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畜牧人

標題: 實驗室手冊 [打印本頁]

作者: enwen 時間: 2007-11-5 11:25
標題: 實驗室手冊
實驗室手冊

921
實驗室手冊
ＬＡＢＯＲＴＯＲＹ　　　ＨＡＮＤＢＯＯＫ
（兼作研究生獸醫免疫學實驗技術指導講義）
焦新安　　　編
江蘇農學院傳染病教研組
一九九三年三月前言
實驗室是進行教學和科學研究的重要基地，為適應教學、科研及實驗室建設和管理的迫切需要，筆者根據教研室的教學、科研實踐情況，以力求簡明和實用為宗旨匯編了這本《實驗室手冊》，共分四個部分，其中第一、第二部分適于實驗室管理和研究生等人員的實驗工作基本素質和基本技能的訓練；第三部分可用作研究生獸醫免疫學實驗指導，亦可供有關教學人員參考；第四部分是作為家畜傳染病學實驗課教師參考教材。整個手冊反應了近年來家畜傳染病教研室在教學、科研、教書育人方面的最新成果，可供同類生物學實驗室交流和參考。
在編寫過程中得到劉秀梵教授和張如寬教授的審閱和大力支持，室內其他同志亦提出了許多寶貴意見，特此致謝！由于時間倉促和編寫水平有限，經驗不足，錯誤之處誠望讀者不吝指正。
編者
１９９０年６月
１９９０年我們試編的《實驗室手冊》得到了校內外讀者的大力支持，并得到了許多寶貴意見，該手冊正在補充修改之中，可望近期脫稿。
為了滿足研究生獸醫免疫學實驗技術和部分家畜傳染病學實驗技術的教學等急需，我們稍作調整后重印部分手冊。懇請讀者繼續提出寶貴意見！
編者
１９９３年３月
目錄
第一部分實驗室工作手冊
第一章總則７
   附：實驗室一般規則
第二章細則９
第一節無菌室工作須知９
第二節送洗須知９
第三節試劑的保存和使用須知１０
第四節菌種、毒種和細胞株保存須知１１
第五節超低溫冰箱和液氮罐使用須知１３
第六節高值儀器使用須知１４
第七節常用小型儀器使用須知
第八節實驗記錄須知
第九節值日工作人員的職責須知
第十節文獻資料查閱須知
第十一節試驗準備須知
第十二節其他注意事項
第二部分　　常用儀器的操作程序及使用注意事項
第一節多功能紫外可見分光光度計
第二節酶聯免疫閱讀儀
第三節電子天平
第四節各類顯微鏡及顯微攝影技術
第五節核酸蛋白檢測儀
第六節各類離心機
第七節酸度計
第八節各類冰箱的使用和保養
第九節電泳裝置
第十節空調機、抽濕機、超靜工作臺
第十一節自動顆粒制冰機
第十二節其他儀器設備
第三部分實驗室常規試驗程序
第一章組織培養及常用溶液的配制
第一節雞成纖維細胞（ＣＥＦ）、鴨成纖維細胞（ＤＥＦ）培養
第二節組織培養溶液配方
第三節配制溶液注意事項
第二章淋巴細胞雜交瘤技術及使用溶液的配制
第一節配合程序
第二節溶液配方
第三節單抗制作技術中的其他方法
第三章組織培養使用物品的準備
第一節一般原則
第二節玻璃器皿的準備
第三節橡皮制或塑料制品的準備
第四節其他用品的準備
第五節純水制備程序
第六節新生犢牛血清的制備
第四章酶聯免疫吸附試驗（ＥＬＩＳＡ）的程序
第一節間接ＥＬＩＳＡ試驗
第二節直接ＥＬＩＳＡ試驗
第三節夾心ＥＬＩＳＡ試驗
第四節競爭ＥＬＩＳＡ試驗
第五節ＤＯＴ－ＥＬＩＳＡ試驗
第六節酶標組化法
第七節ＥＬＩＳＡ常用溶液的配方
第八節酶標抗體的制備
第五章免疫熒光試驗的程序
第一節脂多糖敏化甲醛化綿羊紅細胞的制備
第二節蛋白質敏化ＳＰＢＣ的制備
第三節ＰＨＡ試驗程序
第七章免疫膠體金試驗程序
第八章免疫球蛋白亞類測定
第一節免疫擴散法
第二節ＥＬＩＳＡ法
第九章免疫血清制備
第一節免疫球蛋白提取與純化
第二節幾種常見抗原的制備
第三節抗血清的制備程序
第十章細菌學試驗種的幾個常用技術
第一節細菌學總數估測
第二節幾種常用培養記得配方
第三節常用細菌的分離鑒定程序
第十一章細胞免疫學試驗程序
第一節玫瑰花環試驗
第二節淋巴細胞轉化試驗
第十二章動物試驗的一般規則
第十三張電泳技術、層析技術
第十部分家畜傳染病學試驗指導
家畜傳染病學試驗規則、實驗報告內容
實驗一炭疽的診斷
實驗二巴氏桿菌的診斷
實驗三結核桿菌病和布魯氏桿菌的檢疫
實驗四豬瘟的診斷
實驗五雞新城疫的診斷
Ｉ雞新城疫病病毒的雞胚分離
ＩＩ免疫熒光實驗
ＩＩＩ血凝和血凝抑制實驗
實驗六雞馬立克氏病的瓊擴診斷
實驗七沙門氏菌快速檢測技術
實驗八雞白痢的檢測
第一部分　　實驗室工作守則
第一章總則
一、嚴禁在實驗室內吸煙、飲食（辦公室除外）；嚴禁挪用公物。
二、所有物品用后立即歸回原處。
三、菌種、毒種嚴禁帶出實驗室。
四、各種病毒材料在廢棄前應做好無害化處理。
五、愛護儀器設備，用后做好清潔整理工作。
六、使用高值儀器前仔細閱讀儀器說明書，嚴格遵守操作規程進行操作。初次使用應在有關老師或工作人員指導下進行。
七、損壞器皿和儀器需登記，并及時向有關負責老師匯報。
八、堅持用水、用電安全，使用電爐時不得離開現場，下班時檢查水電，鎖緊門窗。
九、厲行節約。在一切工作中樹立節約精神，培養集和各種溶液用多少配多少，可以回收的東西及時回收。節約用電，隨手關燈。
十、值日人員應履行職責，并督促其他工作人員做好實驗后的整理工作。
十一、實驗室內所有資料閱后放回原處，一般不得帶出實驗室，特殊情況下需借閱，應經過批準，并登記。
十二、每進行一個試驗需事先提出實驗設計，列出所需材料及藥品清單和經費預算（一式二份）。報請批準后付諸實施（交批準任一份）。
十三、領用或購置藥品和器材需事先列出申請（一式二份），寫明用途并報請批準（交批準人一份）。
十四、新進入實驗室工作的研究生須經過一段時間的工作訓練。熟悉實驗室工作守則，掌握各種器材的清洗消毒等準備工作，掌握各種儀器的使用和保養方法。
十五、每周六下午為教研室例會（學術匯報和討論，工作總結和安排）和室內外衛生大掃除。
附一、實驗室一般規則
一、實驗事是進行教學和科研的重要基地，是辦好學校的基本條件之一。實驗室人員應忠誠黨的教育事業，認真貫徹黨的教育方針，為培養四化建設有用人才盡職盡責。
二、實驗室要堅持改革，按照勤儉辦學的原則，少花錢，多辦事，辦好事，注意提高效益，反對浪費。
三、實驗室以實驗教學為主，在保證教學和科研任務的前提下，可以充分利用現有的技術和設備條件，積極開展技術服務工作。
四、實驗室應保持肅靜、文明、整潔的工作環境和良好的秩序，實驗室嚴禁吸煙，無關人員不得進入實驗室，院外人員到實驗室參觀學習，須經主管部門同意或院領導批準。
五、加強科學管理，建立健全必要的規章制度如各類人員的崗位責任制，儀器設備和物資材料使用報關制度等。
六、加強安全，劇毒物品要嚴格領用。對易燃易爆、有毒放射性等有害物品，單獨存放，并且指定專人保管，嚴禁隨意亂放和擅自挪用。
七、實驗室人員和學生在實驗前應做好充分準備，熟悉實驗內容和操作規程，精心實驗。
八、學生進入實驗室學習，實驗室人員應向學生進行勤儉節約、安全，以及有關科技保密等方面的教育，精心指導，確保實驗課順利進行。
九、實驗人員對實驗室儀器要定期清點，維護保養，開展以儀器完好率、安全、衛生等評比活動，對成績顯著的個人和集體進行表揚和獎勵。對工作不負責造成損失者進行批評教育直至經濟處罰和行政處分。

第二章細則
第一節無菌室工作須知
一、無菌室內非請莫入，非本實驗室人員未經批準不得在無菌室內工作。
二、所有藥品器材均為無菌室專用，一般不得帶初無菌室，作為其他用處。
三、所有物品用后立即放回原處。
四、進入無菌室工作之前需修剪指甲，手清洗后在用１％新潔爾滅溶液洗手消毒，換鞋進入，使用超靜臺需著無菌室專用工作服并用酒精棉球擦手消毒。超靜臺每次使用后都應仔細做好清潔整理工作。
五、衛生值日人員要勤打掃。注意保持無菌室的相對無菌條件，經常用新潔爾滅溶液擦洗地面、桌面、臺面和試劑廚。經常將無菌室工作服送至洗滌室清洗消毒，使用后的鼠尸及鼠籠隨手帶出無菌室。每日為除濕機倒水。注意無菌時使用藥品、物品的消耗，及時通知工人準備，或匯報負責老師以便補充。
六、配培養基和其他試劑都應有記錄，瓶子上映注明品質、濃度、日期及配制人，使用過的培養基及無菌試劑應自覺注明使用人姓名，以防止交叉污染。
七、嚴格控制細胞之間或病原之間的交叉污染，容易發生交叉污染的細胞或病毒不能在同一超凈臺內處理。
八、扭力天平使用之后應休止，在將讀數盤回零，托盤及天平表面擦洗干凈，藥勺也應洗凈擦干。使用后的藥品應將蓋擰緊，放回原處。
九、離心機使用時應注意平衡，使用后將離心杯、橡皮套管清洗干凈，倒置晾干。
十、ＣＯ２孵箱為通氣培養箱，應自覺維護箱內清潔，定期將托板、托盤換出消毒。如培養瓶內培養基漏出，立即用酒精棉講瓶外表面跡箱內污跡擦拭干凈，箱內蒸發用水威無菌蒸餾水，應注意補充。四周水箱內的水定期補加。ＣＯ２濃度、溫度控制器等零部件請勿動，發現問題及時報告。
十一、組織培養用眼科剪刀鑷子使用后應洗凈烘干，防止生銹。
十二、浸泡細胞培養板統一使用７５％酒精（ＣＰ或ＡＲ）或醫用酒精。
第二節　　送洗須知
一、送入洗滌室的所有物品均應分類置于指定的地方,以便洗滌。
二、被病原材料污染的器械物品等在送洗之前作無害化處理和面交洗滌室工作人員，并詳細說明處理方法。
三、送洗的所有玻璃、塑料器皿都應沖洗后浸泡于自來水中。使用的金屬濾器應仔細沖洗后，完全浸泡于水中。包扎濾器用的牛皮紙和紗布可重復使用，應置于干燥箱內烘干。
四、注意節約。可以重復使用的物品如離心管塞、牛皮紙和沙布等不應廢棄。
五、注射器、針頭、剪刀、鑷子、微量吸樣器用塑料滴頭，高速離心機用塑料離心管皆由使用者自己清洗、烘干，并放回原處。
六、每一實驗若需較大量的物品或一些特殊用品，應提前通知洗第室工作人員準備，特殊洗滌要求要當面交待。
第三節試劑的保存與使用須知
一、化學試劑在保存與使用過程中往往會因為自身物理化學特性和環境條件的變化發生變質。化學試劑的變質分為潮解、霉變、熔化、凝固、變色、聚合、氧化、腐蝕、揮發、風化、升華和失效等。影響化學試劑變質的主要因素為水分、氧氣、光輻射和溫度等。
二、化學試劑的保存溫度分為室溫、４℃、冰凍（－２０度）和超低溫（－７０度以下）等。應根據化學試劑的物理化學特性和瓶簽要求分別保存于不同溫度條件下。
三、化學試劑一般都應密閉、干燥保存。有些化學試劑（如氧化鈣、乙酸鉀、硝酸鈣和氯化鈣）極易從空氣中吸收水分而潮解或分解變質。這些化學試劑要特別注意密閉、干燥。有些生物制劑（如酶和熒光素）不僅需要低溫保存，而且很易吸潮而變質失活。這類藥品應置于干燥器中冰箱內保存，使用這類試劑要注意需待干燥器內溫度升高時方可開啟干燥器上蓋，以防在干燥器內開成水汽。
四、根據試驗要求選用不同純度的化學試劑。不可超級使用，但也不要降級使用。（見附表）
五、使用進口藥品和貴重藥品需辦理申請批準手續。取用時進行登記。
六、有毒藥品要由專人保管，使用過程中一定要注意個人保護和環境保護。
七、所有化學試劑使用后擰緊瓶蓋，立即回到原保存條件下。
八、同一種藥品一瓶未用完之前不得開啟或領用新瓶。
九、每一種藥品使用一個藥勺。注意防止試劑間相互污染。藥勺使用后應立即洗凈。
十、嚴禁將化學藥品用作食用或作燃料。
附表　　我國化學試劑的等級標志
試劑級別中文名稱代號瓶簽顏色使用要求
一級品保證試劑或“優級純” Ｇ．Ｒ．綠色用作基準物質，主要用于精密的科學研究和分析鑒定
二級品分析試劑或“分析純” Ａ．Ｒ．紅色主要用于一般科學研究和分析鑒定
三級品化學純粹試劑或“化學純” Ｃ．Ｐ．藍色用于要求較高的有機或無機化學實驗，也常用于要求較低的分析實驗
四級品實驗試劑Ｌ．Ｒ．棕色或藍色或其他顏色主要用于普通的實驗和科學研究上，有時也用于要求較高的工業生產中
第四節菌種、毒種和細胞株保存須知
一，菌種、毒種和細胞嚴禁攜出實驗室。其它實驗室如需引進，須經過負責老師批準，并辦理有關手續。
二，所有菌種、毒種和細胞都應專用登記本上按規定項目詳細登記，請參閱有關登記本目錄說明。
三，根據保存物不同要求保存于不同條件下。一般分為-30，超低溫（-70以下）和液氮保存。
四，越低溫冰箱內按位置分類存放，液氮貯罐分類存放。
五，菌種、毒種和細胞在接種繼代時應嚴格防止交叉污染。
六，取出時必須在登記本上登記。
第五節超低溫冰箱和液氮貯罐使用須知
一，超低溫冰箱使用須知
1，超低溫冰箱僅限于存放毒種，菌種，血清抗體、單抗腹水、藥品試劑和某些病料等。
2，放入箱內所有制物品必須按規定位置分類存放。取放都應在登記本上登記。
3，箱門開啟時應盡可能短暫，關門后鎖緊扣好。嚴禁在停電時開啟箱門。
4，及時清理、剔除無保存價值的物品。
二，液氮罐使用須知1，液氮容器分為二類。一類為貯存容器，這類容器保存液氮時間長，主要用于靜置貯存液氮，存放時應保持垂直，切不可充裝液氮后傾倒。可以空載運輸，但不可在充滿液氮下作長或短途運輸。另一類為運輸容器，這類容器耐沖擊震動，可充裝液氮后作長短途運輸。
2，只能使用配套瓶封閉頸口，不可用其它不合格物代替。否則會因液氮持續蒸發，形成壓縮氣壓，導致致容器的損壞或爆炸。
3，容器首次充滿液氮以及停用后重裝，因內膽是常溫，開始充裝時切勿太快，以免液氮劇烈沸騰，向外飛濺。
1、
2、容器首次充滿液氮以及停用后重新充裝，因內膽是常溫，開始充裝時切勿太快，以免液氮劇烈沸騰，向外飛濺。
3、加注液氮時不要將液氮沖在頸管上（應使用漏斗加注液氮），液氮不宜充裝過滿，切勿使液面高到與玻璃鋼頸管接觸。
4、取放冰存物時應細心謹慎操作，要注意盡量縮短頸口開放時間，避免吸入空氣中水份影響貯存效果。
5、如發現液氮蒸損量突然增多或外殼上部的金屬表面突然結霜，說明容器已經損壞，應立即停止使用。
6、存放細胞需使用統一規格的布袋，引繩要牢靠。
7、存放細胞后登記，并統一編號。取出細胞后也在登記薄上登記，禁止取存細胞不登記不現象。
8、保持液氮罐的線頭齊整，經常清理棄去無保存價值的細胞。
第六節高值儀器使用須知
一、使用高值儀器前需仔細閱讀儀器說明書。初次使用時應在有關人員指導下進行。
二、使用過程中如發現故障，應立即報告有關人員。
三、使用高值儀器必須登記，使用后做好清理工作，加蓋防塵罩。
四、高值儀器由專人負責。負責同志做好儀器的調試保養和監督使用工作。
五、非本室工作人員使用高值儀器需經批準。并需由本室工作人員都督使用。
第七節常用小型儀器使用注意事項
一、電子交流穩妥壓器
         1 連續工作時間一般不要超過6小時。
         2、關機后需待5分鐘方可重新開啟電源開關。
         二真空泵
1使用前查看沒油位。以停泵時注油標中心為宜。
2、泵進氣口連續通暢大氣運轉不得超過1分鐘。
三、電動吸引器
      使用前觀察潤滑油是否正常（油面應在油鏡中央）。若油面偏聽偏低，應隨時加注。
四、小型臺式離心機
1、電機要三個月加注潤滑油一次。
         2、碳刷磨損小于10mm時應調換新碳刷。
         3、試管、試管套都應對稱平衡。嚴禁在重量非相等時使用。
      五、手提式高壓蒸氣消毒鍋
1、每次使用前應檢查器內水量是否保持3立升左右。
2、對溶液消毒，應灌注于耐熱玻璃內，以不超過3/4瓶為妥。
3、消毒物品放置時互之間應留有空隙，有得于蒸汽穿透，提高消毒效果。
4 每次消毒開始時應將放氣閥打開，待器內空氣逸出，有較急蒸汽噴出時，關閉放氣閥進行消毒（也可開始時先關閉放氣閥待加熱至5磅/平方英寸放氣）
1、對器械、器皿消毒后，可立即打開安全閥，使蒸汽迅速排去。對瓶裝溶液消毒終了后，                         切勿立即放蒸汽，否則，瓶內溶液可因壓力聚變而劇烈沸騰、溢出，甚至瓶子爆破。
2、剛消毒后的瓶裝溶液不能直接置于水泥臺面，否則因驟冷易發生爆炸。
3、消毒鍋蓋上裝有工作壓力1.4千克/平方厘米的安全閥，應經常將此閥開放數次，使之處于靈活狀態。
六、電熱干燥箱
1、內室底板不宜放消毒物品，以免影響散熱或被烤焦。
2、消毒時需開啟鼓風機并適當旋開排氣孔。
3、在加熱過程中將加熱開關旋至“2”（二組加熱器工作）。達到恒溫后可關閉一組加熱器（旋至“1”），以免功率過大，影響恒溫靈敏度。
4、加熱或恒溫時如欲觀察工作室試品，可開啟箱門，在玻璃門外觀察。在溫度高于100（度）時不得開啟玻璃門，以防玻璃器皿驟冷炸裂。
第八節實驗記錄須知
一、實驗記錄統一用碳素水書寫，要求字跡正規、條理清晰。
二、實驗記錄應注明年月日。
三、記錄應詳細。每次實驗所用的材料及所采用的方法都應詳細記錄，以備查證。對觀察的結果應作如實詳盡的描述，必要時進行簡單的歸納和說明。發現與預料結果不符的現象應分析原因。試驗過程中發現的對試驗結果有影響的意外情況諸如停電、污染等也應在記錄本上注明。
四、實驗記錄應與實驗同步進行，不要做回憶性記錄。
五、試驗進行一個階段后應及時對所得的實驗結果進行分析綜合。提出下一階段工作重點（實驗項目及所采取的技術路線等）。
六、實驗記錄為本實驗室擁有，一般情況下不得帶出實驗室。如需借用應經過批準。
七、課題結束后，記錄應及時整理歸檔。
第九節值日工作人員的職責須知
一、完善值日制度，設專人管理。
二、值日人員應做好每天的清潔衛生工作，整理臺面，檢查儀器運行情況，并監督其他工作人員做好實驗后的清潔整理工作。
三、注意安全工作，防盜放火防水。下班時檢查水電，關好門窗。
四、無菌室值日人員的職責參見第一節，注意督促大家執行。
五、及時向負責老師匯報用完或缺少的試劑、物品等，以便補充。損壞的儀器設備，應即使報告，以免影響研究工作。
第十節文獻資料借閱、復印須知
一、實驗室所有的圖書、期刊、文獻資料等閱后放回原處，一般不得帶出實驗室，特殊情況下（包括外組工作人員）需借閱應經批準，并登記。
      二、復印資料，需經負責老師批準，復印后做好登記工作，避免重復復印同一份資料。
三、課題結束后，應及時整理裝訂好所有文獻資料，交給管理人員妥為保管。
四、借閱原始記錄需經有關老師同意，注意防止遺失。
五、有關文獻檢索的方法，請查閱有關工具書。
第十一節實驗準備須知
一、首先借閱文獻，寫出實驗設計，并經行可行性論證。
二、提交所需材料藥品清單和經費預算，力求節約。
三、交負責老師批準后，方可付諸實施。
四、需要特殊材料（包括實驗動物）和藥品等，應提早訂購。
五、新進入實驗室工作的研究生須先經過一段時間的工作訓練。在經行論文工作之前，必須提交開題報告。
六、階段實驗結束后，及時小結，提出下階段的工作重點。
第十二節其它注意事項
一、配制一切試劑都應注明品名、濃度、日期和配制人。
二、操作揮發性濃酸（如冰乙酸）和揮發性有機溶液劑等應在通風有毒氣體和有臭蟲味氣體均應在通風進行。凡是發生煙霧、有毒氣體和有臭蟲味氣體均應在通風處進行。
三、強酸強堿等廢液不能直接倒在水槽中。
四、不能用凡士林封閉層析柱下口玻璃活塞。
五、臺平用后擦凈，二個托盤重合以保護刀口。
六、實驗臺用后立即做好清潔工作。藥品、試劑和器材放回原處，需要洗滌的物品送至洗滌室。
七、經常清理，剔除存放于冰箱，試劑櫥內無保存價值的物品。
八、非本室工作人員借用儀器，藥品和器材需經過批準，并辦理借用手續。
九、工作人員之間要發揚合作精神，提倡導互相幫助。

