董虹1，張永東1，劉鳳華2，許劍琴1 （1中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院北京海淀100094，2 北京農(nóng)學(xué)院動科系北京昌平 102206） | |
摘要：根據(jù)GenBank上登陸（登陸號為GGA251273）的雞膽囊收縮素（CCK）基因，設(shè)計了一對特異性引物，從鴨腺胃、十二指腸和空腸提取總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）擴增，將從十二指腸和空腸中擴增出的產(chǎn)物克隆到pGEM-Teasy載體上，并導(dǎo)入大腸桿菌JM109，陽性克隆經(jīng)雙酶切鑒定后，進行測序和序列分析。結(jié)果腺胃未能擴增到目的片斷，其它兩組織都擴增到長度為220bp，編碼膽囊收縮素的cDNA。與雞的膽囊收縮素核苷酸序列相比較，同源性為88.6%。 關(guān)鍵詞：鴨膽囊收縮素；克隆；序列分析 膽囊收縮素（CholecystokininCCK）是由胃腸黏膜Ｉ細(xì)胞分泌，33個氨基酸組成的多肽類激素，具有收縮膽囊和刺激胰酶分泌，促進胃酸、胰液的分泌，增強胰酶活性，刺激胃腸平滑肌收縮，促進遠(yuǎn)端十二指腸和空腸的蠕動及降低食物消化、延緩胃排空等功能[1]。中醫(yī)上脾乃“后天之本”，具有運化水谷精微，運化水濕的功能。脾失健運，則消化吸收功能失職，出現(xiàn)一系列與消化障礙有關(guān)的疾病。研究顯示[2]脾虛不同階段膽囊收縮素分泌不同，提示CCK可做為脾虛證的一個客觀性和特異性指標(biāo)。本試驗運用RT-PCR技術(shù)成功地克隆了北京鴨CCK基因片斷，不僅為進一步研究鴨CCK基因的全序列及其在鴨體內(nèi)的分布奠定基礎(chǔ)；同時也為從分子水平探討脾虛與CCK之間關(guān)系，進一步探究健脾消食中藥促進動物生長的機理奠定基礎(chǔ)。 1.材料與方法 1.1試驗動物 健康30日齡北京鴨，頸動脈放血后采腺胃、空腸和十二指腸，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?br /> 1.2工具酶和試劑 JM109、pGEM-T Easy Vector 試劑盒、EcoRⅠ等限制性內(nèi)切酶及M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、T4-DNA連接酶、X-gal、IPTG為Promega公司產(chǎn)品，DNA Marker、Taq DNA聚合酶、瓊脂糖為上海生工生物工程公司技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。質(zhì)粒純化試劑盒為上海華舜生物工程有限公司產(chǎn)品。總RNA小量提取試劑盒和膠回收試劑盒為博大泰克產(chǎn)品。 1.3引物的設(shè)計 參照GenBank中已登陸的雞CCK基因序列，設(shè)計了一對引物。 上游引物：5’ATT ATT GAT AGC TCC CAG GAC AGT-3’ 下游引物：5’-GAG GTG GCT CAG CAG TTC ATC-3’ 引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。 1.4鴨腺胃、空腸、十二指腸CCK總RNA提取及cDNA第一條鏈的合成 30日齡北京鴨頸動脈放血，取腺胃、空腸和十二指腸，液氮速凍，采用博大泰克公司總RNA提取試劑盒，分別取組織50mg，加入玻璃研磨器中，吸入預(yù)冷的變性劑，冰浴研磨至無明顯組織塊，醋酸鈉溶解分離，酚－氯仿－異戊醇抽提，異丙醇沉淀，適量雙蒸水溶解總RNA，用微量核酸蛋白檢測儀測定RNA濃度，取2μgRNA，10mM dNTP，25單位Rnasin 抑制劑，200單位MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，25μL反應(yīng)體系中合成第一條鏈。 1.5北京鴨CCK cDNA部分片段的擴增 50μL反應(yīng)體系中加入1.0μLcDNA為模板，25Mm MgCl2 4.0μL，5U Taq-DNA 0.125μL、10×buffer 5.0μL、10mM dNTPs4.0μL、12.8pmol上下游引物各2.5μL，反應(yīng)液在95℃預(yù)變性5min，94℃變性50s、52.8℃退火40s、72℃延伸40s、共31個循環(huán)，最后72℃保溫8min。PCR結(jié)束后取取20μL進行電泳鑒定。 1.6基因克隆 擴增產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳，通過與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)對照檢測后，將含有目的片段的瓊脂塊切下，采用玻璃奶法回收法，將回收產(chǎn)物連接到pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于含IPTG、X-Gal和氨芐青霉素（AMP）的LB培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，進行籃白斑篩選。挑取生長良好的白色菌落接種于含AMP的SOC液體培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)。按照堿裂法提取質(zhì)粒，進行酶切鑒定。 1.7重組質(zhì)粒的酶切鑒定 將篩選的陽性重組質(zhì)粒用EcoRⅠ進行雙酶切鑒定，1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外觀察，酶切鑒定正確的質(zhì)粒，原菌液過夜搖菌飽和后，送上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進行序列測定，并將測得的CCK基因序列與雞的進行比較分析。 2.結(jié)果 2.1 RT-PCR 用微量核酸蛋白檢測儀測定提取的CCK 總RNA含量，其A260/280比值均在1.7-2.0之間，證明提取的RNA較純。