| 白頭翁不同提取物及復方的體外抑菌試驗研究 時維靜 路振香 李立順 （安徽科技學院 安徽 鳳陽 233100） | ||
摘要：目的：探討白頭翁湯的體外抑菌作用，旨在為臨床用藥提供依據。方法：用蒸餾法從白頭翁根中得到原白頭翁素，用乙醇提取純化法得到白頭翁總皂苷，用煎煮法得到白頭翁浸膏，分提白頭翁湯各組成藥物，合煎白頭翁湯。將它們配制成1:1、1:2、1:4梯度濃度的溶液。用K-B紙片擴散法對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、副傷寒桿菌進行抑菌試驗。結果：白頭翁不同提取物、白頭翁湯的組成藥物對以上細菌均有抑菌作用。結論：白頭翁的原白頭翁素抑菌效果最好。復方抑菌作用不是各組成藥物作用的相加。 白頭翁湯源自《傷寒論》，由白頭翁15g、黃柏12g、黃連6g、秦皮12g組成[1]。具有清熱解毒、涼血止痢的功效，為中醫臨床治療熱痢下重的主要方藥。 白頭翁湯的君藥白頭翁為毛茛科多年生白頭翁屬植物白頭翁的根莖。白頭翁的化學成分主要為皂苷和內酯等成分。其中包括白頭翁皂苷A、B、C、D (pulchinenoside A、B、C、D),皂苷1(saponin1)、皂苷2(saponin 2),白樺酯酸(betulinic acid),白樺脂酸-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(betulinic acid 3-O-α-L-arabinopyranoside),3-氧代白樺脂酸(3-oxobetulinic acid),胡蘿卜苷(daucosterol),原白頭翁素(protoanemonin),白頭翁素(anemonin),白頭翁靈(okinalin,C32H64O2),白頭翁英(okinalin,C4H6O2)等[2]。白頭翁藥材的多成分決定了其治療作用的多靶點與多層次。本文將白頭翁根的三種不同的提取物：原白頭翁素、白頭翁總皂苷、白頭翁浸膏，進行體外抑菌試驗，旨在揭示白頭翁湯中君藥的抗菌作用的有效部位。為臨床用藥提供依據，以便更針對性的選擇提取方法。 白頭翁湯中的黃連、黃柏含巴馬丁(Palmatine)小檗堿(berbenine) 藥根堿(jatrorrhizine)，秦皮含七葉內酯(esculetin)秦皮甙(fraxin)七葉甙(escnlin)等。為白頭翁湯發揮藥效的主要物質基礎。由于湯劑化學成分的復雜性和不穩定性，對復方藥效的研究也是多方面的。本項試驗采用分提白頭翁湯各組成藥物與合煎白頭翁湯，制成不同梯度的藥液進行體外抑菌試驗，旨在為臨床應用白頭翁湯提供理論依據。 1材料與方法 1.1材料 1.1.1藥材與試劑 藥材白頭翁、黃連、黃柏、秦皮均購自亳州滬樵中藥飲片廠。品種經安徽技術師范學院中藥實驗室鑒定，白頭翁為毛莨科植物白頭翁Pulsatilla chinensis(Bunge)Regel.的根;黃連為毛莨科植物黃連Coptis chinensis Franch.的根莖飲片;黃柏為蕓香科植物黃蘗Phellodeneron amurense Rupr.去栓皮的樹皮;秦皮為木犀科植物白蠟樹Fraxinus chinensis Roxb.的枝皮。營養瓊脂(中國醫藥集團上海化學試劑公司)。所用試劑均為分析純。 1.1.2菌株金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、副傷寒桿菌均由安徽技術師范學院微生物實驗室提供。采用普通營養瓊脂培養基。 