                     第二部分       常用儀器的操作程序及使用注意事項

第一節多功能紫外可見光度計
M750—A型多功能紫外可見光光度計
在開啟儀器電源之前，請檢查：“光源選擇鈕位于”關“；”量程選擇”鈕位于“零”；“100%T”鈕位于“零”。
1、依據待測樣品選擇波長。
2、根據波長選擇開啟H燈（200.0—360.0nm）或W燈(360.0—750.0nm),儀器預熱5分鐘.
3、 “量程選擇”位于”校零”位置 ,用”調零”鈕調零點.
4、空白樣液置于光路中,蓋好樣品室蓋,”量程選擇”置于”X1”檔調節”100%T”,使表頭指針為”100%”.
5、重復調零和調100%步驟至儀器  完全穩定.
6、拉出手柄使待測樣品于光路中, 讀取A值.如樣液濃度較高時可使用”X0.1”檔,此時A值的讀數為表頭讀數加1.0.
7、 “量程選擇”鈕位于”校零”位置,打開樣品室蓋取出比色皿.
8、關機：“量程選擇”置于“校零”，“100%T”逆時針旋至“零點”，“光源選擇”置于“關”，撥下主機電源插頭。
9、將儀器用罩子罩好。
10、在使用登記本上登記。
注意事項：
1、“量程選擇”鈕位于“X1”或“X0.1”時不得打開樣品室上蓋;
2、在測量過程式中不讀數，“量程選擇”鈕應置于“校零”位置，以延長光電管使用壽命；
3、使用權用微量池或半微量池時，應用微量進樣器進液，注液時不得溢出池外，也不得碰傷上端的石英窗。
4、H燈關后間隔10分鐘才可再開啟。
5、比色皿用后應用去離子水充分淋洗，倒置于吸水紙上，使其干燥。
第二節酶聯免疫閱讀儀
DG—3022型酶聯免疫檢測儀使用注意事項：
1、第一次使用該機的工作人員，使用前請務必仔細閱讀使用說明書；了解并掌握操作方法：    開機 —調零—工作選擇（包括統計處理及其它功能）—賦值—測量必要時可在有關負責人員的指導下熟悉該
2、關機后5秒內不要立即開機，儀器正在工作時，其交流電壓不允許閃動。
3、儀器工作時，操作人員不要離開。
4、儀器運行中出現失常，應即時排除故障或匯報老師處理。
5、裁下一部份打印紙帶時，應使用剪刀剪的方法。
6、儀器須注意防塵防潮，加外罩。
7、更換濾光片前必須關閉電源。
第一節電子天平
Mettler  AE240電子天平
操作步驟：
1、輕按控制盤，幾秒鐘后顯示盤顯示“0,0000”或”0.00000”(“0.0000”表示量稱范圍0.1mg—200g,0.00000表示量稱范圍0.01mg—40g)。
2、如盤上顯示的量程與要求的一致，則直接進入第三步，如不一致，則按如下方法改變量程范圍：
（1）輕按信控制盤，待rag200/40顯示后松開。
（2）再輕按控制盤一下，從顯示盤上可風量程轉變為另一種。
（3）幾秒鐘后顯示器顯示0。
3、在稱量盤上加一塊稱量紙，待顯示盤上讀數穩定之后，輕按控制盤以去皮。
4、待顯示0后，加所需稱量物品。
5、穩定性檢測點消失之后，顯示盤上的數據即為物品的重量。
6、向上輕掀控制盤以關閉顯示器，取下稱量物品和稱量紙。
7、用專用毛刷將稱量盤和天平內室掃干凈。
8、關閉天平玻璃門，罩上防塵罩，不要拔下電源插頭。
9、在使用用登記本上登記。
注意事項：
1、電子天平在開啟使用之前需將電源插頭接到220V電源（無需穩壓器）上至少30分鐘，校準天平時則需按在電源上1小時。
2、電子天平在使用之后不要拔下電源插頭。
3、 AE240電子天平有2種稱量精確度，即0.1mg和0.01mg。沒有必要時不要選用0.01mg檔。
4、灑落在天平稱盤和天平室上的藥品務必在稱量后用毛刷拭去。
5、非保養儀器人員不要擅自對天平進行校準，不合格的校準操作很容易使天平損壞。
第三節各類顯微鏡及顯微鏡攝影技術
顯微鏡系列使用注意事項：
1、顯微鏡應置于干燥、陰涼、空氣流通的地方，避免受潮受熱。
2、經常注意光學零件清潔，目鏡有灰塵可用吹風球或軟羊毛管將灰塵吹去或掃去，油浸物鏡使用權用后要及時用抹鏡紙醮少許二甲苯抹凈油脂。
3、保持機械部份的靈活，經常上些潤滑油。
4、調試好的各類顯微鏡，使用時請勿輕易調動，發現故障時，請及時報告負責制人員，及時排除。
5、熒光顯微鏡關閉后，必須間隔15分鐘以上才能重新開啟，用后要登記。
6、對所用顯微鏡（普通、倒置、相差、熒光）和顯微鏡攝影裝置，若不熟悉，請事先詳細閱讀說明書，或在保管人員的指導下使用。
7、顯微鏡攝影裝置務必在負責人員協助下進行。攝影材料應精選，注意代表性，厲行節約。
第四節核酸蛋白檢測儀
ZW2080—A紫外測儀操作步驟
1、開機前，首先將電源、檢測器和記錄三部分電路連接，通上電源。
2、把波長旋鈕旋到所需波長刻度上。
3、把主機量程開頭拔到期100%T檔。
4、按通記錄儀電源開關，按下“調零”記錄儀指針應在“0”位置，如不在，則調至“0”位。彈出“調零”按鈕。按下“10mv”琴鍵開關。
5、打開主機電源開關。
6、順時針旋轉“光量”旋鈕，使用權指針停留在50—60%T處。
7、預熱1小時以上。
8、將進樣器與層析柱連接，使用權層析柱中的洗脫液流經檢測器。
9、當記錄儀基線穩定之后，把檢測器上的“光量”旋鈕逆時針旋轉到底，此時由于狹縫完全關閉，記錄儀指針應移動到左邊“0”位置。
10、順時針方向打開“光量”鈕，使記錄儀指針移到90%T位置。若做透光率T測試，就可進樣。
11、若用光密度A測試，把量程鈕拔到所需A檔，此時記錄儀指針回到0.05附近,用”A調零”和”光量”鈕,將指針精確調在0.05位置。
12、至此，儀器調試完畢。可以進行測試。測試過程是，“光量”、“A調零”均不能再變動。
13、測試完畢，先關記錄儀開關，再關主機開關。將“光量”鈕逆時針旋轉到底。
14、用蒸餾水清洗樣品池和要道。
15、使用情況登記。
注意事項
1、在工作前檢查各連接線是否正確。
2、儀器不常工作時，有出現燈源不亮，常見原因是：（1）環境影響，因氣溫低或受潮；（2）久不使用等。解決辦法是開通電源后，過一會兒再關掉，再開幾次，或用電吹風對準燈源窗口加熱。
3在連接層析柱時，避免有氣泡進入樣品池，當氣泡進入時，應把氣泡趕走，不然，基線產生波動對實驗不利。
4光電倍增管為要用手指觸摸發光區。
5、儀器應保持清潔、干燥。
6、層析柱使用后，柱內凝膠應及時復生。
第五節各類離心機
GL20A高速離心機操作程序：
1、主電源開關扳至“ON”位置。
2、溫度預選鈕左旋至“-20度”使離心室預冷。
3、已裝好樣品的預冷的轉子正確安放在轉子床上。
4、關閉離心室門蓋。
5、將溫度預選鈕旋至“+4度”位置。
6、將速度預選鈕調到所需的速度值。
7、時間預選鈕調到所需的時間值。
8、按亮“BRAKE”開關。
9、待離心室溫度恒定后，按啟動開關，啟動指示燈亮，轉子開始運轉。
10、當預選的時間終止時，轉子自動減速。蜂鳴器叫后或速度降至“0”時，可以開啟離心室門蓋。取出轉子。
11、將溫度預選鈕右旋至40度，加熱化霜。
12、將速度預選取鈕加零，關閉“BRAKE”開關。
13、主電源開關扳至“OFF“位置。
14、擦干離心室水汽，擦干轉子水汽。
15、加防塵罩；進行使用登記。
16、
Heraeus離心機：根據實驗要求選定一定的程序，設置轉速、加速度、溫度等數值。詳細操作程序參見使用說明書。
IEC離心機、Mico持uge E離心機使用亦請參閱說明書，不再贅述。
附    614—E11    10KVA電子交流穩壓器使用注意事項。
1、插上電源，開啟電源開關，待遇高壓指示燈亮后（需30秒至5分鐘），電壓表應指示220V。
2、稍許后，接上負荷。
3、關機后，需間隔5分釧才能重新開機。
4、如開機后發現調節“電壓調節”鈕仍不能達到220V，應立即關機進行檢查。
5、本機使用權用過程中有較長時間間隔，應關機。
                                                   第七節       酸度計
PHS—20酸度計使用及注意事項
1、使用前請閱讀說明書，掌握電極安裝—PH校正—樣品溶液PH值或電極電位的測量程序。
2、一般情況下，一天進行一次PH 校正己能懣足常規PH測量的精確度要求。
3、玻璃電極球泡很薄，操作中防止其破碎。不要用手去摸索電極球泡，以免玻璃膜沾有油脂，影響測量精度。
4、儀器在按下“讀數”開關時發現指針打出刻度時，應放開“讀數”開關，檢查分檔開關位置及其它調節器是否適當。
5、當按下讀數開關，調節“定位”旋鈕達不到標準綬沖溶液的PH什時，即說明書電極的不稱電位很大，或被測綬沖液PH什不正確，應調換電極或溶液試之。
6、調節“溫度”旋鈕時勿用力過大，以防止移動緊固螺絲的位置，影響PH準確度。
第八節各類冰箱的使用與保養
1、根據物品的保存要求，選擇適當的冰箱貯藏。
2、依據分類存放的原則，定箱定點放置物品。
3、冰箱內存放的物品要經常整理，沒有保存價值的物品及時廢棄清理。
4、冰箱要經常除霜，以保證正常、高效的運行。每天上下班，請留心冰箱工作狀況，特別是低溫冰箱。
5、冰箱內嚴禁放置食品。
6、高溫季節注意冰箱的散熱情況，減少開門次數和縮短開門時間。
7、經常擦拭冰箱，保持冰箱清潔工。
8、詳細低溫冷藏的注意到事項參見有關章節。
第九節電泳裝置
一、電泳系列操作注意事項
1、進行各類電泳，如瓊脂糖電泳、PAGE、SDS—PAGE、IEF、WB等時，務必事先詳細設計好程序。
2、根據不同類型的電泳要求，參見有關說明書設置電泳儀的各項控制鈕。
3、依據分離物質的性質不同，選定合適的電泳種類、凝膠濃度及特殊用試劑。
4、電泳過程中，仔細觀察工作情況，切勿電泳過頭或分離不足。
5、發現故障及時報告并排除。
6、有關詳細操作程序邏輯參見有關章節及專業書籍。
二、凝膠真空干燥操作步驟
1、打開溫度定時開關，預熱加熱板。
2、放兩層Whatmann3號濾紙（或新華3號濾紙）在多孔篩板上。
3、將需要干燥的凝膠片放在一張浸濕的厚濾紙上，隨后放到多孔篩板的干濾紙上。
4、用一張薄的塑料膜鮮紙（或玻璃紙）復蓋在凝膠表面。用手指小心抹干，以除去氣泡
5、將多孔篩板及凝膠放在干燥器的鋁合金表面上放正。
6、蓋上硅橡膠板，接通真空泵，重調定時開關。
7、待凝膠干好后，關掉真空泵，揭開硅橡膠，取出凝膠（己固定在濾紙上）
附：透明膠片制作方法
      下層：半透膜（可用透析袋代）
      中層：凝膠片
      上層：塑料膜鮮紙（或玻璃紙）
   注意事項：
1、一般凝膠干燥可用法80度.但為了作放射自顯影或熒光攝影時應用60度烘干.
2、對于高膠連的聚丙烯酰胺凝膠,厚度較厚的凝膠或梯隊度膠,要防止凝膠斷裂,此時應以60度烘干為好.
3、一般凝膠在用較好的真空泵抽氣時,干燥時間約為40------60分鐘,在凝膠未宗全干燥之前不能打開硅橡膠板,否則引起凝膠斷裂.
4、用于硝酸纖維膜的干燥,不能用加勢檔,僅用真空泵抽干即可,否則能引起事故.
第十節空調機、抽濕機、微波爐
一、抽濕機使用注意事項
9、經常傾云積水槽內的水，當其內的水量達到1。85公斤時，抽濕機即自動停止工作。
濾塵網至少每兩星期即要清洗一次；機身用干布或沾有洗滌劑的濕布來抹拭槽櫥及機身，切不可用其它化學藥品洗滌。

4、不要用化學藥品如汽油、揮發性油洗滌該機，或用水沖洗之。
5、厲行節約，不需要開空調機就不要使用。人離開前，切記關機。
三、 RP-63OD微波爐使用注意事項
1、微波爐內空載時，請勿使用。
2、微波爐門未關前或門關閉不良，請勿打開開關。
3、金屬容器或物品切忌不要放入微波爐內，以防發生電火花損壞微波爐和容器。
4、不要用紙、布、毛制品包物品放入微波爐，以免損壞或引起意外事故。
5、微波爐使用后，可放入一杯水，以吸收余熱。
6、保持微波爐內外壁、門、托盤的清潔，但切記在操作后，馬上用涼水沖洗，以防破裂；微波爐使用后，應抹干內壁的水汽。
7、微波爐有故障時，切勿使用，應送專職人員檢修。
8、功能選擇：
Power  level Percentage/Output
High 100%/650w
M.High    70%/450w
Medium 50%/320w
Defrost 30%/200w
Low 15%/90w
第十節 KZBZ-40自動顆粒制冰機
1、該機由電子部分、制冰部分和顆粒冰推進部分組成，按程序工作。每小時可制冰5公斤，蓄冰量可達20公斤，24小時連續制冰，
2、本機為水冷散熱型機組，要求通風良好，離墻和其他物之間距離應大于30厘米。
3、開機前切記檢查水源是否接通，機器背面左下側的進口用橡膠管套緊并接自來水，接好扎牢后方可打開水源（注意：進水壓應在1.4-4.0kg/cm2）。
4、開啟水源后，吸需打開正面的電源開關，機器就會按程序工作。若水源停止供水時，應關閉機器。
5、在制冰過程中應關閉蓄冰室門，整機在開機15分鐘后方可出冰；1小時后取冰，這時的冰溫度最低（-8），硬度最強。
6、機器背面右側面有個放水口，接上一根30cm長的橡膠管引致一只存水盆收集制冷過程中的水滴和融化的冰水。
7、當蓄冰室冰滿后通過電子控制自動停機，當驅除部分冰后，機器又自動工作制冰。
8、整機應保持干凈，機器上面不應放雜物，嚴禁通電時搬動。
9、關機后，應關閉水源。當較長時間不使用時，應清理蓄冰室等部件。
第十一節其它儀器設備
一、 LRH-150B型生化培養箱使用說明書和注意事項
1、電源開關撥至“開”位置，電源指示燈亮，機器開始工作。
2、溫度調整：
（1）將溫度顯示開關撥至“開”，數顯表電源接通。
（2）將“整定”、“測量”共用開關撥至“整定”位置，然后旋轉溫度刻度盤，直到數顯表顯示出所需要的溫度值為止。
3、將共用開關撥至“測量”檔，
此時數顯表顯示溫度僅僅是箱內實際溫度，但此時的溫度將隨機器的工作狀態而改變，當機器達到平衡狀態，即既不加熱，也不制冷時，則數顯表所顯示數值即為所需溫度值。
電源接通后，調節好所需的溫度，這時不能隨便將控溫旋鈕來回多次旋轉，以免壓縮機啟動頻繁，造成壓縮機出現過載現象，影響壓縮機壽命。
4、若開機后，經過一段時間，加熱、制冷指示燈均不亮，則表示箱內溫度達到
平衡，等于所需溫度-補償，故加熱指示燈出現閃爍現象是正常情況，但要防止兩燈同時亮，否則表明機器出現故障，須即使檢查、理。
4、當使用溫度較低時，應定期倒掉位箱內底部接水盤內的積水。
5、箱內無需照明時，應將面板車上的照明開關置于“關”位置。
6、嚴禁用手或其它硬件碰撞、拉動箱內的控溫探頭，以免造成失控制。
7、若機器運轉出現故障如控溫失靈，不加熱或不制冷，須先切斷電源，分別檢查保險絲是否完好，再檢查相應部分。
二、 YXQ.G01.280手提式高壓蒸汽消毒使用說明
1、首次使用必須了解消毒器內物品如何包扎——堆放——（加水）——密封——加熱—— 消毒——干燥——冷卻的方法，最好是在有關
人員指導下進行操作。
2 、始終應保持消毒器內有足夠的水量（約2.5公斤）
3 、在消毒開始時一定要將汽閥開放，使消毒桶內的空氣逸去，否則會得不到良好的消毒效果。
4 、溶液應灌裝在硬質耐熱的玻璃容器內，不要灌裝得太滿，一般灌至容器的1/2~3/4容積。
5 、不允許將不同類型不同消毒要求的物品放在一起消毒。
6 、每周將安全閥開放數次，這樣可以保證安全閥處于良好的靈活狀態。
7 、壓力表使用日久后會使讀不準確，應檢修或換上新表。
8 、平時注意消毒器的清潔干燥，可以延長使用年限。
9 、消毒過程中操作者最好不要離開現場，若要離開，一定要交待他人代為看管。
10 、不同物品消毒所需時間、溫度與壓力：
消毒物類    消毒所需保溫    蒸汽壓力    表壓    飽和蒸汽相
            時間（分鐘）    （公斤/厘米）（碳/英寸）對溫度（）
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橡膠類       15             1.05 ?1.1       15?16       121
敷料類    30?45             1.05?1.4       15?20    121?126
器皿類       15             1.05?1.4       15?20    121?126
器械類       10             1.05?1.4       15?20    121?126
瓶裝溶液類  20?40             1.00?1.4       15?20    121?126
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三、其實各類儀器使用前請詳細閱讀使用說明書，這里不在一一介紹。

