦女，9人中有7人受孕，并正常分娩。測得IL-2和IFN-γ產生量降低，IL-10分泌量增多，同時NK、LAK細胞毒性明顯下降［18］。婦女正常妊娠IL-10水平上升，IL-2和IFN-γ下降。病理妊娠時IL-10水平低下，而IL-2、IFN-γ水平較高［19］。這些研究資料都說明IL-10與正常妊娠的正相關關系。IL-10抑制Th1細胞和NK細胞產生TNF、IFN-γ，IL-1等［12］，可能是維持Th2反應和母體妊娠正常的重要途徑。曾有報道認為，LPS誘導流產與IL-1有一定關系。用LPS注射使100%小鼠發生流產，事先注入IL-1受體抗體，則使胎兒死亡率由100%降至30%［20］。本試驗中，LPS誘導小鼠胚胎吸收，子宮IL-10水平低于正常，用PXF或中藥保胎，則使IL-10水平回升。說明了IL-10在維持正常妊娠中有重要作用。本研究直接測定了LPS誘導流產小鼠子宮胎盤組織中IL-10的含量，這一點未見前人報道。? 黃芩白術的安胎作用似乎適合于妊娠早期。《本草疏證》這樣論述黃芩白術的安胎作用，“初妊之時，胎元未旺，吸血不多，則下焦血旺，氣反上逆，是為惡阻。惡阻則中焦之氣不變赤而為水，是白術在所必需矣。血盛能致氣盛，氣盛能生火，黃芩泄氣分之火而不傷血者也。”此處“初妊之時”似指妊娠早期，而“血旺”“血盛”以致于“氣盛生火”，可否理解成胚胎著床期的炎性反應階段?黃芩白術配伍，寒溫并用，補瀉兼顧，似能調整妊娠初期的炎性反應。現代研究認為，黃芩傷害肥大細胞的酶激活系統，抑制過敏性介質的釋放，抑制炎性反應和毛細血管通透性［21］。我們在前期研究中發現，子宮肥大細胞數量增多與胚胎丟失有密切關系。本試驗結果觀察到，流產的胎兒有出血瘀血現象，說明胎盤組織毛細血管通透性增大。使用黃芩白術預防組(C組)則胎兒生長正常，顏色粉紅，沒有瘀血現象。白術作為健脾補氣藥，可增加抗體生成，還可用于治療風濕癥。現代醫學觀點認為，類風濕性關節炎屬于細胞介導的自身免疫病。妊娠時母體免疫系統以Th2反應(抗體介導的免疫)為主，細胞免疫功能受抑制，因而類風濕性關節炎癥狀減輕［4］。白術能夠治療風濕癥說明可能對細胞介導的免疫有某種抑制作用。本試驗結果表明，PXF和黃芩白術能夠阻抑LPS誘發的流產，使子宮內IL-10水平上升，從而有利于正常妊娠。? |
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