1.1.3 儀器 循環真空水泵，SHZ-3型，上海華光儀器表廠；真空干燥箱，ZK-82B型，上海市實驗儀器總廠；電子控溫電熱器，蚌埠市恒信實驗儀器技術研究所；高壓蒸汽滅菌鍋，上海醫用核子儀器廠；電子分析天平，FA1004型，上海精科天平儀器廠；粉碎機，JFSD-100型，嘉定糧油檢測儀器廠；游標卡尺，規格（0～150）㎜×0.02㎜,安徽桐城量具廠生產。索氏提取器、回流冷凝裝置、蒸餾裝置等，滁州千秋玻璃廠。 1.2方法 1.2.1白頭翁三種提取物的提取方法 原白頭翁素的提取 將100克白頭翁生藥根，粉碎成粗粉,加水500ml于水浴上蒸餾，至無濃的刺激味.餾液放冷，加入約5%的食鹽，用100ml氯仿分次提取，合并提取液。在水浴上回收氯仿100ml，得黃色油狀物約5ml(加入0.1ml冰醋酸作穩定劑)，即為原白頭翁素。 白頭翁總皂苷的提取 取白頭翁100g，粉碎成粗粉，分次于索式提取器中，以乙醚回流脫脂，脫脂后的藥粉，晾干，用95%的乙醇600ml，回流6小時，趁熱過濾，藥渣用200ml 95%的乙醇洗滌兩次，合并濾液。減壓濃縮至30ml，加入80ml丙酮，即析出白色粉質。再使其溶于熱醇60ml，過濾，將濾液滴入到丙酮-乙醚（1:1）的混合溶劑中，有白色粉質沉淀析出（反復處理兩次）。濾集白色粉質，于80℃真空干燥干燥，得白頭翁總皂苷約9g，備用。 白頭翁浸膏的提取 取白頭翁粗粉100g，加水600ml，煎煮提取，第一煎1h，第二煎45min，第三煎30min，趁熱過濾。合并濾液，減壓濃縮至稠膏狀，于80℃真空干燥，即得浸膏約27.2g。 1.2.2白頭翁三種提取物不同濃度溶液制備： 由于抑菌實驗選用的是不同提取物，因此須計算為同一當量進行抑菌實驗比較,既配制成相當于1克生藥溶于1ml水中的1:1濃度溶液。 原白頭翁素液的配制： 100g白頭翁生藥制得原白頭翁素約5ml，即0.05毫升相當于1g生藥。取0.5ml原白頭翁素粗品（相當于10g藥材）溶于10ml水中，即得1:1濃度的原白頭翁素液。 白頭翁總皂苷液的配制： 100g白頭翁粗粉制得白頭翁總皂苷9g，0.09g白頭翁總皂苷相當于1g原藥材。取0.9g白頭翁總皂苷（相當于10g原藥材）溶于10ml水中，即得1:1濃度的白頭翁總皂苷液。 白頭翁浸膏液的配制： 100g白頭翁粗粉制得27.2g浸膏，0.272g浸膏相當于1g原藥材。取2.72g白頭翁浸膏（相當于10g原藥材）溶于10ml水中，即得1:1濃度的白頭翁浸膏液。 從上述三者的1:1濃度的溶液中各取5.0ml于小玻璃瓶中，用梯度濃度配比法配成濃度分別為1:2、1:4的各提取物的水溶液。具體步驟為：取1:1濃度2.5ml加入第二個小瓶中，再放入2.5ml蒸餾水，充分混勻，即為1:2濃度；再從1:2濃度的瓶中取出2.5ml溶液加入第三個小瓶中，再加入2.5ml蒸餾水，充分混勻，即為1:4濃度溶液。 1.2.3白頭翁湯分提與合煎溶液的制備 取白頭翁、黃柏、黃連、秦皮各20g，加水120 ml分別單獨浸泡30min，回流提取二次，每次30min,合并兩次濾液，均濃縮至20 ml（1:1）備用。 取白頭翁15g、黃柏12g、黃連6g、秦皮12g（共45g）加水270ml 。浸泡30min，回流提取二次，每次30min，合并兩次濾液，濃縮至45 ml（1:1）備用。 取上述白頭翁、黃柏、黃連、秦皮、白頭翁湯1:1濃度提取液，按上述梯度濃度配比法配成濃度分別為1:1、1:2、1:4的各提取物的水溶液。 1.2.4抑菌試驗 藥敏紙片的制備： 將普通定性濾紙用打孔機打成若干圓形紙片，直徑為6.0mm，置于干燥潔凈的試管內，放入高壓滅菌鍋中經121.3℃、15-20min高壓滅菌后，取出放入恒溫干燥箱內進行干燥。取經干燥后的紙片一定數量，放入白頭翁根的三種提取物不同濃度溶液中和白頭翁、黃柏、黃連、秦皮、白頭翁湯不同濃度溶液中，浸潤后備用[3]。 