            第三部分  實驗室常規試驗程序
第一章組織培養及常用溶液的配制
第一節雞胚成纖維細胞（CEF）、鴨胚成纖維細胞(DEF)培養
一、材料
9?10日齡雞胚  13?14日齡鴨胚眼科剪、鑷、外科鑷、巴氏吸管、蛋架、滅菌平皿 25ml小三角瓶  Hanks＇液  0.25%胰酶液  Versene液  滅菌紗布、玻璃漏斗、0.1% 結晶檸檬酸（0.1M）或0.4%臺盼蘭,血球計數板、60ML培養瓶或60ML培養皿、滅菌蓋玻片、營養液。
二方法（CEF為例）
雞胚理：取9?10日齡雞胚直  于蛋架，在氣室部用于5%碘酊棉消毒，再用灑精棉脫色，用外科鑷擊破蛋殼用眼科鑷取出胚體放于平皿內，去喙瓜眼和內臟，用Hank＇s液洗兩次，用彎頭眼科剪剪胚剪成1-2mm的碎塊，加Hank’s液20ml,略加搖振，靜置使組織塊下沉，將混有紅血球及碎片的上懸液吸去，重復洗2—3次，直至上懸液不混濁為止。
2、消化：將0.25%胰蛋白酶溶液用5、6%NaHCO2滴定至PH7、6—7、8，加熱至37度，按組織塊量3—5倍加于裝有雞胚碎塊的三角瓶中，每個雞胚約需胰酶5ml，30分鐘取出，靜置1—2分鐘，吸去胰液，再加HanK’s液20ml，輕輕搖動后吸去，如此反復兩三次，目的是洗去殘余的胰酶。第三次加入營養液，每胚3ml左右，用粗口吸管吹吸數次，使細胞脫落分散。靜置1—2分鐘，候組織下沉后，細心將細胞懸液吸出，另置一只25ml三角瓶，如此反復數次，使細胞盡量自組織塊脫落，將多次取得的懸液合并一處，紗布過濾懸液。必須注意每次吹吸一般6—7次為宜，太多則細胞受損，消化時間要靈活掌握，不足細胞不易掊落，太久則細胞破碎。
在消化過程中，搖動時組織不易下沉即立即停止，消化后如組織粘連如涕，證明消化過度。
二、細胞計數：
取細胞懸液0.1（100ul）置盛有0.9ml10.4%臺盼藍的試管中混合,用血球計數板計數。
計算方法：
                  4大方格細胞數
每ml細胞數=——————————————X10（5）
                  4
            5中格細胞數
或每ml細胞數=——————————X10（4）
三：接種
以營養液配成每ml10（6）細胞（最終稀釋度）接種鏈霉素瓶（1ml）、60ml瓶（8—10ml），100mm  dish（10ml），60mm  dish（4ml），37度孵育48小進后形成單層，接種病毒或作次代培養。
四、CEF單層可供作病毒TCID50\LD50等指數的測定,空斑計數\病毒中和試驗等.
第二節溶液配方
一、PBS
1、無鈣鎂PBS
               50X                (Less NaCl)
1000ml             雙蒸水
10g                KCl
  60g             KH2PO4
                     60g             Na2HPO4（Na2PO4.12H2O 151g）
溶后分裝20ml管，-20 保存
20ml PBS    base 50X
8g    NaCl
0.3ml 0.5%酚紅
980ml 雙蒸水             15P 11分鐘
2、NaCl    8.0g
KCl       0.2g
CaCl2    0.1g
MgCl2    0.1g
Na2HPO4 1.15g(Na2HPO4.12H2O , 2.92g)
KH2PO4    0.2g
雙蒸水至100ml, 過濾除菌，50保存。
3、分別配制A、B、C原液
A液： NaCl       80.0g
   KCl       2.0g
   KH2PO4    2.0g
   Na2HPO4.2H2O    14.4g(Na2HPO4.12H2O 29.0g)
雙蒸水至800ml
B液：CaCL2    0.5g
   雙蒸水    500ml
C液：MgCl2    0.5g
   雙蒸水    500ml
以上三液分別 10P10’高壓蒸氣滅菌，冷卻后
A                80V
B                100V
C                100V
H2O             720V
無菌混合
注意：
各化學藥品的結晶水重量是否扣除！
二Hank’s  Solution
分別配制 A、B原液
A液：NaCL       160.0
   KCl  8.0 加入800ml雙蒸水
MgSO4.7H2O
MgCl2.6H2O 2.0
   CaCl2    2.8(溶于10ml雙蒸水)
雙蒸水加至 1000ml
B液：Na2HPO4.12H2O    3.04g
   KH2PO4.2H2O       1.2g    800ml雙蒸水
   Glucose             20.0g
0.4%酚紅液100ml
雙蒸水至1000ml，2ml氯仿防腐，4保存。
A 1V 10P 10min 滅菌
B　　1V　　10P　　10min　　滅菌
雙蒸水　　18V　　10P　　10min　　滅菌
1---4保存，可用１個月。
用5.6%NaHCO3(10P  10min  滅菌)或3.5%，調PH至7.2—7.6(加NaHCO3后須立即使用)。
三、0.4%酚紅液.
稱酚紅0.4g→置乳缽滴加0.1N  NaOH(總量11.2g/ml)并不斷研磨→所有顆粒全部溶解→100ml量瓶，將已溶后的吸入，用雙蒸水洗缽數次，倒入→加雙蒸水至100ml搖勻，4℃保存。
四、 Versene液
乙二胺四乙酸二鈉（Versene）　　0.2克
NaCL                         8.0克
KCL                         0.2克
NaH2PO4                      1.15克(NaH2PO412H2O=2.9)
KH2PO4                         0.2克
雙蒸水至1000ml,10P’,10’滅菌,4℃保存,可用3個月。
五、胰酶液Tryptase
一般配成0.25%
取0.25克溶于100mlHank’s濾過除菌,分裝小瓶.-20℃保存.用前融化加入青鏈霉素100單位/ml并用5.6%NaHCO3滴定至PH7.4-7.6
注意:
1．為避免消化細胞成團，可配無鈣胰酶液．
2．胰酶威無臭無味的白色粉末，應密封保存，陰暗處防潮解，可分裝小瓶保存．
3．胰酶液的濃度隨其活力和消化細胞的來源和種類而定．一般消化配組織用0.1%.
六.碳酸氫鈉液
取NaHCO35.6克溶于100ml雙蒸水中,使完全溶解后,經濾紙過濾后,分裝于瓶中(5ml或2ml)10P,10’滅菌.塞緊膠塞,貼上標簽,注明批號日期,4度保存備用.(在4度應為透明液,不得有沉淀).每瓶開啟后使用不得超過2次.
七.0.5%乳蛋白水解葉(LAH)
取5克乳蛋白水解物溶于100mlHank’s液中,根據需要分裝50-100ml瓶,立即10P,20’滅菌,4度保存備用,用前,用5.6% NaHCO3滴定PH7.4-7.5.
注:乳蛋白水解物極易潮解,平時必須將瓶塞緊,最好儲存于干燥器中,乳蛋白水解物含有豐富的營養成分.0.5%乳蛋白水解物溶液加入適量抗生素和血清,即可用于一般的細胞培養.
(一).CEF培養
0.5%LAH
CS       5%
Pen       100unit
Str          100ug/ml
5.6% NaHCO3調PH至7.2-7.4
(二)PK細胞培養
0.5%LAH    89.5%
CS          10%
Pen/Str       100unit/100ug/ml
八.Earle’s液
甲液:NaCL       68g
KCL          4g
      NaH2PO4                   1.4g
      葡萄糖       10g
雙蒸水至500ml,溶解后加氯仿1ml防腐
乙液:CaCL2             2.0g
   MgCL2             1.7g
0.4%酚紅50ml
雙蒸水加至500ml,0-4度保存備用,按比例配成Earle’s液.
甲    1V    10P 10’滅菌
乙    1V    10P 10’滅菌
雙蒸水 10V    10P 10’滅菌
4度保存備用,用前用5.6% NaHCO3調PH至7.4-7.5
九.抗菌素溶液(Pen/Str)
用滅菌雙蒸水配制每毫升含
Pen(青霉素)10,000units
Str(鏈霉素)10,000ug
分裝小瓶,-20度保存.一般培養液加這種Pen/Str%,最終濃度為100unit/ml.
十、199—F10生長液
199       5.49g（4.95g）
   F10       4.9g
   NaHCO3    1.7g
   S.P          1ml(10萬U/ml)
   BFS       40ml
   DDW       至1000 ml
過濾后分裝備用.
199---F10維持液:BFS僅用10ml,余者同上

            第三節配制溶液的注意事項
1使用化學藥品為A.R.級,標簽清楚,最好組織培養專用,防止使用和保存過程中的混淆和污染.
2.配制溶液的用具,需經嚴格洗刷和消毒,其配制過程盡量在無菌操作下進行.
3.稱量藥品應力求精確.配制溶液應有詳細記錄以及消毒，保存,分裝和使用情況.
4.配制的每批溶液,需經試用后,方可大量使用.因此需提前配制溶液.溶液保存有一定期限,保存時應經常檢查,發現可疑現象和過期,不得使用.
5.注意節約,計劃用多少就配多少.
  第二章  淋巴細胞雜交瘤技術及使用溶液的配制
第一節融合程序
融合方法:
1、將108 脾細胞與2—5x107 SP2/0細胞混合于1支50ml融合管中，加入30mlDMEM基礎液；
2、 1000r/m離心5分鐘；
3、吸凈全部培養液；
4、在手掌上輕擊離心管底部以打碎細胞積塊，置400C水浴中預熱；
5、用1ml吸管在45秒內加預熱至370C的50%PEG（PH8.0）1ml，邊加邊攪；
6、用1ml吸管在90秒內加20—30ml
7、20—37℃靜置10分鐘；
7、 1000r/m5分鐘；
8、棄盡上清，輕擊離心管底以分散細胞積塊，重新懸浮于80—100mlHAT培養基中；
9、按比例加入107  —2X77  腹腔細胞（約2只小鼠）；
10、分裝96孔細胞培養板，每孔0.10__0.15ml；24孔板，每孔1.0__1.5ml;
11、 7.5%CO2,37℃孵箱里培養;
12、 5天后HAT培養基換出1/2培養液;
13、 7__10天后用HT培養基換出HAT;
14、經常觀察雜交瘤細胞生長情況,待長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測.
15、其它詳細資料請參閱劉秀梵教授編<<單克隆抗體及應用>>.
第二節溶液配方
一、基礎培養液：
1、老配方    DMEM       13.37g+1000ml雙蒸水使之溶解
            丙銅酸鈉       0.11g
            碳酸氫鈉       3.6g
            pen/str          20萬/2
0． 22u過濾，分裝，4℃保存（不超過1個月）
2、新配方    DMEM基礎液：
            四蒸水          980ml       NaHCO3    3.7g
            DME(Giboo)    13.37g    S.P(100X)10ml(本實驗室用1支慶大霉素)
1NHCl調試PH至7.2_7.4(本實驗室用1NnaOH調至7.2_7.4),過濾除菌,分裝后4℃保存.
3、 DMEM完全培養基：
   30mlDMEM基礎液中加15-20ml BFS，1mlL-G（100X）即為完全培養基。
4、 HT培養基
100mlDMEM完全培養基中加入100X HT 1ml即成，或按下列配方直接配制：
         四蒸水             980ml
         DME（Giboo）       13.37g    L.G(100X) 10ml
         HT(100X)          10ml    BFS(NCS) 150_200ml
         NaHCO3             3.7g       S.P(100X) 100ml
用1NHCl調至7.2_7.4, 過濾除菌,分裝后4℃保存。
二、 100Xaminopterin（4x10（-5）M  MW=440.4）
1.76mg A+90ml雙蒸水+0.5ml 1N NaOH助溶，雙蒸水加至100ml+0.5ml 1N HCl中和,0.22um濾膜過濾除菌,分裝2ml小瓶,-20℃保存。
三、 100XHT
Hypoxanthine：MW 136 10（-5）M solution
Thymidine： MW242.2 1.6X10(-1)M solution
H和T可以配在一起，136.1mgH+100ml雙蒸水+1N NaOH至H溶解,加T38.8mg,把PH用醋酸調至9.5, 0.22um濾膜過濾除菌,-20℃保存。
四、 100Xglutamine 200Mm  Solution
2．92g       glutamine
100mlDMEM基礎液，,37℃助溶液
0.22um濾膜過濾除菌,分裝2-5ml小瓶，-20℃保存。
五、融合劑配制：PEG（Baker 1000）20-50g于三角瓶中，蓋緊，60-80℃水浴融化，0.6ml分裝于青鏈霉素小瓶中，高壓蒸汽滅菌，-20℃保存備用。臨用前加熱融化，加等量DMEM基礎液，用少許5.6%NaHCO3調PH至8.0。
第三節單抗制備技術中的其它方法
一、雜交瘤細胞的克隆化
1、制備小鼠腹腔細胞；
2、制備待克隆的雜交瘤細胞懸液；用不著5-20%血清的HT培養基稀釋后使每毫升含2.5、15、50個細胞3種不同的稀釋度。
3、按每毫升加入5X10（4）-5X10（5）個細胞的比劃，在上述雜交瘤細胞懸液中分別加入腹腔細胞；
4、每種雜交瘤細胞分裝貨6孔板一塊，每個稀釋度32孔，每孔的量為0.2ml，每孔的雜交瘤細胞分別為0.5、3、10。（或將士、3、4步改為配制15毫升HT培養基中含100個細胞，加入腹腔細胞后分裝96孔1塊）；
5、 37℃，7.5%CO2濕潤培養基7—10天，出現肉眼可見的克隆即可檢測抗體；
6、在倒置顯微鏡下觀察，標出只有單個克隆生長的孔，取上清作抗體檢測；
7、取陽性的細胞擴大培養，并凍存。
二、細胞凍存和復蘇方法
1、將對數生長期的雜交瘤細胞或其它細胞離心，重新懸浮于預冷的凍存液中（其中含10—20%小牛血清，10%DMOS的HT培養基），濃度至少5X10（6）/ml。
2、分裝安瓶，每瓶1ml，置水浴上。
3、封口后，將發瓶入入一帶收口繩的小布袋內，立即將布袋放入內襯石棉的百鐵筒內，置—70℃冰箱。
4、 2—4小時后，或過夜后，將布袋移入液氮罐。
注意：在—70℃保存時間不宜過長，一般不超過24小時。
5、復蘇細胞時，從液氮中取出安瓶，立即在37℃水浴中融化，待最后一點冰快要融化時，從冰浴中取出，置冰浴上，用5—10mlHT培養基稀釋，離心后，再懸浮于適量培養基中，裝瓶，置37℃含7.5%CO2培養箱中培養。
6、如細胞存活率不高，可加腹腔細胞進行培養。
7、細胞存取均應為高，可加腹腔細胞進行培養。
8、細胞存取均應做好記錄。
三、單抗的大量生產
1、腹腔接種降植烷（Pristane）或液體石臘，每只小鼠（2月齡以上）0.5ml.
2、7—10天后腹腔接種PBS稀釋的雜交瘤細胞，每只鼠5X10（5）/ml0.2ml。
注意：每只鼠接種細胞數不可太多或太少，否則單抗菌素產量不高。
3間隔5天后，每天觀察小鼠腹水產生情況，如腹部明顯膨起，以手觸摸時，皮膚有緊張感，即可用16號針頭采集腹水，一般可連續采2—3次，通常每只小鼠可采5—10ml腹水。

5、離心，去除細胞成份和其它沉淀物，測定抗體效價，可加防腐劑（0.01%硫柳汞或者說%疊氮鈉）小量分裝,—70℃保存。
                  第三章組織培養使用物品的準備
1、器材用后立即浸泡是很重要的事；
2、分類洗滌、處理是必要的，不妨可分為不與細胞直接接觸的器材和與細胞直接觸的器材，它的洗刷條例不盡一致；
3、厲行節約，可以重復使用的器材不應廢棄；
4、需要特殊處理的器材，如病原材料污染的器材物品，須協助洗滌人員作無害化處理；
5、高壓消毒或高溫干烤器械時，務必有人在場。
第二節玻璃器皿的準備
1、規格：組織培養用的玻璃器皿要求嚴格，以中性硬質玻璃為適宜，用于培養細胞的培養瓶更應注意選擇，一般常用的細胞培養瓶有鏈霉素瓶，方形、園形克氏瓶等。蛻2瓶的接種面應平坦，瓶口內徑力求光滑或正方形，防止瓶塞塞后漏氣。其它培養中彎頭吸管、試管、盛液瓶、平皿、吸管和注射器一般常用即可。
2、洗滌
用過的玻璃器皿，先用清水沖洗，再以肥皂或中性洗衣粉水洗干凈，浸泡于洗滌液中1—2日，取出后自來水沖洗7次，再用雙蒸水或去離子水三盆，分盆沖洗5次，并在雙蒸水或去離子水中浸泡過夜，晾干或烘干，包裝消毒。新購置的玻璃器皿在25%的濃H2SO4或3%的稀鹽酸中浸泡過夜，再進行以上洗滌、晾干、包裝、消毒。
3、包裝、消毒
小培養瓶或鏈霉素瓶可放在普通鋁制盒中，吸管在塞上棉塞后放在玻璃或金屬筒中消毒。鹽水瓶用牛皮紙包口后，160℃2小時，干熱滅菌。
第三節橡皮朔料制品的準備
1、規格：
選用質軟能耐高壓，對細胞毒性小的橡皮塑料制品。
2、洗滌：
新的橡皮塞和橡皮管首先在1%NaOH中煮沸30分鐘，然后用自來水沖洗5—7次，用雙蒸水沖洗3次，再用雙蒸水浸泡過夜色。用過的橡皮塞洗凈后，以雙蒸水煮沸30分鐘，晾干，包裝消毒。
3、包裝滅菌：
將洗滌、晾干的橡皮塞放在小鋁盒內或培養皿內。其它橡皮制品用紙包好，15P20—30分鐘。
第四節其它用品的準備
一、濾過用布：指麻布或娟布，剪成小塊，浸于丙酮中，在室溫經48小時，取出洗滌，以雙蒸水洗3次，干燥滅菌備用。
三、解剖用具：外科剪、鑷等，可用干燥滅菌，160℃2小時或于使用前煮沸消毒
5—10分鐘，每次用完后洗滌擦干。
附1 洗液配方
      配方1 重鉻酸鉀       150g
               蒸餾水       300ml
               濃硫酸       30000Ml
      將重鉻酸鉀沸水溶解，然后慢慢加入濃H2SO4，邊加邊攪拌，見發熱過劇則稍停，冷卻后繼續加，此為強洗液。
      配方2 濃硫酸    50%
               蒸餾水    50%
               重鉻酸鉀 5%
      此為中等強度洗滌液
      配方3 重鉻酸鉀    100g
               蒸餾水       1000ml
      加熱溶解，冷卻后緩慢加入工業硫酸100ml，此液為弱洗液，為棕紅色，使用此液時，必須預熱先用肥皂水將玻璃器皿洗凈，經自來水沖洗瀝干，然后才能浸入，否則該洗液很快失效。
      盛洗滌液的容器要堅固，操作時要穿橡圍裙，長筒膠靴，戴上眼鏡和厚橡膠手套，以保安全。
      洗滌一旦變綠，表示鉻酸已經還原，失去了氧化能力，不宜再用。如將這樣的洗液加熱，再加適量重鉻酸鉀，可重新使用。
附2、玻璃器皿的硅化處理可以防止細胞粘附或提純物質損耗在離心管可吸管上。下述的是溶硅的操作條例。
1、工作液由1份硅膠加100份水制成。如要硅化大約24個15ml的離心管和200個用后便丟棄的巴氏吸管時，可準備600—800ml的工作液。
2、在硅化前所有玻璃器材必須清潔和干燥，將溶液倒入離心管，放置至少5分鐘。傾出，水沖洗2—3次。將巴氏吸管放滿一個大燒杯，將硅膠傾倒在它的上面，直至所有吸管都有充滿為止。放置至少5秒鐘，將溶液傾出，用水徹底沖洗吸管。工作液不可再用。
3、室溫中氣干器皿24小時，放入玻璃器皿干燥箱內，時間可較短。
第五節純水制備程序
1、細胞培養用水必須使用三蒸餾或四蒸餾水，而大多數去離子水和常規一次蒸餾水一樣不適于作為與細胞接觸之用。
2、四蒸水的制備，通常用去離子水，在雙重石英蒸餾器中蒸餾2次，以達到純凈的目的。
3、去離子水通常用一次蒸餾水，經離子交換樹脂處理，并檢查水質情況：水質清亮，一般電阻大約10萬歐姆/cm，最高可達100萬歐姆/cm；5%AgNO3檢不出氯離子，PH8—10。
4、離子交換柱必須安裝在環境溫度最高不超過40℃，最低不能低于0℃地方。
5、新樹脂預處理方法：
（1）工業性生產的離子交換樹脂出廠時難免有一些雜質，在使用前應先用清水沖洗，洗至水質清亮。
（2）用4%HCL、4%NaOH（濃度不能超過6%）交替處理，在酸堿之間大量水洗，如此反復處理三次，即：酸一水，堿一水，反復進行，每次酸堿用量為樹脂體積的2倍。在交換柱中動態進行，如在容器中處理應采取少量多次。
（3）最后一次，陽性樹脂應用酸處理使其成為H 型，所用酸量應加倍，水洗手去離子水。陰性樹脂應用堿處理使其成為OH型，所用堿量應加倍，水洗用去離子水。
6、經常以4—5%HCL再生陽性離子柱，（001X7強酸樹脂）用量為樹脂體積的2—3倍。以
   4—5%NaOH再生陰離子柱。（201X7強堿樹脂）。

            附：A實驗室用純水質量表

精制方法
精制水的電阻率（歐姆.厘米）
純水的理論值
蒸餾水
玻璃容器一次蒸餾
玻璃容器三次蒸餾
石英容器三次蒸餾
石英容器23次蒸餾
復床式
混合床式
1.83X10（7）
1.0X10（6）
5.0X10（5）
1.0X10（6）
2.0X10（9）
1.6X10（7）
1.0X10（4）
1.8X10（7）
         附B實驗室分析用水標準
序號

項目
指標
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13 外觀
PH
蒸發殘渣（mg/l）
灼燒殘渣（mg/l）
氨及銨鹽（NH4）（ng/l）
碳酸鹽（CO2）（mg/l）
硫酸鹽（SO4）（mg/l）
氯化物（CL）（mg/l）
硝酸鹽（NO2）（mg/l）
硅（mg/l）
鈣+鎂（mg/l）
重金屬（mg/l）
導電率（Ω）無色透明，無臭無味
5.4—6.6
<5
<1
<0. 05
<0.2
無
無
無
無
<0. 1
無
8X10(-6)—5.8X10(—8)