RT-PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鴨空腸和十二指腸均擴增出長度為220bp左右，與設(shè)計結(jié)果大小完全相符的目的片斷（見圖1）；鴨腺胃中未擴出目的片斷。 2.2重組質(zhì)粒的鑒定 將純化的PT-PCR產(chǎn)物連接pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化E.coli感受肽細(xì)胞JM109中，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒用EcoRⅠ對質(zhì)粒酶切鑒定，結(jié)果得到了與預(yù)期大小一致的約220bp的片斷，見圖2。 2.3測序結(jié)果及對比分析 測序發(fā)現(xiàn)，插入pGEM-T載體的PCR產(chǎn)物全長693bp。其中CCK基因長度為220bp，和雞核苷酸序列相比較，同源性為88.6%，測序結(jié)果見圖3。 Duck-cckTACTCCTCCTAAAGAACAGCAGACTATAGCAACAAGAAAA40 Chick-cck----------------------g-g---------g----g40 Duck-cckAAAAAATCACACTCCTATGCCTGTACAGAAAGAAAAAA..78 Chick-cck--...--g-------c---t----------g--g----at77 Duck-cckTAATTTGTTGTCCTCTTTAAATTAGTGTTTTAAATTATAT118 Chick-cck-----------------cg---c-----------gc----117 Duck-cckCATGTATTTGATGTAAATTTGTCTGTAAGATTATACAATG158 Chick-cck------------------------------.....-----152 Duck-cckCAATATATACATATGCAGAATTTTCCAG..AAAATGTTTT196 Chick-cck----------------------------ga----------192 Duck-cckCTTTCTTTTGTGGTTTCTCATACGCTGA224 Chick-cck----------------------------220 3.討論膽囊收縮素是1928年首先由Ivy和Oldberg在小腸粘膜提取液中發(fā)現(xiàn)，并最先證實它可引起膽囊收縮，故命名為膽囊收縮素。1943年Harper和Raper從小腸黏膜分泌物中提取了一種刺激胰腺酶分泌的刺激物質(zhì)（CCK），稱之為腸促胰酶素因子，認(rèn)為它是一種潛在的胰腺酶分泌刺激因子。后來，Dockray等又在羊腦中提取出CCK，發(fā)現(xiàn)它是目前在腦中含量較多的一種肽類物質(zhì)，并證明是一種典型的腦-腸肽類物質(zhì)[3,4]。CCK是一個在生物進化中被保留下來古老的肽類，多存在于脊椎動物如圓口類、硬骨魚類、兩棲類、爬行類、鳥類等動物腦和小腸黏膜的分泌細(xì)胞中，其中以大腦皮層濃度最高，甚至在無脊椎動物體內(nèi)亦含有[5]。目前國內(nèi)外還未曾有人報道從鴨體內(nèi)分離提取CCK基因，本試驗成功的從30日齡的北京鴨體內(nèi)克隆出CCK基因片斷，和雞的CCK核苷酸相比較，同源性為88.2％，證明其確實為CCK基因，這也為獲得鴨全長的CCK基因奠定了基礎(chǔ)。 作為胃腸激素和神經(jīng)肽[6]，CCK廣泛分布于消化系統(tǒng)，中樞、外周神經(jīng)系統(tǒng)，外周血液和一些組織器官中。消化系統(tǒng)中CCK主要以大分子形式存在，由主要分布于十二指腸及空腸上段的腸絨毛和腸腺上皮的Ⅰ細(xì)胞分泌，DannyM.Hooge等[7]研究表明CCK在雞體內(nèi)，十二指腸含量最高，其次為空腸、回腸和腦皮質(zhì)。雞的下丘腦、胰腺、膽囊及盲腸膜中也檢測到特異性結(jié)合物CCK-8S（CCK-8的硫酸鹽形式）。中樞系統(tǒng)中CCK以CCK-8活性片斷形式存在，其分泌細(xì)胞主要分布于室旁核與室上核。本次試驗初步探明北京鴨十二指腸和空腸含有CCK，但腺胃中卻未能擴出CCK基因，提示腺胃中可能沒有CCK存在。但有報道CCK分泌和動物的年齡有一定關(guān)系，不同年齡階段CCK分泌不同，故是否此次選取的30日齡鴨在此年齡階段無CCK分泌，還需進一步探討。 脾具有消化吸收運輸營養(yǎng)物質(zhì)及水濕的功能，機體的各臟腑、四肢百骸、筋肉、皮毛，均有賴脾的運化以獲取營養(yǎng)。因此脾功能失常，會出現(xiàn)腹脹、腹瀉、營養(yǎng)不良等癥狀。而脾與胃腸激素的關(guān)系：劉芳等[2]研究表明，脾虛早期會導(dǎo)致組織和血漿CCK含量升高，胰液分泌增多，促進小腸運動和抑制胃運動作用加強，動物表現(xiàn)為納差、腹瀉；脾虛后期CCK含量下降，促進膽囊收縮和胰液分泌作用下降，對小腸運動刺激作用減小，動物表現(xiàn)為腹瀉停止，排便粘滯。同時多部位激素含量的觀察表明脾虛證時血漿、腸道和下丘腦組織中CCK的變化趨勢是不一致的，可推測不同組織和血漿中CCK對脾虛失健運的作用是不一致的。由此可見CCK可作為脾虛證的一個客觀性和特異性指標(biāo)，因此通過探明鴨CCK基因序列，可以建立一種快捷的通過檢測CCK來評價動物脾虛病理狀況的方法。 健脾消食類中藥具有健脾益氣，促消化、助生長的作用。研究表明[8]健脾消食中藥黨參、山楂可促進胰液分泌，提高胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶活性，促進食物消化吸收，從而促進動物增長，提示健脾消食類中藥可能是通過對胃腸激素（CCK）的調(diào)節(jié)來達(dá)到促進胰腺外分泌。本試驗為從分子水平研究健脾消食中藥與胃腸激素之間關(guān)系提供理論基礎(chǔ)，也為進一步研究和開發(fā)中藥飼料添加劑奠定基礎(chǔ)。 |
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