培養基的制備： 在容量為1000ml的三角燒瓶中加入蒸餾水1000ml，放在電爐上加熱。用天平準確稱取35.0g營養瓊脂，放入三角燒瓶中并不斷攪拌使瓊脂完全溶解，然后放入高壓滅菌鍋中經121.3℃、15-20min高壓滅菌，取出趁熱倒入經過高壓滅菌的培養皿中，厚度約3～5mm，冷卻凝固后備用。 參照菌株的培養： 在無菌操作條件下，用接種環取大腸桿菌菌株一環，用劃線法接種在制作好的培養基中，然后用不同接種環分別以同樣方法對金黃葡萄球菌，綠膿桿菌，副傷寒桿菌進行接種。把各菌種置37℃恒溫培養箱中進行培養24h，24h后取出放入4℃冰箱中保存備用。 體外抑菌試驗： 分別取上述菌株的新鮮培養物，在無菌操作條件下，用不同涂布棒均勻涂抹在接種過不同菌種的瓊脂培養基上，再用無菌鑷子，將在各不同濃度的藥液中浸潤的紙片均勻間隔貼于各瓊脂培養基表面，輕壓紙片使接觸良好，放入37℃恒溫培養箱中，24h后取出，觀察抑菌圈，測量并記錄結果。判定標準：抑菌圈直徑小于9㎜為低度敏感；9.1～11㎜為中度敏感；11.1～15㎜為高度敏感。 2結果 2.1白頭翁三種提取物抑菌試驗結果（略） 從表1可知：原白頭翁素的抑菌效果明顯，對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、副傷寒桿菌較為敏感。對大腸桿菌作用較弱。（注：另做乙酸對照實驗證明原白頭翁素中所加乙酸無抑菌作用）；白頭翁總皂苷有一定的抑菌效果，對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、副傷寒桿菌、大腸桿菌均有抑菌作用，低濃度時抑菌作用較弱；白頭翁浸膏液抑菌效果介于兩者之間，有濃度依賴關系。 2.2白頭翁湯及各組分不同濃度抑菌結果（略） 從表2可見, 四藥單提中黃連對金黃色葡萄球菌高敏，對大腸桿菌抑菌作用中等；秦皮對副傷寒桿菌高敏，綠膿桿菌中敏；黃柏和白頭翁1:1濃度時對四種菌達中敏。從復方合煎抑菌作用看，白頭翁湯的抑菌作用不是各組成成分效果的加和。對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用不如黃連，對副傷寒桿菌的抑菌效果不如秦皮。 3討論 原白頭翁素又名原白頭翁腦，原銀蓮花素，為淡黃色油狀液體，有刺激性，在堿性中易被破壞，在pH4-5條件下穩定。其沸點為45℃（1.5mmHg），由于其屬于揮發油類成分，因此目前常用水蒸氣蒸餾法制備。白頭翁皂苷是原生苷，因苷類是往往與能水解苷的酶共存，常用的方法是甲醇、乙醇或沸水法[4]。浸膏系指用適宜的溶劑浸出有效成分，蒸去全部溶劑并調整濃度至規定標準而制成的劑型[5]。 試驗結果表明：白頭翁根的三種不同的提取物原白頭翁素、白頭翁總皂苷、白頭翁浸膏液均有著不同程度的抑菌作用。且它們的抑菌效果隨著濃度的增加而增強，三者的抑菌效果以原白頭翁素為佳。它們對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、副傷寒桿菌較為敏感，對大腸桿菌作用相對弱一些。白頭翁還有很好的抗阿米巴原蟲、陰道滴蟲作用，現代研究還具有抗腫瘤和提高免疫功能的作用[6]。 白頭翁湯為治熱毒痢疾的首選方，從白頭翁湯合煎與拆方抑菌試驗表明：白頭翁湯的抑菌作用不是各組成成分效果的加和。白頭翁湯對金黃色葡萄球菌的抑菌作用不如黃連；對大腸桿菌的抑菌作用不如黃連、黃柏；對副傷寒桿菌的抑菌效果不如秦皮。提示本方對痢疾的療效并非主要是通過抗菌作用實現的。有試驗表明白頭翁湯能顯著降低血漿內毒素的作用[7]。本項試驗也說明，中藥復方的解毒、涼血作用不能單純用抑菌作用解釋[8]。 |
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