第六節新生犢牛血清的制備
1、胎牛或出生24小時風的新生犢牛適用。
2、將小牛確實保定于手術臺上，注意頭部的保定；剪去頸部胎毛，充分暴露頸靜脈部位，以碘酒棉球、酒精棉球消毒手術部位。
3、沿頸靜脈上緣切開皮膚，鈍性分離其下各種軟組織，暴露頸動脈。
4、仔細分離頸動脈一側的迷走神經，駁去動脈管上的包膜。
5、在遠心端和近心端用止血鉗夾住頸動脈管，以手術刀尖切開動脈管，向心插入導管。
6、收集血液前，去掉近心端的止血鉗，棄掉起先流出的幾滴血，然后小心插入收集血瓶內，注意導管沿瓶壁放血，同時減少搖動收集瓶的次數。
7、待血液凝固，血清析出棄分后（但時間不能太長，特別是室溫較高時，以免溶液血），離心分離血清。
8、以0.22U微孔膜過濾血清,分裝,標明制備日期,制備人.
9、于56(度)滅能30分鐘,做法是將血清入水浴箱后,然后將水浴溫度調至56(度),溫度達到56(度)時,計時30分鐘.。
注意：不要先將水浴溫度調至56（度）再滅能血清，這樣時間無法計算。
10、待血清冷卻后，置于20（度）冰箱保存備用。
第四章酶聯免疫吸附試驗（ELISA）的程序
第一節間接ELISA試驗
一用可溶性抗原的ELISA：
1、純化抗原：用包被液稀釋至1—20ug/ml；
2、以50—100ul/孔量加入酶標板孔中；
3、置4（度）過夜或37（度）吸附3h；
4、 PBST洗三次；
5、每孔200ulPBS/NCS  4（度）過夜封閉或37（度）封閉3h；
6、 PBST洗5次，每次1min（包被板可—20（度）或許（度）保存備用）
7、每孔加50—100ul第一抗體，同時設陽性、陰性對照。若雜交瘤篩選，每孔加雜交瘤培養上清；
8、 37（度）孵育2h
9、 PBST洗5次，每次5min
10、每孔加50—100ul酶標第二抗體；若雜交瘤篩選，每孔加HRP標記的抗小鼠（IgG+IgM）抗體；
11、 37（度）孵育2h
12、 PBST洗5次，每次數5分鐘；
13、每孔加OPD 或TMBS底物100ul
14、 37（度）避光作用；（OPD為10—20）分鐘，TMBS為40分鐘）；
15以50ul2MH2SO4終止反應，在酶聯免疫閱讀儀上讀取OD值（OPD底物選用490nm濾光片，TMBS底物選用450nm濾:光片）；
16結果判定：
（1）P/N≥2.1       為陽性
  (2) P≥N+3SD       為陽性
  成功范例:NDV單抗檢測，粘附素單抗檢測，H單抗檢測亞類鑒定和雞白痢檢疫等。
二、用全菌抗原的ELISA法
（一） GA法
1、新鮮培養的細菌用蒸餾水懸浮，光密度法或比濁法調整細菌濃度至1X10（6）個/ml。
注意：沙門氏菌等人畜共患病原體，使用前必須滅活或采用市售的滅活診斷菌液；
2、酶標板中加200ul/孔，5%戊二醛（GA）溶液（0.1M  NaHCO4 95ml+25%DNY戊二醛溶液5ml）;37(度);2小時
3、蒸餾水洗5次;
4、加細菌懸浮液,50ul/孔;
5、 37(度)溫箱內過液,干燥吸附(20—24h)
6、加PBS/NCS  220ul/孔37（度）封閉3小時或4（度）過夜封閉；
7、 PBST洗5次（—20（度）或4（度））存放備用；
8、以下步驟同一。
（二） MA法
1、細菌懸液（1X10（6））50ul/孔；
2、室溫或37（度）干燥吸附；用甲醇（MA）固定；室溫10分鐘；
3、加PBS/NCS封閉，37（度）3小時或4（度）過夜；
4、 PBST洗5次（于—20度或4度保存備用）；
5、以下步驟同一
成功范例：H單抗檢測等。
三、用全細胞抗原的ELISA
1、按常規方法培養細胞，接種病毒，收獲感染細胞和未感染的細胞，進行細胞計數，用PBS制成適當濃度懸液；
2、加100ul/孔細胞懸殊浮液于酶標板內，使每孔含細胞5X10（）
3、將板離心1000rpm10分鐘，甩去上清，室溫干燥（可保存在4℃或—20℃備用）；
4、 PBST冼3次，每次5分鐘；
5、每孔加100ul第一抗體或雜交瘤上清，設立對照；
6、 37℃1—2小時；
7、 PBST洗3 次；
8、每孔加入100ul酶標第二抗體，37℃1—2小時；
9、 PBST冼5次；
10、每孔加入100ul底綬沖液，室溫作用30分鐘；
11、判定結果。
      成功范例：粘附素單抗，O抗原單抗檢測等。
      注意：若需要，可滅活細胞內源酶，以減少本底反應。其它方法參見本章第六節。
第二節直接ELISA
1、可溶性抗原或全菌抗菌素原（用量以方陣試驗確定）包被標板（50—100ul/孔）；
2、PBS/NCS封閉板（保存備用）；
3、每孔加50—100ul酶標抗菌素體；設立陰性、陽性對照；
4、 37℃孵育2h
5、 PBST洗5次，每次5分鐘；
6、以下同間接ELISA；
  成功范例：沙門氏菌檢驗、抗血清效價測定、酶標抗體效價測定等。
第三節夾心ELISA試驗
1、單一或混合單抗腹水或純化的免疫血清用包被液稀釋后25—100ug/ml；（有人使用蒸餾水直接稀釋腹水作包被）。
2、以50—100ul/孔量加入酶標板中；
3、置4℃過夜吸附或37℃吸附3h
4、 PBST 洗3次；
5、 PBS/NCS封閉，200ul/孔，4℃過夜或37℃3h；
6、 PBST洗滌5次，每次1min；（可于—20℃保存備用）；
7、每孔加50—100ul待檢抗原，同時設立陰、陽性對照；
8、 37℃孵育2h；
9、 PBST洗5次，每次5min；
10、每孔加50—100ul酶標單抗或酶標純化抗體；
11、 37℃孵育2h；
12、 PBST洗5次，每次5分鐘；
13、 37℃孵育2h
14、 PBST洗5次，每次5min；
15、以下步驟同前。
      成功范例：雞新城疫病毒，大腸桿菌，沙門氏菌檢測。
第四節競爭ELISA試驗
1可溶性抗原以包被液稀釋至1ug/ml（需方陣滴定確定），（全菌抗原包被方法參見前述）；
2、50—100ul/孔，包被酶標扳；
3、4℃過夜吸附；
4、PBST洗3次。每次5分鐘；
5、PBS/NCS封閉200ul/孔，37℃3hr或4℃（保存備用）；
6、PBST洗3次，每次5分鐘（可—20℃或4℃保存備用）；
7、加50—100ul/孔待檢血清樣品，再加入50—100ul/孔單抗，設立對照；
8、 37℃孵育1—2h；
9、 PBST洗5次，每次5分鐘；
10、每孔加OPD50—100ul；
11、 37℃避光作用10—20min；
12、以100ul/孔加2M H2SO4終止反應，測定OD490；
13、判定結果：
（1）抑制率（N—P/N）》50%判為陽性；
（2） OD490值《NCX  Ⅹ0.3+PCX X    0.7為陽性(PCX為陽性對照的平均值,NCX為陰性對照的平均值)。
成功范例：檢測傷寒、雞白痢抗體等。
第五節 Dot—ELISA
1、根據實驗要求不同，選用硝酸纖維膜，混合膜或醋酸膜，并切成條帶，以硬模壓痕跡；
2、以蒸餾水或TBS浸泡膜條帶，取出晾干后備用；
3、抗原包被：
（1）、可溶性抗原（ug/ul），每點點加5ul，37℃烘干；
（2）、全菌抗原（1X10（6）/ml），每點點加5ul；37℃烘干，可先將條帶經5%GA處理后，37℃3h或4℃過夜，再加樣烘干。
4、 TBS/NCS或BSA封閉；
5、漂洗；
6、將膜轉入酶標抗體內，37℃0.5-2h;(間接法步驟是:先于第一抗體中浸染漂洗后，轉入酶標第二抗體中反應)。
7、漂洗；
8、把膜置入DAB或4—氯—1—萘酚底物中顯色，室溫10—30分鐘；
9、漂洗；
10、晾干后，判讀結果（可以進行掃描分析）。
成功范例：脂多糖抗原檢測，大腸桿菌檢測，單克隆抗菌素體篩選等。
第六節酶標組化法
1、抗原準備：
（1）細胞涂片：
（2）病變組織觸片或冰凍切片；
（3）生長細胞的培養孔或玻片；
2、 4℃丙酮固定10分鐘；
3、滅活內源酶：
將待檢玻片浸入內源酶滅活液內，或于培養孔內加入內源酶滅活液，室溫滅活30分鐘，棄去滅活液，以PBS和去離子水充分洗滌10—20分鐘，自然干燥；
4、以PBS/NCS封閉，37℃2小時或4℃過夜；
5、酶染：加酶標抗體反應（或間接法步驟進行）37℃1—2小時，并設立對照；
6、 PBS洗15分鐘表；
7、以DAB顯色，室溫避光30分鐘；
8、鏡檢：細胞漿呈棕黃色，細胞核無色，陰性對照無色，判為陽性。（4—氯—1—萘酚顯色）。
成功范例：豬瘟組化法診斷。
第七節 ELISA常用溶液的配方
一、包被液
1、碳酸鹽綬沖液
0.2M  Na2CO3: 12g無水Na2CO3+100ml去離子水
0.2M NaHCO3：1.68g  NaHCO3+100ml去離子水
取0.2M  NaCO3：8ml，0.2M  NaHCO3:17ml混合再加75ml去離子水,調PH至9.6。
2、 Tris—HCL綬沖液（PH6.0,0.02M）
0.1N    Tris       100mｌ
0.1N    HCL       58.4ml
培養離子水加至1000ml
(Tris MW       121.14)
3、其它包被方式，如（GA、MA、BSA等方法，請參閱有親章節和文獻。
   二、稀釋和封閉液
1、 EPBA（PH7.2）
NaCL    80g          Na2HPO4.12H2O    14.5g
KCL       2g          KH2PO4                      2g
去離子水10升
2、 EPBS/Tween—20/NCS：
EPBS+0.05%Tween—20+10%NCS  or  ！%BSA
      3、Tris—HCL綬沖液       PH7.0 0.01M
               0.1M  Tris    50.0ml
               0.1N HCL    46.5ml
               NaCL          8.5g
               BSA             50g
               正常山羊血清150ml檬酸:
               去離子水1000ml
   三、洗滌液
1、 EPBS/Tween—20
EPBS+0.05%Tween—20（或80）
2、 Tris—HCL/Tween    PH7.4    0.02M
1.0M       Tris          20ml
1.0N          HCL       15ml
1.0N          HCL       15ml          調PH至7.4
Tween—2.0             0.5ml
DW          加至于1000ml
   四、底物溶液
1、磷酸鹽—檸檬酸綬沖液（NO.1）
0.1M 檸檬酸:10.5g C6H6O7.H2O+DDW500ml
0.2M Na2HPO4.12H2O+DDW1000ml
取24.3ml0.1M檸檬酸、25、7ml0.2M  NaHPO4再加50mlDDW
注:檸檬酸溶液及配成的底物綬沖液不穩定,易形成沉淀,因此一次不宜配制過多。
2、 OPD（鄰苯二胺）底物
NO.1底物綬沖液       10ml
OPD                            4mg
3%H2O2                      40ul
3、 TMBS（四甲聯苯胺硫酸鹽）
TMBS貯液：10mg/ml    DMSO    4℃避光存放。
TMBS貯液    100ul
NO.1底物綬沖液       10ml
1%H2O2                      25ul
      4、0.05M PH  7.6 Tris_—HCL緩沖液
            0.1M       Tris                   50ml
            0.1N       HCL                38.5ml
            DW至100ml
      5、TBS    buffer       （NO.2
            20 Mm          Trisbase
            500Mm          NacL
            adjusted to       PH7.5    With    HCL
6、 DAB（二氧基苯胺鹽酸）底物
DAB       75mg
NO.2底物綬沖液100ml
避光攪拌3小時,使其溶解,濾紙過濾.臨用前加1%H2O2  0.5ml
      7、4—氯—1—萘酚底物（4CN）
            (1) 4CN貯液：3mg    4CN溶于是ml甲醇中，4℃保存；
         (2) 使用液：2ml  4CN貯液+10mlTS buffer+H2O2至0.01%(V/V)
7、酶反應終止液
2m H2SO4
濃H2SO4    10ml溶于80ml  DW
六、內源酶滅活液：
      0.01%H2O2,NaN,PH7.6 0.05M  Tris—HCL綬沖液：
      取PH7.5 0.05M  Tris—HCL綬沖液98ml，加1%H2O21ml  1% NaN 1ml即成。
第八節酶標抗體的制備
一、 1、          試劑
1、 0.1M NaHCO3：0.84gNaHCO3+DDW  100ml
2、 0.1M Na2CO3：1.06g Na2CO3-DDW 100ml
3、 EPBS：同第七節
4、 10mM NaIO4  204.0mg NaIO4+DDW 100ml
5、 0.1mM NaOH
6、 5mg/ml NaBH4：0.1g NaBH4+0.1mM NaOH  20ml
二、 HRP直接標記腹水中單抗
1、 5mg HRP溶于0.5ml 0.1M NaHCO3
2、加0.5ml 10mM NaIO4，混勻，蓋緊瓶塞
3、室溫（20℃）避光作用2h
4、加0.75ml 0.1M NaCO3，混勻
5、加0.75ml小鼠腹水，混勻
6、用少許PBS將交聯物轉移到一支下口具玻璃棉的5ml注射器外筒中
7、加Sephadex G15或50干粉0.5g，混勻。蓋緊，室溫作用（避光）3h
8、用少許PBS將交聯物全部洗出
9、收集洗出液，加1/20V新鮮配置的5mg/ml NaBH4溶液，混勻，室溫作用30分鐘
10、再加3/20V NaBH4溶液，混勻，室溫作用1h或4℃過夜
11、將交聯物過Sephdex G200或Sepharose 6B（2.5*50cm）層析純化，分管收集第一峰
12、酶結合物質量鑒定：
（1）克分子比值測定
酶量（mg/ml）=OD403*0.4
Ig量（mg/ml）=（OD280-OD403*0.3）*0.62
酶結合物克分子比值（E/P）=酶量*4/IgG量
標記率=OD403/OD280
E/P值為1-2之間合格
（2）特異性及效價測定：應用ELISA同時確定酶結合物的特異性，酶活力，抗體活性及效價。
將酶結合物對倍稀釋后平行加于陰性孔及陽性孔，合適底物顯色后記錄各個稀釋度的特異及非特異顯色值，繪制特異及非特異反應曲線，比較二條曲線可以確定其特異性，酶活力及抗體活性。特異顯色為1.0時的稀釋倍數，一般可作為交聯物的效價。實際使用濃度應適當升高2-5倍。
13、酶標記抗體的保存：加等量甘油（A.R）后，-20℃存放。
三、 HRP標記提純抗體制劑：（純化抗體請參見有關章節）
（一） HRP 的活化
1、 5mg HRP（RZ>3.0）溶于0.5ml新配制的0.1M NaHCO3試管中；
2、在上述溶液中加入0.5ml 10mM NaIO4，試管加塞塞緊，20℃暗處放置2h
3、加0.1ml 0.1M Na2CO3以減慢氧化
（二）標記
1、用0.1M Na2CO3（Ph9.2）（1-2ml）配制15mg Ig溶液
2、將Ig溶液加入HRP溶液（HRP：IgG分子比為1：2）
3、立即將IgG-HRP混合液移入5ml注射器外筒（下口塞有玻璃棉，并接上橡皮帽），加入混合液重量的1/6  Sephadex G25或50干粉；室溫3h或4℃過夜
（三）穩定化
1、用少許PBS洗脫酶標記物
加入1/20V的NaBH4酶標記物中；室溫作用30分鐘，加入3/20V的NaBH4，室溫作用1h（可與4℃過夜）
（四）提純同前。
（五）酶結合物質量鑒定及保存，同前。
成功范例：酶標記大腸埃希氏菌粘附素單抗，沙門氏菌O、H抗原單抗，NDV單抗，羊抗鼠Ig抗體等。

第五章免疫熒光試驗程序
第一節間接免疫熒光試驗
一、抗原制備
1、固定細胞片的制備：
生長在蓋片上的細胞（接種或未接種病毒），可直接收獲蓋片，在PBS中洗滌，用4℃100%丙酮固定2分鐘，空氣干燥，置密封容器于—20℃保存備用；單元細胞懸液可在蓋片上制成涂片，固定方法同上。
2、單細胞懸液制備：
用含0.1—1%BSA和0.1%的疊氮鈉的PBS洗2—3次。注意所有各步需在4℃進行！經細胞計數，調節細胞濃度至10（7）/ml，可供作活細胞的膜熒光染色。
3、細菌涂片的制備：
將10ul細菌懸液（1X10（6）個/ml）涂沫7X21mm蓋玻上，自然干燥后，用—20℃丙酮固定10—15分鐘，于—20℃保存備用。
4、病變組織觸片的制備，按常規方法。
5、病變組織冰凍切片的制備。
二、抗體染色及結果觀察
1、蓋片在去離子水中濕潤后置架上滴加10—20ul雜交瘤上清或其它待檢樣品，設立陽性、陰性對照。
2、 37℃水浴孵育0.5—1h。
3、蓋片在PBS（PH7.4,0.01M）中用磁力攪拌器洗滌15分鐘.
4、取出蓋片置架上,滴加工作濃度己測定的熒光第二抗體.
5、 37℃孵育0.5—1h。
6、洗滌15分鐘。
7、取出蓋片，用延緩熒光猝滅的封載劑封存于干革命凈玻片上。
8、在熒光顯微鏡下觀察：
陽性結果：可在細胞漿，或細菌外周，或細菌粘附素鞭毛等可見特異性熒光（FITC為黃綠色熒光）。
成功范例：粘附素單抗檢驗，O抗原單抗檢驗、NDV單抗檢驗、NDV診斷等。
附一：活細胞的膜熒光染色
1、在小試管中加入100ul單細胞懸液后，再加100ul第一抗體，并混勻。在冰浴上孵育30—60分鐘。
2、將細胞重新懸殊浮1—5ml洗滌劑中，以400g離心5分鐘洗滌，重復一次。
3、以100ul洗滌劑懸浮，加工廠100ul熒光抗體，置冰浴30—90分鐘。
4、洗滌2次
5、將細胞重新懸浮于20—30ul含水量10% 甘油，10—100ug苯二胺（）ml的洗液中（PH7.0左右）滴于載玻片上,加蓋玻片封載.
6、立即在顯微鏡下檢查,細胞亦可在染色后用1%多聚甲醛生理鹽水固定,立即檢查,或至少在4℃可保存一周.
成功范例:NDV單抗膜熒光染色
      附二:
1、雙重染色:標本中有兩種不同抗原,可用FITS和RB200,分別標記兩種抗體,同時或先后反兩種熒光抗體進行染.                   2、反襯染色：對于組織標本，為了加強特異性熒光的鮮明性，常需使用反          襯染色。最常用者為伊文氏藍（1：10000—1：100000），它發射紅色熒光，可反襯出FITC的黃綠色熒光。
附三：
1、 PH7.4  0.1M磷酸緩沖液
      Na2HPO4.12H2O             28.94g
      KHPO4                               2.6g
         DW                                  1000ml
應用時取上述貯存液100ml,加入NaCL8.5g,加DW至1000ml,即為PH7.4  0.01M  PBS.
                     2、緩沖甘油
                     SoL.Ι
                              甘油(A.R.)          9份
                                 PBS                   1份
                     SoL Ⅱ
                                 甘氨酸             0.42g
                                 NaOH                0.021g
                                 NaCL                0.51g
                                 NaN                   0.03g
                                 D.W.                   至30ml
                                 加入                   70ml
第二節直接免疫熒光試驗
1、抗原制備同前
2、加染熒光素標記的特異抗體。
3、 37℃溫育30—60分鐘。
4、洗滌15分鐘。
5、取出蓋片，完全干燥后，用封片油封于干凈的勒玻片上。
6、鏡檢
成功范例：沙門氏菌快速檢驗，NDV診斷。
第三節熒光抗體的制備
一、試劑
1、 PH9.3碳酸鹽緩沖液
無水Na2CO3    8.6g
NaHCO3             17.3g
D.D.W                1000ml
2、 PBS（PH7.4，0.01N）同前
3、二甲基亞砜
二、標定程序
1、以碳酸鹽緩沖液調整蛋白濃度至10mg/ml；（腹水單抗可直接用碳酸鹽緩沖液稀釋；提純的抗體IgG，需經SephadexG25柱層析或透析方法轉換緩沖體系至碳酸鹽緩沖液）。
2、取代5ml抗體溶液于10ml小燒杯內，磁棒輕攪。
3、稱取1mlFITC溶解于0.2mlDMS中。
4、待溶解后立即緩慢滴加于抗體液內。
5、 20℃閉光作用2h，可不攪拌。
6、將交聯反應后的溶液經SephadexG25或G50柱析層除去游離的熒光素。
7、收集第一峰為標記的抗體。
三、FITC結合物質量鑒定
1、測定F/P比值：
                                 OD100-0.35XOD495
[IgG]（mg/ml）=——————
                              1.4X
F/P=2.87
抗IgG熒光抗體F/P比不宜高于1---2；抗細菌熒光抗體F/P可允許高于2，乃至高標記（F/P10——15）。
2、特異性及效價測定
以標記抗體染色各種抗原的蓋片，同時測定其特異染色滴度和非特異染色滴定，并觀察抗體活性。
         四、標記抗體的保存
            標記抗體宜保存于4℃；
            或加50%甘油（A.R），-20℃凍存。
            成功范例：沙門氏菌O抗原單抗標記，羊抗雞IgG的標記抗體的制備等。

第六章間接血凝試驗的程序
第一節脂多糖敏化甲醛化綿羊紅細胞的制備
一、甲醛化綿羊紅血球制備：
（一）醛化血球試劑：
1、PH7.2 PBS
         NaHPO4.12H2O             3.5816g
         KH2PO4                            0.4082g
         NaCl                                     8.014g
      D.W.                                     1000ml
3、雙倍離子強度的PH7.2PBS
Na2HPO4.12H2O                         0.3581g
KH2PO4                                     40.82g
NaCl                                              0.814g
D.W.                                                 50ml
4、抗凝保存液（即Alsever氏液）
枸椽酸鈉                   0.8g
枸椽酸辣                      0.055g
氯化鈉                         0.42g
葡萄糖                         2.05g
D.W.                               1000ml
5、甲醛（A.R.或C.P.）:臨用前用雙倍離子強度的PBS作對稀釋,配成20%的甲醛。
6、飽和硫酸銨溶液：按25℃飽和溶解度配制。
               （二）、步驟：
1、無菌采集綿羊頸靜脈血50ml，用要枸椽酸鈉作抗凝劑；
2、用5倍于紅細胞壓積的PH7.2PBS充分洗滌5次,每次1500rpm5___10分鐘,直至上清測定無蛋白質(用飽和硫酸銨滴定上清,觀察有無白色沉淀),再以相同緩沖液配制成25%SRBC懸液;
3、 25%SRBC與20%甲醛以25:1的比例混勻,37℃水浴作用2小時;每15分鐘振蕩一次,紅細胞顏色由紅色轉變為棕色;
4、取出,以PH7.2PBS洗滌4次,每次2000rpm10分鐘,再加同樣的PBS,制成25%SRPB;
5、重復第三步醛化一次,同法洗滌;
6、最后配制相當于20%醛化SRBC懸液,并加入侵.3%甲醛(最終濃度)或者0.01%硫柳汞防腐,分裝,4℃保存備用.
二\脂多糖抗原制備___熱酚水法
1、菌泥懸浮于100ml水中，或20g菌粉懸于350ml水中；
2、將新配的90%（V/V）苯酚（最好是新蒸的）預熱至68℃—70℃；
3、加酚液于菌液中，至酚的最終濃度為45%，68℃水浴作用25分鐘，并充分振蕩；
4、冷卻至10℃左右，12000rpm30分鐘，離心管內分層情況依次是：水層、蛋白質層、酚層和沉淀物。
5、小心吸取上清，（準備透析袋）
6、余下部分再加水80ml，68—70℃水浴維持30分鐘，冷卻至0℃左右，離心吸水層；
7、將水層提取物裝入透析袋，流水透析1天，蒸餾水透析2天；
8、收集粗品LPS，凍存備用。
   三、蒽酮比色定糖法—測定粗制LPS的多糖含量。
1、原理：蒽酮可以和游離的或多糖中存在的己糖果，醛戊糖及己糖果醛酸起反應，反應后溶液顯藍綠色，于620nm處有最大吸收。
2、試劑：
（1） 2g/L蒽酮試劑：溶解2克蒽酮于濃硫酸（A.R. d=1.84,95%）,宜當日配制使用.
（2） 0.1g/L葡萄糖溶液或0.1g/L糖元溶液.
      3、實驗步驟
（1）標準曲線制備

管號                            1          2             3             4             5             6                7             備注

標準葡萄糖液       0.05          0.10       0.20       0.30       0.40       0.60             0.80    置水浴中
蒸餾水                   0.95          0.90       0.80       0.70       0.60       0.40             0.20    置水浴中
蒽酮試劑                3.0             3.0          3.0          3.0          3.0          3.0                3.0
沸水浴             蒽酮加入后，將試管移入沸水浴，煮沸10分鐘，冷卻至室溫
測定OD820值
含糖量                   5                10          15          20          25          30                35
繪制標準曲線：以OD820為縱坐標，糖含量（ug/ml）橫坐標繪制標準曲線。
或以統計方法，求出糖含量與OD820之間的相關系數，及直線回歸方程。
（2）樣品含糖量測定：
   取1ml稀釋的粗制LPS，加速度。3.00蒽酮試劑,混勻后迅速置于冰浴冷卻.然后轉入沸水浴中煮沸10分鐘表（與制備標準曲線同時進行）。冷卻至室溫后，測定OD820，從標準曲線中查找相應糖含量，或代入回方法求得糖果含量。
四、脂多糖抗原致敏甲醛化SRBC
1、取粗制LPS，加0.2M  PH8.0  PB液,調整多糖濃度至120ug/ml,100℃水浴 1小時.
2、冷卻至少37℃;
3、配制6%醛化SRBC溶液;
4、將熱處理LPS與醛化SRBC等量混合,37℃攪拌作用45分鐘;
5、取出離心2000rpm10分鐘,以0.01M PH7.2PBS洗澡4次;
6、配制4%致敏血球,分裝,保存于4℃備用.
7、致敏血球質量鑒定:
（1）自凝性測定：血球制備過程中，洗滌不徹底，或過度化等，都可引起血球的自凝。
（2）特異性測定：與不同抗體試劑反應，確定其反應特性。
（3）工作濃度測定：選擇最佳最省的致敏SRBCIPYA。
附0.2MPH8.0PB溶液.
基礎液A       0.2Mna2HPO4
               Na2HPO4.2H2O(MW353.22)    35.61g
               或  Na2HPO4.12H2O(MW352.22)  71.6g
               DW                         1000ml
基礎液B       0.2M  NaH2PO4
               NaH2PO4.H2O(MW138.01)       27.6g
               或NaH2PO4.2H2O(MW156.03)    31.21g
               DW                         1000ml
使用液:       A液94.7ml  +B液5.3ml
成功范例:沙門氏菌脂多糖抗原敏化SRBC制備,及其在單抗檢測、雞白痢等檢疫中的應用。
第二節蛋白質敏化SRBC的制備
一、雙醛化紅細胞制備
1、采綿羊抗凝血；
2、用10倍于紅細胞壓積的0.11MPBS(PH7.2)洗4—6遍；
3、用同一PB配成8%SRBC；
4、配制醛化試劑：
   丙酮醛       3ml
   甲醛          6ml
   0.11MPB液(PH7.2)    94ml
5、將醛化試劑緩慢加入等到量的8%SRBC中；
6、室溫（20℃）緩慢攪拌17小時；
7、 PB洗三次；
8、配成20%雙醛化SRBC，加0.1%NaN2防腐,4℃保存備用.
附:醛化紅細胞的鞣酸處理亦能吸附蛋白,但其敏感性很低;經鞣酸化后,紅細胞吸附蛋白質的量顯著增加,但同時加強了紅細胞的不穩定性,(請根據要求確定是否要鞣酸化).,容易自凝,但增強了反應的敏感度.可用1%正常免疫血清穩定之.
1、將醛化紅細胞配成2.5%懸液;
2、加入新鮮配制1:10000稀釋的鞣酸溶液 ;
3、混勻后置37℃水浴15分鐘;
4、洗滌后再配成品2.5%懸液.
二、抗原致敏
1、取20%雙醛人紅細胞 01ml,1500g離心棄上清
2、 ;沉積紅細胞加0.2M  PH4.醋酸—醋酸鈉緩沖液1ml，并加最適濃度（預先要測定，蛋白抗原為50ug/ml左右）的抗原1ml
3、混勻，于45℃致敏35分鐘，不時輕輕搖動使紅細胞不下沉；
4、離心棄上清，并用20倍紅細胞壓積的PB 洗4次；
5、配成1%致敏血球，4℃冰箱保存備用。
成功范例：粘附素致敏感SRBC。
第三節 PHA試驗程序
1、 V型微量血凝板上每孔加入PH7.2PBS稀釋液25ul(一滴),一個樣品做一排;
2、加入25ul雜交瘤培養上清液或其它待檢血清,依次作倍比稀釋;同時設立陰性,陽性對照;
3、再加入0.5—4%致敏血球1滴；
4、將血凝板在振蕩器上，振蕩30秒；
5、置室溫半小時觀察結果。
第七章免疫膠體金試驗程序
1、取樣：銅網沾取細菌懸液（80億/ml）；
2、漂洗：PH7.4  0.05M  TBS,三次,每次5分鐘;
3、第一抗體(單抗)反應:與一定稀釋度的抗體應,37℃半小時;
4、 PH7.4  0.05M  TBS漂洗
5、 ;與兔抗鼠IgG37℃作用半小時;
6、先PH7.4  0.05M  TBS漂洗三次,每次分別再用PH8.2  0.02M  TBS漂洗三次,每次5分鐘
7、 ;與羊抗兔膠體金(陜西省中醫藥研究院)（1：10）稀釋液作用，4℃過夜，（或用SPA膠體金，寧軍區醫院）；
8、先用PH8.2  0.02M  TBS漂洗三聯單次,每次5分鐘,再用PH7.4  0.05 TBS 漂洗,每次5分鐘;
9、晾干后電鏡觀察.
成功范例:大腸埃希氏菌粘附抗原定位,沙門氏菌O抗原、H 抗原定位。
附：
一、負染色：常規電鏡負染色法，細菌懸液濃度8億/ml，1%PTA染色30秒鐘。或銅網經0.02%GA室溫處理30分鐘,然后吸干,滴加培養菌液或提取抗原,用1%磷鎢酸染30秒,晾干后電鏡觀察.
二、免疫酶染色：
1、同前
2、同前
3、同前
4、與羊抗BALB/C小鼠IgG酶標抗體作用，37℃半小時，經PH7.4  0.05M  TBS漂洗后,與底物溶液作用5—10分鐘，漂洗，晾干后電鏡觀察。
附：1、底物溶液：PH7.6  0.05M  Tris—HCL緩沖液
0.125%  DAB
0.03% H2O2
3、 1%BSA：以PH7.4  0.05M  TBS配制

第八章免疫球蛋白亞類測定的程序
第一節免疫擴散法
單抗類和亞類鑒定的常用方法
一、試劑
1、0.06M巴比妥鈉—鹽酸緩沖液    PH8.6
  （1）  0.06M巴比妥鈉(MW 206.18)    1.237g
      D.W                            100ml
(2) 0.2N鹽酸溶液
濃鹽酸                         1.68ml
DW                         至100ml
(3) 0.06M巴比妥鈉—鹽酸緩中液PH8.6  取(1)液化氣100.00ML,用力.2N鹽酸溶液調節PH至8.6(大約用4.00ml)
2、1%agarose
   agarose（B.R.）    0.8g
0. 06M巴比妥鈉鹽酸緩沖液80.0ml
隔水煮沸溶化.
5、羊抗小鼠IgG亞類血清
   IgM， IgG，IgG32，IgG24，IgG2
二、方法
1、澆瓊脂糖板，每片約3ml；
2、瓊脂糖板打孔（孔徑為1—2mm，孔間距離3—5mm），挑出孔內瓊脂后，補孔；
3、向中央孔注入抗Ig亞類抗血清，周圍孔加入待測樣品（1：20稀釋腹水樣品，或20倍濃縮的培養上清），每孔2—3ml；
4、置濕盒內室溫下擴散或4℃過夜觀察沉淀線，判定結果。
附：（1）20倍濃縮的雜交瘤培養上清的制備。最簡單方法是將20ml培養上清倒入一平皿，電扇砍風蒸發濃縮至于ml，或裝過透析袋，用PEG6000或蔗糖吸水；
或以濃縮膠吸收上清中水份。
單克隆濃縮抗體是上清中在的叭一的小鼠Ig，因此，濃縮培養上清是鑒定Ig類和亞類的最好材料。
（2）20倍稀釋的雜交瘤腹水
因為腹水中含有小鼠正常Ig，所以用腹水（或血清）鑒定單抗類和亞類，可能會得到模棱兩可的結果，在大多數情況下腹水經過1：20稀釋后，其中的正常Ig濃度變得很低，不易被免疫力擴散測出。
第二節 ELIST法
1、用EPBA稀釋山羊抗菌素小鼠Ig至工作濃度；酶標板每孔加入100ul，37℃孵育2小時。
2、用PBST洗滌3次。
3、每孔加200ul 1%BSA EPBS  37℃1小時。
4、 PBST 洗滌2次。
5、加100ul雜交瘤上清液，37℃2小時，或4℃過夜。設立陰陽對照。
6、 PBST洗4次
7、分別加入100UL多種兔抗小鼠Ig亞類特異血清，每種至少重復（）孔，37℃2小時。
8、 PBST洗4次
9、加100ul HRP標記的羊抗兔Ig，37℃2小時。
10、 PBST洗4次。
11、每孔100ul OPD底物顯色，室溫作用15分鐘，2M濃H2SO4終止反應。
12、肉眼觀察結果，或測OD490值判定結果。
第九章免疫血清的制備
第一節免疫球蛋白提取與純化
一、試劑
1、飽和硫酸銨：500g(NH)2SO4(A.R.)加入500ml  D.W.中，加熱至完全溶解，室溫過夜，臨用前用2N  NaOH調pH至7.8。
2、 32%硫酸鈉溶液：72.6g  NaSO4.10H2O 溶于60-80ml D.W.中，定容至100ml
3、 16%硫酸鈉溶液：50ml32%硫酸鈉溶液加于50mlD.W.，混勻。
4、 2N NaCl
5、 2N NaOH:16gNaOH+200mlD.W.
6、 0.5NnaOH:20gNaOH+1000mlD.W.
7、 2%NaHCO3(煮透析袋用):8gNaHCO3+400mlD.W.
8、 PBS  (10mMNaH2PO4_Na2HPO4,10mMNaCl PH6.8):
Na2HPO4.12H2O       17.55g
NaH2PO4.2H2O       7.96g
NaCl                   5.84g
D.W.                   10000ml
9、0.5M氯化鋇溶液(檢測SO42-)氏試劑
10、萘氏試劑（Nesslers  reagent）：
碘化汞    115g
碘化鉀    80g
  D．D．W．（不含氨）500ml    待溶解后，過濾，濾液中加入20%NaOH500ml。
  測定時，取樣品3—4ml，加入上述萘氏試劑1—2滴，若有銨離子存在，則出現磚紅色反應，甚至可發生棕色沉淀。
二、免疫球蛋白（IgG）粗提
所得粗制Ig，可以作為免疫原，可用作標記抗體制備。
(一) 硫酸銨沉淀法
適用于鼠、兔、豬、羊、雞等血清或抗血清和小鼠單搞腹水中Ig的提取。此方法為鹽析法提取Ig的首選方法。
1、取10ml血清、抗血清或勝地水，10000rpm15分鐘，去除細胞碎片及其它顆粒物質。
2、將上清轉移于小燒杯中，其內置磁棒，于磁力攪拌器上輕攪拌。
3、滴加飽和硫酸銨（PH7.8）5.0ml,加時應緩慢,每加一滴后應待混勻后再加下一滴.
4、繼續輕輕緩慢攪30分鐘,注意避免產生氣泡.
5、 10000rpm15分鐘.
6、棄去上清液,沉淀物用1/3飽和度硫酸銨懸浮,10000rpm15分鐘
7、 .重復步驟6二次
8、 .最后一次洗澡后的沉淀溶于1.5mlPBS中.
9、于透析袋內過夜透析(4℃).其間換液3—5次，直至檢查不到NH4（）和SO4（）。
10、移出蛋白質溶液，1000rpm15分鐘，收存上清液即為粗提免疫球蛋白。
   或將蛋白質溶液經SephadeX  G25  或G50層析過程，均以PBS作平衡液和洗脫液。
11、收集第一峰，測定蛋白質含量（mg/ml）。
   [Pr]=（1.45XOD280—OD290X0.74）X稀釋倍數
         OD280
   或[Pr]=——————X稀釋倍數
         1.3
  或[Pr]=1.5(OD280—0.5XOD290)X稀釋倍數
12、小量分裝后，4℃可長期保存，亦可—20℃凍存或凍干保存。
13、提純的Ig保存要求PH中性，鹽濃度過100—200Um，蛋白質1—10mg/ml，加防腐劑。此外，使用或分離Ig的溫度最好是2—4℃。特別是雞、小鼠、大鼠等要比其次動物Ig更不穩定，因此，在處理這類Ig時特別當心。
（二、）硫酸鈉沉淀法
   適用于兔和雞血清中的Ig提取，但該不穩定。
1、2、同前
3、滴加速度32%Na2SO4溶液10ml，滴加時應慢，每加1滴后待混勻后再加下一滴。
4、繼續緩慢攪拌30分鐘。
5、 10000rpm15分鐘。
6、棄去上清液，沉淀物用16%Na2SO4懸浮，10000rpm15分鐘。
7、重復步驟6二次。
8、以下步驟同前。
附一、不同動物血清球蛋白硫酸銨鹽析濃度參考值
血清來源
         硫酸銨飽和度（%）
家兔
山羊
綿羊
小鼠
大鼠
雞
馬
豬


      33X3次
      30X1，33X2
      33X3
      33X1，40X2
      35X1，40X2
      33X3
      30X1，45X1
      33X3
      30X1，45X1

      33X3
附二透析袋處理
1、透析袋于2%NaHCO3+1Mm  EDTA  中煮10分鐘。
2、用蒸餾水洗透析袋子內、外表面。
3、再用蒸餾水煮10分鐘。
4、冷至室溫即可使用。如暫時不用則將透析袋浸于0.2MEDTA溶液中，4℃存放。
5、使用后的透析袋用 DW反復部洗后，同上法處理，浸于0.2M EDTA溶液，4℃存放。
6、注意事項：
（1）透析袋亦可高壓滅菌消毒。
（2）吸取或裝入透析物時，手指不能直接接觸透析袋，應戴一次性手套或使用鑷子。
（3）透析袋用應及時洗滌、處理，以便重復使用。注意節約。
三、免疫球蛋白的純化
（一）離子交換柱的制備
1、 20g DEAE---纖維素(whatman  DE  32)浸泡于200ml 0.5NHCL,0.5小時，中間攪動兩次。
2、用蒸餾水反復抽洗，直至PH接近D.W.的PH值。
3、用200ML 0.5N NaOH浸泡15分鐘，中間攪動兩次。
4、抽去液體。
5、將濕膠再用功200ml 0.5NaOH懸浮，浸泡15分鐘，然后抽去液體。
6、重復步驟5
7、將濕膠再用D.W.反復抽洗，直至抽出液PH值接近D.W.的PH值。
8、再用起始緩沖液反復沖洗，直至抽出液的PH值勤和導電值與起始緩沖相同。
9、在裝柱前，去除微細顆粒。柱底填一些玻璃棉，上面再放置一層Washed sand或glass beads以防cellulose流出柱。
10、用緩沖液淋洗，使柱床穩定（2.0 ×30cm）流速1---3 ml/分鐘或20滴/分鐘。
（二）純化免疫球蛋白
1、將脫鹽后的粗蛋白對離子交換柱加樣。注意每克DRAE---纖維素能受的蛋白質為了30—50g。
2、梯度洗脫（0---300M NaCL）,用自動部分收集器分管收集，每管5ml。起始液為PBS(0.01M PB,0.01M NaCL,PH6.8)或(0.01M Tris—HCL PH6.8)。
3、測定蛋白測量，分裝-20℃凍存
4、此法提取的主要是IgG ,但可能會混有β-球蛋白。每毫升血清或腹水可提得Ig3-10mg
5、若需進一步提純，可過Sephacryls-300柱層析
(86-123)缺
（三）凝膠再生的方法
1、洗脫出第一蜂后，用2N  NaCL淋洗至基線穩定，再用起始緩沖液抽洗至洗出液的電導值與緩沖液相同，重新裝柱使用。
2、如再生膠暫不使用，應加防腐劑，置4℃保存，下次裝柱應抽洗去除防腐劑。
成功范例：羊抗鼠IgG，各種單抗、豬、雞、小鼠等血清中IgG。
四、親和層析一步法提純IgG
1、每5ml濕膠（1.5g干粉）可以經合100—125mg  IgG。
2、血清或腹水或雜交瘤培養上清加樣后，以PBS充分洗滌，至記錄儀基線穩定。
注意：直接使用腹水，可能會因纖維蛋白而阻斷親和力。
3、以0.1N甘氨酸—HC L，PH2.5作為洗脫液,注意在PH2.5不穩定的抗體,應考慮用較高PH 進行洗脫.
4、迅速以1M  Tris—HCL  PH8.0中和洗脫的提純Ig(亦可透析中和).柱再生.
5、以下步驟同前.
成功范例:提純兔抗鼠IgG。
附一、不同IgG亞類與SPA結合與洗脫的條件
IgG亞類

來源
結合
洗脫
IgG1
IgG24
IgG24
IgG9
小鼠
小鼠
小鼠
小鼠 PH>8.0
PH>7.0
PH>7.0
PH>7.0 PH<6.0
PH<4.5
PH<3.5
PH<4.5
   附二、SPA與免疫球蛋白的結合活性

免疫球蛋白

SPA
免疫球蛋白
SPA
小鼠IgG1
IgG24
IgG24
IgG6
IgM
IgA
IgE
兔IgG
雞IgG
+（—）
+
+
—
—
—
—
+
— 山羊IgG1
   IgG2
綿羊IgG1
   IgG2
豬IgG
貓IgG
豚鼠IgG
—
+（—）
—
+
+
+
+
—
（二）羊抗鼠Ig交聯Sepharose  4B以提純小鼠Ig
注意：溴化氰易揮發，如果吸入或通過皮膚吸收有巨毒，所有接觸CNBr設備應浸在NaOH中，在通風櫥里過夜，然后將氰化物洗掉。
1、以1升水用真空抽濾的方法Sepharose  4B（10ml沉淀體積），去除防腐劑（不要完全抽干），重懸于水中，總體積為18ml，置于50ml的燒杯中。
2、加入2ml碳酸鹽沖液（0.5M碳酸鈉PH10.5）和磁力攪拌子,在通風櫥中攪拌,將PH 電極置于懸液中,檢查攪拌器和PH計的工作情況.
3、戴好手套,小心將1.5克CNBr(避免大顆粒)倒入小瓶中。（在通風櫥中完成這項工作是安全的，先稱小瓶和瓶蓋子的重量，然后在通風櫥中往小瓶中加CNBr，小心蓋緊蓋子，移出通風櫥稱重，原來裝CNBr的瓶子的藥勺留在通風櫥中）。
4、緩慢的攪拌Sepharose懸液，監測PH并加入固體CNBr（將藥勺和空小瓶置于1M  NaOH中），逐滴加入4M的NaOH 以保持PH在0.5—11.0,直至固體CNBr全部溶解以及PH降低的速度減慢(10—15分鐘)。
在此過程中如果PH高于11.5,則棄去Sepharose,重做.
5、用燒結玻璃或布氏漏斗過濾混合物，用2升冷檸檬鹽緩沖液（0.1M PH6.5檸檬酸鈉,預冷卻至4℃）迅速洗滌Sepharose(不要完全干),小心處理過濾器(含CNBr).
6、快速將活化的Sepharose加到IgG溶液（100mg溶于10ml檸檬酸緩沖液中置于
4℃）中，置于轉動混勻器上，使之不斷的輕輕混勻，4℃
過夜。如果沒有轉動混勻器，則輕輕攪拌混合物1小時，然后靜置過夜）。
7加1ml乙醇銨溶液，繼續輕輕攪拌1小時，以確保安全去除活性基因。
8讓Sepharose自然沉降，上清用500g離心5分鐘，在280nm測上清液吸光度，計算未偶聯到Sepharose上的IgG百分率。假設上清液的總體積為11ml（蛋白溶液+乙醇胺）加5ml（10ml  Sepharose的內部液體體積）。IgG未偶聯率小于10%，通常為1—5%。
9、將IgG—Sepharose  裝于合適的柱（可將多孔圓盤放在注射針筒骨來制造一個簡單的柱）中，用PBS洗滌，柱中加入含0.1%疊氮鈉的PBS,4℃
保存.
      10分離提純Ig同前述可參閱有關資料。IgG—Sepharose有時要用同類動物正常Ig封閉之。
      成功范例：提純培養上清中的單抗。
第二節幾種常用抗原的制備
一、脂多糖抗原制備
（一）粗制LPS制備，參見第六章
（二）精制LPS制備
1、粗制LPS經3倍95%酒精，37℃水浴作用15分鐘；離心后，沉淀物以蒸餾水配成3%溶液。
2、超速離心100000Xg  4小時。上層為上清液，中間層為沉淀的LPS膠體，下層為粘液樣沉淀物。
3、吸棄上清，小心取出沉淀物的LPS膠體（中間層）。
4、將LPS溶解在原體積的1/2蒸餾水中，再離心一次。
5、沉淀的LPS溶液于少量DW中，凍干保存。
超離后分層情況
（三）多糖抗原制備：
1、將LPS 200mg溶解在20ml  1%醋酸溶液中，以移入帶塞的試管中。
2、  100℃水浴30分鐘。
3、 5000Xg離心沉淀類脂，吸取上部液體，裝入透析袋中，4 ℃透析48小時。
4、凍干提取的多糖，產量為LPS的30——、40%。
   成功范例：沙門氏菌A—F群LPS提取。
二沙門氏菌鞭毛抗原的制備
  1、將半固體培養基篩選活潑動力的單相沙門氏菌血清型接種到10mlM肉湯中，37℃
16小時。
2、再移種到500ml  M肉湯中，37℃16小時。
3、 400ur/m離心30分鐘，收集細菌。
4、以適量生理鹽水懸浮菌泥，并用1N鹽酸調至PH7.0,室溫輕度振蕩30分鐘.
5、 1000r/m 30分鐘.上清中含有大量脫落下來的鞭毛素.
6、以1NnaOH將上清調至PH7.2.
緩慢加入飽和硫酸銨溶液,邊加邊攪拌,達67%飽和硫酸銨濃度后,4℃過夜.
   8次日將上清以15000r/m4℃離心20分鐘。
9、將沉淀物溶解于2ml蒸餾水中。
10、過Sephacryl  S300層析柱（2.0X50cm）,用Tris—HCL緩沖液洗脫，流速20ml/小時，收集第一峰，測定蛋白質濃度，分裝保存。若對提純要求不高，可以省略此步。
11、提純鞭毛素的質量鑒定
（1） SDS—PAGE：在非降解和降解條件下于10%凝膠SDS——PAGE垂直板上電泳（KB—2301電泳儀），恒流，25Ma/板，10℃電泳5小時。
（2）凝膠用三氯醋酸溶液固定過夜色。用考馬斯亮蘭G—250染色。
（3）計算蛋白帶分子量：Ha  50000，Hb 53000，Hd46000。
  12提純鞭毛素的等電點測定—IEF
（1）取60ul樣品溶解在9M脲和1%2—巰基乙醇中。
（2）上樣于含有2%Ampholin（PH3.5—9.5）（LKB  Bromma，Sweden）和6M脲的4%聚丙烯酰胺凝膠（用22.2%聚丙烯酰胺和1.4%  雙甲丙叉烯酰胺原液配制）。
（3）蛋白質在LKB  1117—003多功能電泳儀上，恒流4mA待電聚焦至電壓250—300V。
（4）電泳5小時后，用10%三氯醋酸固定凝膠，經40%乙醇洗滌后，用0.1%考馬斯亮蘭G250染色過夜,再用14%醋酸脫色.
（5）確定PH梯度凝膠，從陽極端切成0.5cm長度,分別裝入小試管內,加去離子水1小時后,用酸度計或PH試紙測PH值,劃出PH梯度斜線,并確定樣品的等電點.(Ha5.1,Hb5.1  Hd4.9)。
三、粘附素抗原的制備
（一） K88、K99和K987p的制備
1、將G—7或E68、C83907和UP001在37℃培養16—20小時。
2、從克氏瓶中洗下，用0.1M PBS(PH7.0)懸浮。
3、 62℃水浴振蕩20分鐘使粘附素脫落。
4、 8000r/m20分鐘，其上清液用10%乙酸調PH至4.5，4℃放置過夜，使K88粘附素沉淀（等電點沉淀）。
5、以8000r/m離心，將沉淀物用0.1M  PBS溶解。
6、經Sephadex G200柱層析（2.6X80cm）純化，用0.01M  PBS(PH7.0)作為平衡液及洗脫液,流速為1ml/分.
7、收集第1峰,合并前半峰即為純化K88抗原.。
8、測定蛋白質濃度，小量分裝，—30℃保存備用。
（二） K99抗原的制備
1、 K994529在Minca培養基上37℃培養18小時。
2、磷酸鹽尿素緩沖液洗下菌細胞。
3、 60℃加熱孵化20分鐘，離心后去菌體，上清加60%飽和硫銨，4℃攪拌2小時。
4、離心收集沉淀，懸浮沉淀對上述緩沖液透析16小時。
5、進一步經Sephadex  CL—4B柱層析純化，濃縮后再經SephadexG—50脫鹽。
（三） 987P抗原的制備
1、 C88710 Slane培養基37℃20小時培養。
2、生理鹽水洗下菌笞，離心收集菌體。
3、菌泥中加入400ml含2M尿素0.01M PBS，60——63℃ 1—1.2小時。
4、 60%飽和度硫酸銨沉淀離心上清。
5、離心后，沉淀物再過Sepharose  4B柱。
6、收集第一峰前半峰，濃縮后經Sephadex  G50脫鹽。
（四） F48抗原的制備
1、 C95707、C85919和B41M分別接種Minca培養基上，37℃18小時。
2、滅菌0.05M  PH7.2 PB收集菌體。
3、 62℃水浴加熱處理1小時，并不時振動，離心去菌體。
4、上清置4℃72小時，等電點4.6沉淀法使粘附素沉淀 .
5、離心后,將沉淀于Separose  CL—4B純化，以含2M尿素0.05M PH7.2 PBS洗脫,洗脫液濃縮后再脫鹽。
附：各種粘附素等電點。
   K88       4.2
   K99       9.7
   987P       3.7
   F41       4.6
四、全菌抗原的制備
1、丙酮滅活菌制備參見前述。
2、甲醛滅活全菌制備：以0.4—0。6%甲醛生理鹽水與新鮮肉湯培養物等體積混滅菌，經PBS洗滌后，配成1—10X10（6）/ml，4℃保存備用。
3、熱滅活全菌制備：將鮮培養物以DW稀釋至10億/ml細菌，100℃水浴2小時，離心吸取上清（另一種抗菌原），菌泥進一步用PBS洗3次，保存備用。
4、酒精滅洗全菌制備。
五、病毒抗原的制備
（一）雞新城疫病毒提純—“層析法”
1、雞紅細胞吸附釋放法。
雞紅細胞吸附表面有一種糖蛋白受體，在4℃時，病毒被吸附到紅細胞膜的受體上，但在37℃時病毒的N—乙酰神經氨酶破壞受體的糖苷鍵后，病毒又可以從紅細胞膜上釋放。操作步驟如下：
（1）感染病毒的雞胚囊液，在4℃下6000r/m，30分鐘，棄沉淀。
（2）上清液根據病毒血凝滴度的高低，加入1—3%的新鮮洗滌的雞紅細胞，在4℃下吸附1—2小時。
（3） 3000r/m0分鐘，棄去上清。
（4）吸附有病毒的紅細胞重懸浮于1X鈣鹽水中（含4%CaCL2的生理鹽水），在37℃下放置2—4小時。
（5） 3000r/m20分鐘取上清。
（6） 28000r/m小時，沉淀重懸于小容積的生理鹽水中，即為初步純化病毒。
2、解脫后的病毒蛋白液再上Sepadex  G—200柱，以PBS洗脫，收集第1峰。即為進一步純化的NDV。
（二） NDV純化—離心法
1、 NDV種毒以滅菌生理鹽水作1：100稀釋，再接9—11日齡SPF雞胚的絨毛尿囊腔內（0.1—0.2ml/胚）。
2、 37℃孵化，每天照蛋兩次，收獲24—96小時死亡雞胚的澄清無菌之尿囊液，測血凝價，分裝—30℃保存備用。
3、尿囊液經5000Xg  30分鐘。
4、取上清102732Xg離心30分鐘。
5、再取上清用20%蔗糖墊底，110000Xg離心2.5小時.
6、取沉淀用少量PBS懸浮，經10—60%蔗糖等到密度性梯度離心，91000Xg  16小時（BecKman，L7，SW28）。
7、收集含病毒的蔗糖區帶。
8、用PBS稀釋上清，110000Xg離心2.5小時。用小量PBS懸浮沉降病毒，小量分裝，—70℃保存備用。
（三） NDV  HN  NP  F蛋白制備—SDS—PAGE。
附：聚乙二醇法濃縮病毒
在病毒懸液中加入一定量的PEG6000。在此條件下，病毒可隨其他大分子物質發生沉淀。操作步驟如下：
（1）收獲經病毒感染的尿囊液，6000r/m30分鐘，棄沉淀。
（2）上清液中加入7.5%的PEG 和0.1—00.4MnaCL，4℃下放置2—4小時。
（3） 6000r/m30分鐘，收集絮狀沉淀物，重懸于小容量的緩沖液內。
六、 MDV羽囊瓊擴抗原制備，從略。
七、 IBDV瓊擴抗原制備，從略。
八、轉鐵蛋白制備：利凡諾—低溫乙醇分級沉淀法。
1000ml血漿
            加與血漿等到體積的2.0%利凡諾（內含1%Na2CO370ml），
               邊加邊攪拌產生黃色粘性沉淀物（為白蛋白）
               校正上清PH8.1—8.2，靜置3—4小時
（白蛋白沉淀）棄  收集上清液
               加1%活性吸附利凡諾（20分鐘）
               抽濾，得澄清濾液
         移入—10℃冷凍
         用1M Hac調PH7.0—7.2
         加乙醇終濃度為25%（乙醇要用Hac調PH7.0—7.2）
         校正PH7.0—7.2
         —60—70℃放2小時
         —4℃離心20分鐘（20000r/m）
（球蛋白沉淀）棄
         上清冷至—8℃（調PH5.80+(-)0.05）
         加乙醇至終濃度40%
         調PH5.8+（—）0.05
         —10℃放置沉淀過夜
         —4℃離心，收微紅色沉淀（轉鐵蛋白）
         沉淀溶于5—10倍無熱原水中（含0.9%NaCL）
         分裝、凍干。
         稱干粉重，用水溶解[Pr]至于10%。
         用1%Na2CO3調至PH6.8+（—）0.2,測[Pr]為10%
         將溶液在60℃水浴恒溫10小時
         用除菌濾器過濾
         分裝5ml/瓶。
注意事項：
1、乙醇要滴加，防止局部變性。
2、 PH要準確控制。
3、溫度控制要準確。
4、防止鐵被鏊合劑“抓”走。
5、產品應與標準品用條件電泳鑒定。
第三節抗血清的制備程序
一、免疫原的配制
1、福氏不完全佐劑（Ferund’S  adjuvant，imcomplete，FIA）100克石臘油與50克羊毛脂置于鹽水瓶中充分渦旋混勻，過濾除菌或高壓滅菌（10P15分鐘），置4℃
  存放備用。（有市售產品，Sigma）
  2、福氏完全佐劑（Ferund’S  adjuvant ，compelete，FCA）取干粉卡介苗25—250mg
于100ml鹽水瓶中草藥，加10ml福氏不完全佐劑，于渦旋器上混勻30—60分鐘，再加40ml福氏不完全佐劑再混勻10—20分鐘，4℃存放備用。（有市售產品，Sigma）
3、免疫原的配制    取等體積的蛋白質溶液與福氏完全佐劑或不完全佐劑分別置于二支潔凈滅菌試管中，用2—5ml注射器（配5號針頭）吸取約1/5V的抗原溶液，將針頭插入佐劑液面下，急速注入油層。置旋渦器上充分混合。用同樣的方法分4—5次將其余的抗原溶液與佐劑混合。再于渦旋器混勻30分鐘，然后再用注射器反復抽吸，配成油包水“顆粒”，靜置15分鐘后，觀察管底部有無水相析出，如有水相析出，則再用注射器將水相注入油層，并混合之。
制成的油包水乳劑在免疫動物之前需檢查其乳化效果，方法是：取一只燒杯裝滿水，滴數滴上述乳劑于水面，第一滴通常分散開而其他滴呈球狀。如也分散開則表明不是油包水乳劑。
3、一些抗原，如全菌抗原、顆粒抗原等，可以不使用佐劑而直接免疫動物。
二、動物的選擇
免疫動物的選擇應考慮以下幾方面因素：
1、動物房的條件及飼養管理水平。
2、抗血清的需要量：1只小鼠僅能提供1.0—1.5ml血,而一只山羊能提供幾升。
3、可能提供的抗原量：小鼠通常對50ug或小于50ug的抗原應答良好，山羊可能需要幾mg。
4、應考慮提供抗原的動物與產生抗體的動物之間的種系關系。多數情況下，應選用在種系上與抗原供者無關的動物來進行免疫。如高度分化的哺乳動物的蛋白抗原應選用非哺乳動物（如雞）來生產抗血清。
5、特別注意的是，如果所制備的抗體僅僅是用來檢測蛋白質間的微細差異，如同種異型，則可用關系相近的甚至是同種動物來分離抗原和制備抗體。
6、此外，還應考慮所選動物的年齡大小、性別、個體差異等對抗血清生產的可能影響。因此免疫動物只數不宜僅是1只。
三、免疫程序的選擇
（一）山羊抗小鼠、兔、豬和雞Ig免疫血清的制備。
程序一：
1、每只山羊于兩側肩前淋巴結各注射0.5毫升(共含蛋白質量650—1000ug，混于FCA中，FCA—Ag)。
2、 1個月后，采血測效價，如瓊凝擴效價未達1：32，則用二倍劑量抗原（混于FIA中，FIA—Ag）于頸部肌肉注射以加強免疫。
3、 2周后再試血，如效價仍未達到1：32，則再加強免疫（同2），直至達到1：32以上。
4、頸動脈放血致死，分離血清，分裝，—20℃保存。
成功范例：羊抗雞血清。
附：瓊脂擴散沉淀法測定血清效價。
（1） 1%瓊脂凝膠：用含0.065%  NaN2、5Mmedta—Na2的0.01MPBS(PH7.4)配制1%瓊脂。
（2）抗血清以0.01MPBS(PH7.4)作1：2—1：256稀釋后，加入周圍孔，每一稀釋度加二孔。中央孔加提取的抗原。
（3） 37℃濕盒內過夜擴散，觀察結果。
      程序二：
1、每只山羊于足掌、足趾、后腿部皮下注射2mlFCA—Ag（共含蛋白質量1.2mg）。
2、二周后，二側腘淋巴結內注射1mlFIA—Ag（蛋白質量為0.6mg）。
3、二周后，后腿部肌肉注射4ml FIA—Ag。
4 、二周后試血，判定標準同上。若達不到效價，繼續后腿部肌肉注射4mlFIA— Ag
直至達到1：32 以上。
5、頸動脈放血致死，分離血清，分裝之，—20℃
成功范例：羊抗兔血清（1：256）。
程序三：
1、每只山羊背部皮內多點注射6mlFCA—Ag（每點30—50ul，共含蛋白質量600ug）。
2、 1個月后，頸部和后腿部肌肉注射4mlFIA—Ag（蛋白質量用400ug）。
3、二周后試血，若效價達不到，同2繼續加強免疫，直至效價達1：32以上。
4、采血，貯存同前。
成功范例：羊抗BALB/C小鼠血清。
      程序四：
1、每只山羊頸部、腿部皮下注射4mlFCA—Ag（共含蛋白質4mg）。
2、二周后，頸部、腿部肌肉注射4mlFIA—Ag，二周后，同法加強免疫一次（6mlFIA—Ag）。
3、二周后試血。若效價不夠，繼續加強免疫，直至效價達1：32以上。
4、采血并分離血清，貯存同前。
成功范例：羊抗豬血清
（二）兔抗血清的制備
程序一：
1、每只家兔上內多點注射50—200ug蛋白抗原（FCA—Ag）。
2、 1個月后，用提純抗原靜脈注射0.5mg蛋白抗原.
3、 2周后試血,效價不夠,可加強免疫一次.。
4、于最后一次免疫2周后，心臟采血致死，分離血清，分裝—20℃凍存備用。
成功范例：兔抗大腸埃希氏菌粘附素血清
程序二：
1、第一次靜脈、腹腔各注射50mg/只差速離心粗提NDV抗原。
2、第7天重復注射一次。
3、第14天改為腹腔、肌肉注射器，劑量加倍。
4、第21天肌肉注射100mg/只，四腳掌各10mg/只。
5、末次注射后10天采血，分離血清。測HI滴度計算血凝抑制單位。
（三）雞抗NDV血清制備
第一次用Lasota株雞胚尿囊液靜脈注射1ml/只，腹腔注射4ml/只，以的每隔5天重復注射二次（內含1mlNDV強毒雞胚尿囊液），共三次，末次注射后第10天采血，測HI滴度。
（四）小鼠抗血清抗原的制備
程序一：可溶性抗原的免疫程序
1、以10—100ug抗原乳化在200ulFCA中（油包水），腹水注射3—12周齡BALB/C小鼠。
2、 4—6周后，以同樣劑量抗原乳化在FIA中，作1—2次追加免疫（i.p），間隔時間為2—3周。（可試血、采血）。
3、以等量或加倍量抗原的PBS 溶液作最后一次免疫，2—4天后取脾細胞可作融合試驗用。
程序二：細胞性抗原的免疫程序
1、細胞用PBS洗3—4次以除去血清成分。
2、以10（7）細胞/只劑量腹腔注射BALB/C小鼠。
3、 3—8周后作追加免疫力。（可重復1—2次）。
4、最后一次免疫2—4天取脾細胞供作融合。
程序三：短程免疫程序
1、全菌抗原5X10（6）/只腹腔注射；（或用提純抗原40ng/只  i.p）。
      2、2—3周后，腹腔注射提純抗原40ng/只（若每間隔2—3周用全菌抗原后提純抗原加強免疫5—6次，此乃“密集型”免疫程序）。
2、 3天的取脾細胞可供融合用。
（五）體外免疫程序
Development  of  a  serum—free  medium  for  in  vitre  immune  responses  by using  b—cyclodextrin
J  Immunol  Methods  1998:112:227—233
（六） IBDV血清生產（從略）
      第十章    細菌學試驗中的幾個常用技術
第一節；菌總數估測
一、比濁法
1、莫法蘭德濁度計的制備
按下述方法制備標準硫酸鋇懸液。
（1）制備一份1%的C.P(化學純)硫酸溶液。
（2）制備一份1%C.P氯化鋇溶液。
（3）制備下述10個標準懸液：
加（1%氯化鋇溶液ml數）于（1%硫酸溶液ml數）
1 99
2 98
3 97
4 96
5 95
6 94
7 93
8 92
9 91
10 90
（4）取各標準硫酸鋇沉淀的懸液3ml左右，封存在一支試管內。試管必須仔細挑選，使其直徑、色澤和管型的厚度都一致。
2、目測待檢樣品與幾號管濁度相近，并按下列關系，估計細菌濃度：
            管號                細菌含量
1 3億
2 6億
3 9億
4 12億
                  ……                   ……
二、常規平板計數法
1、將待測均質樣品制備10（-2）10（-3）10（-4）……等適度的十進制稀釋液，其方法系以無菌吸管吸取10ml原稀釋液，加于90.0ml稀釋液中（有時可采用1.0ml+9.0ml）混勻。注意：稀釋每個滴度的吸管都要更換，操作中防止出現泡沫。
2、用吸管以每一個稀釋液內吸取1.0ml，分別加入到有適當標志的平皿（15mm X100mm）內。注意：如果稀釋菌液靜置的時間超過3分鐘，則在吸取前，必須重新混勻。
3、于每個平皿內各加12-15ml標準法瓊脂（冷至44-46℃。瓊脂在45℃水浴中保溫備用）樣品的每一個稀釋系列做一個只加稀釋劑傾注瓊脂的對照平板。
4、立即轉動或在一個平面上前后傾動平皿，使樣品稀釋液和瓊脂培養基充分混合均勻。
5、待瓊脂凝固后，翻動平板，迅速防于35℃恒溫箱內培養 48h+（-）2h。
6、培養后，在適當范圍的雙列平板用菌落計數器計數菌落數，記錄每一個稀釋度的平板計數結果。
7、在三個稀釋倍數中，至少應有一個稀釋倍數的兩個平板其菌落數在30—300個的范圍之內。根據菌落數和稀釋度計數樣品中的需要平板數。
8、所有從菌落數少于30個或多于300個的雙列平板計算而得的需氧平板計數數，都報告為估算數。
附：1、標準法瓊脂（平板計數瓊脂）
               胰蛋白胨          5g
               酵母浸膏          2.5g
               葡萄糖             1g
               DW                15g
               PH7.0+(--)0.1       121℃15分鐘
   2Butterfield氏緩沖液
      基礎溶液：
               磷酸二氫鉀          34g
               D.W.             500ml
      用1N氫氧化鈉將PH值調整至7.2，加蒸餾水至升。121℃高壓滅菌15分鐘，貯于冰箱。
      稀釋的定量瓶裝（使用液）：
      取上述基礎液1.25ml,加D.W.達1000ml,分裝于瓶內,每瓶99或99+(--)1ml。
      121℃高壓滅菌15分鐘。
三、直接顯微鏡檢查法（Official  first  action  method，法定試行方法）。
1、在油鏡下用顯微鏡測微尺測定每個視野的直徑d，則視野的面積為：
   Af=（）（d/2）（）。
2、每一平方厘米涂膜的視野數應為
      AF       1cm（）
      ——— =——————
      Af       Af[cm]（）
3、每個涂膜含0.01ml樣品,則1.0ml樣品的視野數應為：
                     AF
         FF=100X————
            Af
4、每ml樣品中的菌數即為：
DMSCC（）/ml=[FF]X[每個視野的平均菌數]
（direct  microscopic  somatic  cells  count  直接顯微鏡菌體細胞計數）
5、 FF和檢查的視野數（至少10—60個）都為已知數，故可作為一個系數，稱視野工作系數（FWF）代入上式而得：
DMSCC/ml=[FWF]X計數的總細菌數
6、菌液涂膜的制備：
（1）吸0.01ml樣品,置于潔凈、干燥的載玻片上；
（2）將菌液涂成1cm（）的涂膜；
（3）將玻片放于35—40℃，至涂膜干燥；注意保持玻片的水平。
（4）浸于二甲苯中1min，再浸于95%酒精中1min；
（5） North苯胺油亞甲藍染色劑中染色1—20min；
7、漂洗玻片，鏡檢前在空氣中充分干燥。切忘用吸墨紙吸干。
附：North苯胺油—亞甲藍染色液
   苯胺油（Aniline  Oil）    3ml
   酒精（95%）             10ml
   鹽酸（濃）                1.5ml
   亞甲藍(飽和溶液)          30ml
   蒸餾水,加至                1000ml
將3ml苯胺油與10ml酒精相混合,在不停在攪拌下徐徐加入1.5ml鹽酸.。加30ml飽和亞甲基藍溶液，用水稀釋至100ml，過濾。
四、分光光度計測定法
a、波長選擇420nm，550nm，600nm。
b、下列回歸方程為420nm條件下建立。
第一組
（1）大腸桿菌
lgy（）=7.1370+2.7878X
      (2)金黃色葡萄球菌：
      lgy（）=7.4722+4.7259X
（3白色葡萄球菌：
   lgy=6.9067+2.6950X
（5）白色念珠菌：
  lgy=5.9512+2.1948X
有效測定范圍在103___106ofe/ml
                                       (摘自俞曉峰文章)
第二組
(1) 沙門細菌(S.pullorm)
未離心肉湯:lgy=7.3461+7.5306X
離心菌懸液:lgy=7.3112+7.7191X
(2) 大腸桿菌:
未離心肉湯:lgy=7.4197+1.2113X
離心菌懸液:lgy=7.3764+5.8632X
五、最近似數（MPN）（the  most probable  numbers）是一個代表作用物中活菌濃度的估計數。這個數是應用機率的原理測定作用物（樣品）中細菌的總濃度而推知的。請參閱有關文獻。

第二節幾種常用細菌培養基的配方
一、Minca  Med    1000ml（Minca—Isoritalex）
   KH2PO4 1.36g
   NA2HPO4.12H2O 25.3g(NA2PO4.12H2O 10.1g)
   Casamino acids 1g (Difco)
   Trace  salts solution’ 1ml’
   agar(Difco)    12g
   PH7.5 10P.10分鐘消毒
   (Isoritalex(BBL):1  ampoule)
*Trace salts solution(100ml)
MgSO4.7H2O       10g
MnCl2.4H2O       1g
FeCl3.6H2O       0.135g
CaCl2.2H2O       0.4g
100℃滅菌。
二、SLANETS MEDIUM
Bacto  tryptose    20g       glucose          1g
NaCl                   9g       bacto  agar    18g
A．D．W             1000ml
四、 BBL培養基
（1）大豆胨       10g
Trypton  or Bacto—pepton
orpretose—pepton                      10g
NaCl                                        4g
KH2PO4                                     1g
牛肉湯                                        1000ML
agar                                        20—30g
PH7.6 15磅 15分鐘滅菌
或（2）Trypton or    Bacto—pepton          10g
   NaCl                                        3g
   NaH2PO4                                     2g
   兔湯                               500ml
   牛肉湯                            500ml
   agar                         20g
      PH7.6  15P15’
或(3) 酪蛋白水解物             20g
   大豆胨                10g
      NaCl                   3g
      NaH2PO4                2g
      PH7.6 15P  15’
四、TEM Med
Lab__Lemco          5g
bacto__tryptose(Difco)    10g
NaCl                   3g
Na2HPO4.12H2O                2g
glucose                   0.5g
yeast  extract(Difco)    5g
*Trace element    solution       5.0ml
PH7.3
bacto agar(Difco)             25g
A.D.W                               1000ml
120℃  15’
*Trece    ekement    salt
FeSO4.7H2O          0.5g
ZnSO4.7H2O          0.5g
MgSO4.3H2O          0.5g
1N  H2SO4             20ml
A.D.W                   1000ml
五、 M肉湯
1、Trypticase soy  Broth
Trypticase    17.0g
phytone       3.0g
Glucose       2.5g
15p.s.i for  15min
Dipotassium  phosphate    5.0g
D.W                   1000ml
PH7.3
2、Tryptone  Broth
Trytone                10.0g
D.W.                      1000ml
3、M    broth
   an equal  mixture of(1) and  (2)
六、其它各類培養基參見有關書籍。
第三節常見細菌的分離鑒定
按常規程序進行各類細菌分離鑒定，請參閱有關書籍。這里僅以腸桿菌科沙門細菌的分離鑒定為例簡要概述，下面是該菌的分離鑒定的流程圖：
                     被檢材料

內臟組織上          糞便、腸內容物理學                各類食品、飼料等

                                                         前增菌
                     增菌培養（24—48小時）

                                                         選擇性增菌
                  鑒別培養基（24h）
                  三糖鐵瓊脂（24h）
幾次常規生化          尿素酶                多價抗O血清
試驗鑒定             測定                      試驗

                                                            ELESA試驗、
                     結果判定                         FA試驗、噬菌體系統
                                                            DNA雜交試驗等

動物試驗             O單因子血清測定             鑒別生化試驗
         H血清鑒定
         結果判定
第十一章    細胞免疫學試驗程序
   第一節玫瑰花環試驗（E—ROSETTES ASSAY）
一、總E花環（ERYTHOCYTE TOTAL  ROSETTE，Et），或稱晚期玫瑰花環，淋巴細胞+SRBC等，37℃，低速離心——4℃  2小時——檢測。
E的百分率（花環形成的細胞X100/總計細胞數）和絕對數可代表被檢標本中全部T淋巴細胞的百分數和總數。E是目前鑒定和計算外周血液和各種淋巴樣組織中T細胞的最常用方法之一。
二、活性E花環（ERYTHOCYTE ACTIVE  ROSETTE， Ea），或稱早期玫瑰花環。淋巴細胞+SRBC或其它動物紅細胞——低速離心沉淀——檢測。
Ea與T細胞的體內外功能活性密切相關，能更敏感地反映機體細胞免疫的水平和動態變化，是目前檢測細胞免疫水平最為簡便快速的方法之一。
三、操作步驟
1、靜脈采血，以肝素作為抗凝劑，每毫升血含20UL或0.2mg；若為以EDTA—Na2作抗凝劑1—2mg/ml血。一般認為EDTA—NA2比肝素好，因為T淋巴細胞、RBC、肝素均帶負電，有相互排斥。
2、淋巴細胞的分離淋巴細胞比重在1.077___1.080之間,紅細胞和粒細胞比重為1.092。配制1.077___1.080高分子液進行密度梯度離心,高分子溶液的主要成分是蔗糖,商品名為FICOLL
取抗凝血1.0ml,加等量HANK’S液(無鈣鎂,PH7.4)稀釋后,用毛細吸管沿管壁緩慢加入裝有淋巴細胞分層液的試管內,使血凝重疊于分層液上,用水平離心機以2000R/M30分鐘離心。此時紅細胞沉降至最下層，上層為血漿，中層為分層液，血漿與分層液的界面有一白色挾帶為淋巴細胞和單核細胞。
以毛細吸管吸取界面處的淋巴細胞與單核細胞，置于離心管中，用HANKS液以1000r/m10分鐘洗2次，以HANKS液配成107個細胞/ml的細胞懸液。
3、1%RBC懸液的制備    取阿氏液保存的血液，以HANKS液洗3次，2000r/m10分鐘離心后，將壓積紅細胞用HANKS液配成1%懸液，含紅細胞數約108/ml。
6、 Ea花環0.3ml淋巴細胞懸液+1%RBC 0.3+0.1ml滅活小牛血清___混勻___37℃25分鐘___1500r/m5分鐘___此培養物即可作涂片或滴片觀察.
5、E1花環:上述培養物中再加入0.8%戍二醛1滴,輕輕搖勻混合,置4℃凍箱中作用2小時(或過夜)。取出后，輕輕旋轉試管，使沉淀的細胞重新懸浮，用毛細管輕輕混勻。
7、制片鏡檢
（1）濕片    取上述培養物一滴加于事先鋪有瑞氏染液的玻片上，覆以蓋玻片，在高倍鏡或相差鏡下觀察。凡吸附4個或更多RBC的單核細胞為RE花環形成細胞，共計數200個細胞，算出百分率。
（2）干片    取培養物1滴于載玻片上涂片、干燥，滴加甲醇固定5分鐘，用PH6.4PBS沖洗,取I液染4分鐘,沖洗,再加II液染色4分鐘,沖洗,待干,鏡檢。紅細胞染成紅色，淋巴細胞染成藍色。
附1 染液配方
I液    瑞氏粉0.1g,甲醇60ml,研碎混勻.
II液姬姆氏粉0.5g,純甘油33ml,甲醇33ml,先將姬姆氏粉溶于甘油中,并置60℃溫箱中,最后加甲醇即可.
使用時,分加將I液和II液用PH6.4PBS稀釋一倍.
附2    試驗條件選擇
1、人、豬、牛、羊淋巴細胞——SRBC：
2、馬、犬淋巴細胞—豚鼠RBC：
3、豚鼠淋巴細胞——家兔RBC：
4、 RBC：LC=50—100：1
5、染液亦可用0.2%美蘭, Giemsa ___Wright氏液.
                  第二節    淋巴細胞轉化試驗
                     （LYMPHOCYTE  TRANSFORMATION  TEST）
淋巴細胞轉化試驗是體外檢測淋巴細胞功能的一種方法。Tc與特異性抗原或非特異促分裂因子在體外共同培養時，細胞代謝和形態發生一系列的變化，代謝旺盛、蛋白質和核酸的合成增加，細胞體積變大，轉化為能分裂的淋巴母細胞。轉化率的高低反映機體的免疫功能狀態，這種方法為淋巴轉化試驗。
一、試劑配制：
1、 DMEM+10%FCS
2、肝素2000U/ml
（4萬單位溶于20mlPBS，過濾除菌；使用時0.1ml肝素+10ml血）
3 無Ca++、Mg++，PBS，滅菌
4、0.2%臺盼藍
5、PHA80ug/ml
0.8mgPHA+無菌10mlDMEM+10%FCS中;
6、H—THYMIDINE
1mCi/ml的液體0.5ml___溶于50mlDMEM+FCS液中,終濃度為1uci/100ul.
7、消化液20ml
濃甲酸       15ml
H2O2（30%） 5ml
8、液閃液（所有器皿需烘干）
PPO       5g
POPOP    2.5g
溶于200ml無水乙醇+800ml甲苯,搖勻;
9、MTT
二、外周血淋巴細胞PBM制備
1、 10ml肝素抗凝血；
2、 50g，4℃10—15min；
3、收集上層液體；
4、用DMEM+10%BFS洗一次；
400g 4℃  10min；
5、吸棄上清，加5mlDMEM+10%BFS；
6、活細胞計數（方法見前）
調整細胞濃度至2X107/ml
三、同位素法測定轉化后的細胞活性
1、按下列方式分別加入淋巴細胞懸液和PHA：
1          2          3          4             5             6
A
B
C
D
(1) 淋巴細胞濃度2X107/ml，每孔加入0.5ml,終濃度為1X107/ml;
(2) PHA濃度80  40  20  10  5  0ug/ml,每孔加入0.5ml,終濃度為40  20  10  5  2.5  0;
2、 37度CO2箱內培養56h;
3、 A、B兩排每孔加1uci、’H-thymidine;
4、繼續培養16小時;
5、收集A、B、C排細胞于離心管內；
6、 400g10min，棄上清；
7、 A、B排細胞沉淀用PBS洗一次，400g×10min；
8、放射性測定；
（1）A、B離心館開蓋80度烘干，2-3小時；
（2）每管內加消化液200ul；
（3）蓋好，90度水浴1小時；
（4）每管取100ul置液閃瓶內；
（5）每瓶加4ul閃爍液
（6）液閃儀測定
刺激指數SI= 加PHA管的CPM均值
         ——————————————
                  對照管CPM均值
四、形態學方法：
1、 C排管內細胞沉淀物涂片
2、 GIEMSA——WRIGTH染色
3、鏡檢
200個LC,計算轉化率
      轉化率（%）=轉化LC/淋巴細胞總數
五、 MTT法
MTT法是一種四甲基偶氮唑鹽[3—（4.5- dimethyl__thlazd-2-yl）-2.5-diphenyl-terrazolium  bromide]淡黃色，易溶液于水，MTT經活細胞線粒體中的脫氫酶作用后可氧化成藍色結晶甲襸，甲襸經異丙醇作用后溶解顯色，此法簡易，準確且無同位素污染，以此法代替H’—TDR摻入法可進行細胞代謝活性及增殖反應的測定。
1、不同處理的細胞加入96孔細胞培養板中，每孔100ul，37℃6%CO2培養。
2、培養結束前4小時加入100ul/孔MTT試劑。
3、培養結束后，取出培養板，4℃下1500r/m離心7分鐘，甩去上清。
4、立即加入10%鹽酸一異丙醇，100ul/孔，充分吹吸混勻。
5、于DG一3022型酶聯免疫儀上測定OD570nm、OD650nm，求出OD550值。
第十二章動物實驗的一般規則
一、依據實驗目的要求，如病毒LD50、LD100、ID50等、細菌毒力測定、免疫效力試驗、免疫血清制備等，選擇不同種類、品系及不同飼養管理條件下的實驗動物式實驗用動物。常用的實驗（用）動物包括小白鼠、大白鼠、豚鼠、綿羊、山羊、小香豬、他豬八戒、家兔、雞、鴨、鵝等十幾種。其中部分動物又有自然繁殖、近交系等、SPF與非SPF等區分。
二、依據動物騍病原體的敏感性或騍接種物的應答性不同，確定選用動物的年齡、性別，特別是使用動物的數量。
四、不同實驗研究類型所要求的動物數量不相同，現簡述如下：
（一）現況研究（Cross-sectional study）的一般樣本大小可用下列公式計算：
      S．E．=PQ/N
      S．E．=標準誤，P=某病的現患率或感染率，Q=1-P，N為樣本大小。根據上述公式，可得到下列簡便公式。
1、若容許誤差d=0.10P,95%可信水平t=2樣本的感染率P與總體感染P之間有差異d。P-p=+（-）d=+（-）txS.E,S.E.=d/t.0.05水平,自由度為無限大時,t值約為2.
P.Q       P.Q          t（2）PQ
N=————  =—————— =——————
         (S.E.)（2） (d/t)（2）       d（2）
         令d=0.1P
            2（）PQ          4PQ             Q
         N=———————— =———————— =400X——
            （0.1P）()       0.02P()             P
2、若容許誤差d=0.15P,則
         Q
N=178X——
               P
3、若容許誤差d=0.20P,則
N=100XQ/P
4、抽樣調查腫瘤或其它發病率很低的疾病時，樣本大小可參考Poisson分布期望可信限表。
（二）病例對照研究（case-control  study），又稱回顧性研究（retrospective  studies），研究樣本大小可按下列分式計算。
         N=————————————

      Ka與Kb分別為a與b時正態分位數。可以隊表中查得。
      P1和P2分別為估計對照組與病例組有暴露史的比例。
      Q1=1-P1，  Q2=1-P2
      P=（P1+P2）/2，Q=1-P
      另，病例的暴露史可用下列公式估計：
      P2=（ORXP1）/（1-P1+ORXP1）
      OR為比值比。
                        附表  正態分布的分位數表
  KA（單側檢驗）
  KC（單側和雙側檢驗） Kb（雙側檢驗）
3.090
2.878
2.576
2.326
2.058
1.960
1.645
1.282    3.290
3.090
2.807
2.576
2.326
2.242
1.960
1.645
（三）隊列研究（cohort study）,又稱前瞻性研究(prospective studies).研究樣本大小可用下列公式計算：

但這里P1為暴露組的發病率，P0為非暴露組的發病率。
Q1=1-P0  ，                Q0=1-P0
P=（P0+P1）/2，             Q=1-P
如已知P0與估計某相對危險度（R），則
P1=RP0
（四）實驗研究
1、對于發病率在5%以上的疾病作實驗研究時，兩組需要的動物數（N1及N2）可用下列公式計算：

可信限為95%。T值為1.96按2計算。式中P1為對照組的預期發病率，q1=1-p1;p2為實驗組的預期發病率， q2=1-p2;N1為對照組需要的觀察數。
設N1=N2，上式中僅N為未知，將p、q值分別代入公式即可得N值。
2、對于發病率在5%以下，尤其是在1%以下的低發病率疾病的調查研究時，常采用泊松分布來推導樣本數。
四、試驗動物數的多少，除用上述公式計算和查表外，還應考慮以下幾個因素：
1、疾病的罹患率高低。
2、實驗措施有效率的高低。
3、要求實驗精確度的高低。
4、要求實驗組和對照組差異顯著性的程度。
5、兩組的均衡性即齊同必的好壞。
6、實驗分組越多，則樣本世紀數就需要增長率大。
五、實驗動物的分組必須考慮各組中動物的齊同性、隨機性、重復性等，盡量減少實驗田的偏差。實驗動物的隨機性分組方法詳細參閱有關書籍，常見方法有完全隨機設計、配對設計、隨機單位組設計和拉丁方法設計和正交設計等。
六、實驗中必須設立嚴格合理的對照。通過對照組可取得研究指標的數據差異、清除被試因素以外的其它因素對結果的影響等。
七、使用實驗動物務必記住節約二字，需要什么樣的動物園就使用什么樣的動物園，不要越級使用。在周密的設計和論證的基礎上，再提出實驗田動物的訂購計劃。
八、正式實驗之前的充分準備工作可以起到事半功倍的效果，通常預試期可以達到下列目的：
1、使試驗動物園習慣于試驗期的環境條件。
2、做好試驗動物的長勢、驅蟲、防疫注射等項準備工作以及對它們的健康觀察。
3、訓練試驗人員，熟練掌握操作規程。
4、考核試驗設計是否恰當和切實可行，發現部題及時糾正。
5、通過預試期得到統計數據，對試驗動物進一步審查、調整。一般要求預試期試驗動物園頭數應多于正式試驗的頭數；預試期的長短可因試驗要求而定，一般為15——20天。
九、實驗結果必須進行統計分析。
十、幾個使用動物園進行實驗的范例
1、 Z4+HVT二價活苗的實驗室免疫效力試驗；
2、 Z4保護力及其致瘤性測定；
3、應用粘附素單抗治療仔豬下痢的研究；
4、免疫血清的制備；
5、病毒常規毒力指標測定（包括使用雞鴨鵝胚）；
6、細菌毒力測定等。
第十三章電泳技術、層析技術
   有關電泳技術、層析技術已分別在前面各章節中討論，這里不再單獨贅述。對于剛開始實驗工作的人員請詳細參閱：
1、 Mononlonal  Antibodies：Principle  and  Practice James W.Goding
2、生化實驗技術與原理
隋德新
單克隆抗體:原理、方法及應用
劉秀梵

第四部分    家畜傳染病學實驗指導

目錄
家蓄傳染病學實驗規則
附  學生實驗守則
家蓄傳染病實驗報告內容
實驗一  碳疽的診斷
實驗二  巴氏桿菌病的診斷
實驗三  結核桿菌病和布氏桿菌病的檢疫
實驗四  豬瘟的診斷
實驗五  雞新城疫的診斷
Ⅰ、雞新城疫病毒的雞胚分離
Ⅱ、免疫熒光實驗
Ⅲ、HA和HI試驗
實驗六雞馬立克氏病的瓊擴診斷
實驗七  沙門氏菌快速檢驗試驗
實驗八  雞白痢的檢疫
家蓄傳染病學實驗規則
1、實驗前必須穿好工作服，實驗后必須認真洗手后方可離開實驗室。
2、實驗室禁止飲食、吸煙，勿以手指、器械等與面部接觸，以防感染。
3、操作時務須聚精會神，嚴肅認真，不得顧盼言他。
4、污染的器皿及廢棄病料、污水等均應嚴格按規定處理。
5、菌種、毒種不得擅自帶出實驗室。
6、愛惜實驗器械，若有損壞應主動登記、報告。
7、保持實驗室安靜、整潔。
8、實驗后，必須關好水電，清洗整理好本小組物品。
9、每次實驗完畢，值日生應認真預習，熟悉實驗內容，實驗完畢應以科學態度寫出實驗報告。
附一學生實驗手則
1、實驗前應認真預習，經教師質疑不合格者不得進行實驗。
2、服從教師指導，按規定和步驟進行實驗，認真地觀察和分析實驗對象，如實地記錄實驗數據，不得抄襲他人實驗結果。
3、要注意安全，愛護實驗用具和設備，節約水、電、氣和實驗材料等。
4、進入實驗室或實驗場地，必須衣著整齊，保持安靜，嚴禁談笑喧嘩、抽煙、隨地吐痰，更不得動用與本實驗無關的其他儀器設備或教學標本等。
5、認真作好實驗報告，凡不合格要求者，均須重做。
6、實驗完成后，主動整理好實驗用具，關好水、電、氣流，搞好清潔衛生。
7、凡違反實驗規程或擅自動用其它實驗用具、設備而導致損失者，必須寫出書面檢查，并按要求賠償損失，情節嚴重者給予紀律處分。
家蓄傳染病實驗報告內容
1、送檢病例情況簡述。
2、診斷程序和結果。
3、診斷意見。
4、分析和討論實驗結果。
5、實驗診斷注意事項。
實驗一  炭疽的診斷
一、目的
掌握炭疽的實驗室診斷步驟和方法；
學習和復習實驗室的基本操作方法；
二、實驗器材
試管架鐵絲簍酒精燈酒精棉球碘酒棉球剪刀鑷子解剖臺紗布搪瓷盆解剖刀鉑金耳消毒試管載玻片擦鏡紙鏡油染色缸吸水紙滴管平皿離心機天平玻璃鉛筆
10%甲醛溶液美蘭染色液瑞氏染色液革蘭氏染色液普通瓊脂平板血瓊脂平板肉湯培養基毛細滴管滴頭炭沉管紙盒炭疽沉淀血清1%新潔爾滅消毒液0.2%升汞消毒液新鮮移植菌種斜面純培養小白鼠
三、實驗動物的準備
實驗前一周著手準備，在嚴格隔離條件下進行，將炭疽桿菌菌種移植到一支肉湯培養基中，37℃培養12-18小時，用此幼齡培養物，小白鼠皮下或腹腔注射0.1-0. 2ml/只，小白鼠在注射后2-3天死亡，死鼠冷藏供實驗用。
實驗前一天，分別移植炭疽桿菌和枯草桿菌到血斜面上進行培養，供實驗時做對照用。
四、實驗步驟
1、無菌操作解剖小白鼠，從小白鼠脾臟或肝臟作細菌分離培養于普通平板、血平板和肉湯培養基中。
2、取脾、肝或血液在載玻片上作觸片或涂片。
3、用炭疽桿菌純培養物和枯草桿菌純培養物在另一塊載玻片上作涂片。
4、待步驟2、3中的觸片和涂片自然干燥，火焰固定，在5-10%甲醛溶液中浸泡10-15分鐘，滅活細菌，置玻片架上晾干。
5、組織觸片用美蘭染色，純培養物用革蘭氏染色，鏡檢，觀察細菌形態。
6、 Ascolis反應
取脾臟、肝臟數克剪成小塊，置消毒試管中，加3-5倍量生理鹽水，隔水煮沸30分鐘，2000轉/分離心15分鐘，吸取脂肪層下的溶液與炭疽沉淀血清作Ascolis反應。
示教實驗    串珠試管
五、思考題
1、炭疽桿菌的形態特征和培養特征主要有哪些？與枯草桿菌有什么區別？
2、 Ascolis反應的原理是什么？它在炭疽診斷中是否可靠？為什么？
3、炭疽桿菌在什么情況下能形成串珠現象？
4、肉聯廠發生了疑似炭疽，應如何盡快進行診斷和處理？
實驗二    巴氏桿菌病的診斷
一、目的
觀察雞巴氏桿菌病的臨床表現和病理變化；
掌握巴氏桿菌病的實驗室診斷方法。
二、實驗器材
美蘭染色液　　瑞氏染色液
載玻片　　染色缸　　吸水紙　　顯微鏡　　鏡油　　擦鏡紙
試管架　　鉑金耳　　酒精燈　　鑷子　　剪刀　　生理鹽水　　
肉湯培養基　　血平板　　酒精棉球　　0.1%新潔爾滅消毒液
送檢雞
三、實驗動物的準備
１、移植雞巴氏桿菌強毒株于一支血斜面和一支肉湯培養基上，３７℃培養２４小時。
２、用生理鹽水洗下血斜面上的巴氏桿菌菌落，制成菌懸液，取２０ｍｌ注射于小白鼠腹腔，小白鼠在２４－４８小時內死亡。
３、無菌操作解剖死鼠，去死鼠肝臟觸片，染色，鏡檢，若確為巴氏桿菌致死，則取出肝脾于玻璃磨碎器中，加入５－１０倍量的肉湯培養基或生理鹽水，磨碎，制成組織懸液，取該懸液0.3-0.4ml注射健康雞,肌注，通常雞在注射后24小時死亡，死雞供實驗用。
四、實驗步驟
１、解剖雞。無菌操作，自肝臟作細菌分離于血瓊脂平板，37℃培養16-24小時，觀察培養結果。
２、取肝、心血制觸片或涂片數張，美蘭和瑞氏染色，鏡檢，觀察細菌形態。
３、仔細觀察死亡雞病變（肌肉、皮下、肝、心包、心冠脂肪、肺、漿膜、粘膜等臟器組織病變），并做記錄。
４、示教組織中的巴氏桿菌。
五、思考題
１、巴氏桿菌的菌落和培養特性是什么？
２、為什么巴氏桿菌成兩極染色？
３、什么是巴氏桿菌的熒光現象？與致病菌性有無關系？
４、巴氏桿菌能致多種動物的疾病,其主要特點是什麼?
５、從病豬臟器分離到巴氏桿菌,,是否就可以確診為巴士桿菌病?為什么?
６、研制巴士桿菌疫苗要注意什么問題?

                     實驗三結核桿菌病和布氏桿菌病的檢疫
一，目的
      掌握結核桿菌病的變態反應診斷方法;
      掌握布氏桿菌病的血清學診斷方法..
二,實驗器材
消毒盒剪毛剪鑷子游標卡尺紗布  變態反應用金屬注射器和針頭結核菌素記錄表酒精棉球搪瓷盤  獸用16號針頭貼有標簽的無菌5ml試管膠鞋
  試管架干凈試管干凈吸管(1ml或5ml)100ml三角燒瓶    0.05%石炭酸生理鹽水布氏桿菌陽性診斷血清布氏桿菌試管凝集試驗用抗原被檢牛血清振蕩器  布氏桿菌陰性診斷血清
三,實驗步驟
(一) 第一次實驗（地址：牛場）
內容:變態反應皮內試驗和采血
1,將牛固定好.
2,在成牛頸側中部上1/3處剪毛,直徑為10cm
3,用游標卡尺測量術部中央皮皺厚度并作好記錄
4,術部用酒精棉球消毒
5,向術部中央注射0.2ml結核菌素,注射時應同時向前和向皮膚內用力,將針頭斜向刺進皮內,并應立即用左手固定針頭,或手慢慢將結核菌素注射進皮內。抽出針頭后,用手指檢查注射部位是否有突起的硬塊,若無硬塊必須重新注射。
6,尋找頸靜脈.
7,在頸靜脈處剪毛，術部用酒精棉球消毒.
8,左手按住頸靜脈的術部向心端,右手將16號針頭垂直或沿頸靜脈走向斜向刺入頸靜脈,調整針頭插入深度使靜脈血從針頭流出,立即用消毒試管收集流出的血液，在采血的過程中，左手始終要按緊頸靜脈的術部向心端,扎針時要看清突起的血管，果斷用力，力求一針見血.
9,每頭牛采3-5ml血液，送開左手后,右手拔出針頭,用酒精棉球消毒術部，在收集血液的試管上標記上相應的牛號.將采有血液的試管斜放，待凝固后，帶回實驗室分離血清，以便進行布氏桿菌凝集實驗.
   結核菌素點眼試驗(操作示范)
(1) 保定牛。
(2) 仔細檢查牛眼睛，發炎者不能做點眼試驗.
(3) 用左手拇指和食指將牛眼的上、下眼瞼分別向上、下翻張使眼結膜囊暴露，右手用1%硼酸棉球擦去眼周圍活物.
(4) 右手用滴管將結核菌素-5滴滴入眼結膜內，滴管頭不要接觸眼結膜。
(二) 第二次實驗（地址：牛場）
1 ，變態反應皮內實驗。必須在第一次注射結核菌素后，分別在７２小時和第１２０小時觀察注射局部的反應情況。主要是觀察有無炎癥反應,并測量皮皺厚度和腫脹面積的大小，據此判定試驗結果，對第72小時觀察，反應呈陰性或可疑的牛只須立即在第一次注射的同一部位，以同一劑量進行第二次注射，劑量同第一次。第二次注射后48小時(即第一次注射后第120小時)應在觀察一次.觀察情況均有詳細記錄。
變態反應點眼實驗應于點眼后3,6,9小時各觀察一次,并作好記錄，必要時可觀察第24小時的反應,觀察時可作翻眼檢查
（三）分離血清步驟
１、將試管中凝固的的血清檢樣，2000轉/分離心15分鐘。
２、將血凝塊上的血清用滴管吸至另一空的消毒試管中，然后將原試管上的牛號標簽貼至血清的試管上。
３、如果離心后仍無血清析出，可用干凈鐵絲插入管底，沿管壁移動鐵絲使血凝塊與試管分離，再離心，并重得步驟2。
４、血清置4℃冰箱保存，72小時內作布氏桿菌試管凝集試驗。
（四）布氏桿菌試管凝集試驗
１、操作方法表解如下：

試管號 1 2 3 4 5 6 7
稀釋倍數 1：25 1：50 1：100 1：200 1：400 陽性對照陰性對照
試
液

0.5%石炭酸生理鹽水 2.4

  0.1

  0.5 0.5

  0.5 0.5

0.5 0.5

0.5 布氏桿菌陽性診斷血清(1:100)
  0.5ml


棄0.5ml 布氏桿菌陰性診斷血清(1:100).

0.5ml
布氏桿菌診斷Ag(1:20)  0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
充分振蕩,混勻,37℃溫箱24小時,觀察結果
２、比濁管制備
3.5%石炭酸生理鹽水
布氏桿菌診斷Ag液(1:10)

清朗度
標記
1.0
0.75
0.5
0.25
0.0
0.6
0.25
0.5
0.75
1.0 100%
75%
50%
25&
0.0% ++++
+++
++
+
-
３、判定結果并記錄
四、思考題
１、本試驗中，如何觀察結果？確定為結核桿菌或布氏桿菌病陽性、可疑的標準各是什么？對陽性或可疑牛應如何處理？
２、犢牛變態反應皮內法的試驗部位是什么？注射劑量是多少？羊布氏桿菌凝集試驗用什么稀釋度？
３、家畜布氏桿菌的診斷方法有哪幾種？其優點各是什么？
４、在進行牛結核病菌變態反應診斷時，什么情況下春用皮內法？在什么情況下需同時用皮內和點眼兩種方法？為什么？
               實驗四豬瘟的診斷
I免疫酶組化法
一、目的
了解免疫酶組化法的一般程序和酶標記技術：
掌握用免疫酶組化法診斷豬瘟的方法。
實驗器材
  剪子、鑷子、100ml染色缸。載玻片、玻片ml試管、滴頭、1ml吸管、脫脂棉、吸水紙、擦鏡紙、顯微鏡、橡皮膏、酒精燈、鉑耳、1000ml燒杯、銅藍、攪拌器、磁捧、酒精棉球
500ml量筒、500ml三角燒瓶、大濾斗。
酶標抗體、PH7.2 0.015M PBS、1%NaN2、1%H2O2、Tris_HCL緩沖液、DAB 、4℃丙酮、病豬血液（抗菌素凝血）、病豬臟器、水浴箱。
二、溶液配制
１、 PH7.6  0.05Mtris_HCL緩沖液:
   0.2M  Tris(24.24g/l)    250ml
   0.1N  HCL(8.4ml/L)       375ml
   NaCL                         7.6g
   DW                            1000ml
2、0.01%H2O2、NaN2、PH7。6  0.05M  Tis-HCL,緩沖液,用作內源酶滅活液:
   取PH7.6  0.05M  Tris-HCL緩沖液98ml,加1%H2O2 1ml和1%NaN2  ,1ml即成.
3底物液：PH7.6  0.05M  Tris-HCL緩沖液100ml加DAB75mg,避光攪拌3小時,使其溶解,濾紙過濾.臨用前加工廠%H2O2  0,5ml.
四、實驗動物的準備
用豬瘟自然病例或人工感染豬病料作實驗。
人工感染需要在實驗前四天用豬瘟強毒（血毒）注射40斤左右的豬瘟易感豬，2ml/只，肌注。豬在3-4天后發病死亡，臨死前采豬心臟血，抗凝，以備做白細胞涂片。
解剖豬，采淋巴結、脾、扁桃體，各做組織觸片。
五、實驗田步驟
１、制片
（1）取試管中抗凝血漿層置另一空試管中3000r/ml15分鐘，棄血漿，用生理鹽水將試管中的沉積細胞洗一次，最后用0.1-0.3ml生理鹽水懸浮沉積細胞,取2鉑耳在載玻片上作2個均勻的涂片.自然干燥.
（2）用脾、腎、淋巴結、扁桃體等臟器中的一種在載片上作兩個橫切觸面，自然干燥。
（3）對兩張片子作正反、左右標記。
２、固定
將玻片置染色缸中，用4℃丙酮固定10分鐘。
３、滅活內源酶
取內源酶滅活液100ml于待檢玻片的染色中，室溫滅活30分鐘，將玻片取出，流動的PBS洗15分鐘，再換去離子水洗10分鐘，取出玻片，自然干燥。
４、酶染
用1mlPBS溶解一支凍干豬瘟標抗體制劑，在玻片左邊的觸（涂）面上滴加2滴豬瘟酶標抗體液并涂開，使其覆蓋觸（涂）面，右邊用PBS覆蓋作對照，將玻片平放在玻片上，置37℃45分鐘，取出玻片，流動的PBS洗15分鐘。
５、顯色
取底物液100ml于放有檢樣玻片染缸中，置室溫。避光，30分鐘。取出玻片，流動的去離子水洗15分鐘，使其干燥。
６、鏡檢
   若左邊觸（涂）面中細胞漿呈棕黃色，細胞核無色，右邊對照不顯色者，則為陽性；否則為陰性。
７、認真觀察病變。
II免疫熒光試驗
一、目的
  掌握免疫熒光試驗的方法及原理。
二、實驗步驟
１、制片、固定同前法。
２、加染熒光抗體
在玻片左邊的觸（涂）面上滴2滴豬瘟熒光抗體液并涂開，右邊用PBS作對照，將玻片平放在玻片架上，置37℃45分鐘，其后PHS（PH7.4,0.01M）洗15分鐘。
３、晾干玻片后，鏡檢。若左邊觸（涂）面中細胞漿呈特異性黃綠色熒光，右邊對照不呈色者，則為陽性；否則為陰性。
III、示教實驗
１、 ELISA試驗檢測豬瘟抗；
２、豬瘟病毒單克隆抗體的診斷應用；
３、感染豬瘟病毒PK-15細胞的IIF。
IV思考題
１、為什么要對觸（涂）片進行固定？
２、為什么要滅活內源酶？機理是什么？
３、免疫酶組化法和常規ELISA有何異同點？優缺點是什么？
４、診斷豬瘟還可用哪些方法？
         實驗五雞新城疫的診斷
I、雞新疫病毒的雞胚分離
一、目的
掌握利用雞胚分離病料中的NDV；
熟悉雞胚接種方法。
二、實驗器材
碘酒棉球、酒精棉球    錐子    蛋架    10ml滅菌管    1ml  、5ml吸管  玻璃研磨器    1ml注射器       5號針頭          9-10齡雞胚    生理鹽水
青霉素雙抗液（1萬iu/ml）    離心機       天平    剪刀       鑷子  玻璃
鉛筆    ND病死雞       透明膠布       照蛋器
三、實驗動物的準備
將NDV強毒做1：100稀釋注射健康的NDV易感小雞（1月齡左右），0.2ml/只胸肌注射,小雞將在注射后48小時左右死亡.死亡雞盡快進行實驗.
亦可從ND自然病雞分離病毒.
四、實驗步驟
１、無菌操作，沿死雞顱腔邊剪開顱骨，用鑷子除去頭蓋骨，使腦髓暴露。
２、取約1g（蠶豆大小）腦髓置玻璃磨器內，并加少量生理鹽水，磨碎，再補加生理鹽水使總量約為5ml。然后加入雙抗液0.5ml（最終濃度達1000iu/ml），置37℃作用20分鐘，離心，2000轉/分，15分鐘。
３、取上清液接種雞胚尿囊腔
（1）照蛋。在靠近氣室的下方，避開大血管，用玻璃鉛筆標記接種點。
（2）消毒。打孔。
（3）接種：將針頭以與蛋殼成30（度）角的方向刺入尿囊腔，向尿囊腔內接種經步驟2處理的病料上清液0.1ml,注射速度宜慢.
（4）用透明膠布封口.
４、接種24小時開始照蛋，每天上、下午各照一次，棄去24小時內死亡的雞胚，24小時以后死亡的雞胚，置鐵簍中，大頭朝上，置4-8℃備做HA、HI試驗。
５、觀察死亡雞的病變并做記錄。
II、免疫熒光試驗
一、目的
了解免疫技術的一般程序和熒光抗體的制備；
掌握利用抗NDV單克隆抗體和間接免疫熒光技術診斷ND的方法。
二、實驗器材
抗NDV單抗    兔抗鼠熒光抗體       PH7.2 0.01MPBS 銅藍    丙酮    蒸餾水       載玻片(潔凈無油)       1000ml燒杯       磁棒    磁力攪拌器
滴管吸水紙剪刀    外科手術刀鑷子病死雞(新鮮)
三、實驗動物的準備
同實驗I
四、實驗步驟
１、無菌操作，解剖雞。
２、取腦、肺、脾和盲腸扁桃體，用切面在載玻片上作兩個很薄的壓印，自然干燥。
３、壓印片置盛有4℃丙酮的染色缸內固定10分鐘，取出自然蒸發干燥。
４、壓印片置染色架上，一個壓印面上加NDV單抗液數滴覆蓋，另一個壓印面上加PBS覆蓋作對照，染色架置于37℃飽和水汽中（可置于水浴箱中）作用30分鐘。
５、取出載玻片，用去離子水和蒸餾水漂洗后，置銅藍中，流動PBS沖洗30分鐘，15分鐘換液一次，取出，吸水紙吸干并充分干燥。
６、將工作濃度稀釋的兔抗鼠熒光抗體加于蓋玻片的兩個圖片上，置37℃水浴作用30分鐘。
７、流動的PBS沖洗30分鐘，15分鐘換液一次，自然干燥。
８、鏡檢
      凡組織胞漿內出現蘭綠色熒光或熒光顆粒而細胞核無熒光的判為陽性，否則為陰性。
Ⅲ、血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗
一、目的
了解和HA和HI試驗并用于診斷ND
二、實驗器材
蛋架鑷子滴管    10ml試管    微量血凝板    磨平滴管生理鹽水    振蕩器    大平皿    1ml吸管試管架    碘酒棉球 1%雞紅血球    NDV陽性抗血清搪瓷盤疑似ND病料接種致死的雞胚（見實驗I）
三、實驗步驟
（一） HA、HI試驗
１、無菌操作，收獲雞胚尿囊腔液。
２、作HA試驗，測出血凝價。
３、作HI試驗，測出血凝抑制價。
４、觀察雞胚病變，并做記錄。
HA試驗操作方法表解如下：
      試管號 1    2    3    4    5    6 7 8    9
      稀釋倍數 1：10 2：10  1：40 1：80 1：160 1：320 1：640 1：1280 對照
試       生理鹽水
      1:5稀釋尿囊液
液 0.5%雞紅血球 0.5
0.5
0.5 0.5
0.5
0.5 0.5
0.5
0.5 0.5
0.5
0.5 0.5
0.5
0.5 0.5
0.5
0.5 0.5
0.5
0.5 0.5
0.5
0.5    0.5
棄 0.5
   0.5
混勻,置室溫20-30分鐘觀察結果
結果舉例 # # # # # # ++ -- --
表1所示HA價為1:320
                              表2  HA-微量法(單位:滴)
孔號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
稀釋倍數 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 對照
生理鹽水 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
尿囊原液 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
0.5%雞紅血球 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
                              混勻,置室溫20-30分鐘,觀察結果
結果舉例 # # # # # # # # # # # #
表2所示HA價為1:256
表3  HI-試管法(單位:ml)
試管號 1 2 3 4 5 6 7 8 9
稀釋倍數 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 對照
尿囊液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 棄0.5
1:5稀釋的抗NDV血清 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
                                 混勻,置室溫30分鐘
0.5%雞紅血球 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
混勻置室溫20-30分鐘觀察結果
結果舉例 - - - - - + ++ # -
表3所示HI價為1:160
                           表4 HI-微量法(單位:滴)
孔號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
稀釋倍數 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 對照
尿囊液 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 棄1
抗NDV血清 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
混勻,置室溫30分鐘觀察結果
0.5%雞紅血球 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
混勻,置室溫20-30分鐘
結果舉例 - - - - - - - + ++ +++ # -
表4所示HI價為1:128
注:若HA價是1:320,則0.5ml1：160稀釋的尿囊液中含2iu病毒，0.5ml1:80稀釋的尿囊液中含4iu病毒,0.5ml1:40稀釋的尿囊液中含8iu病毒.
   HI試驗用搞原直接稀釋血清法,表3和表4中,第1管(孔)用0.5ml含水8個iu病毒的尿囊液,第2—4管(或2—12孔)用0.5ml含4個iu病毒的尿囊液.
四、思考題
１、什么叫血凝價（HA價）？什么叫血凝單位？什么叫血凝抑制價？
２、為什么診斷ND要做HI 試驗？
３、 HA和HI試驗在家畜傳染病學上應用有哪些？
４、為什么NDV具有自動解凝現象？解凝后的紅細胞能否再被NDV凝集？
５、如何判定HA和HI試驗結果？
IV、示教試驗
１、 NDV單抗分型試驗（IIF）？
２、單抗夾心ELISA試驗檢測NDV。
      實驗六       雞馬立克病的瓊擴診斷
一、目的
掌握瓊脂板的制作方法和利用雙向瓊擴試驗診斷ND。
二、實驗器材
干凈大平皿打孔器    打孔圖紙       16號針頭    7號針頭       磨平針頭
剪刀    鑷子       試管架    搪瓷盤       天平    鋁鍋       電爐    玻棒
10ml吸管    毛細滴管       滴頭       紅鉛筆       橡皮膏    濕盒    陽性羽根
瓊脂粉    氯化鈉       量管    蒸餾水       示教平板
三、實驗步驟
（一）瓊脂板制備
１、  稱取瓊脂粉4g，NaCL  400g鋁鍋內加蒸餾水500ml，煮沸溶化。
２、澆瓊脂板，每只直徑90mm平皿傾注溶化的0.8%瓊脂液18—20ml,然后將平皿置于水平的桌面上,使其自然凝固成厚度均勻的瓊脂平板。
３、按試驗的需要打孔，燙孔。
（二）羽根瓊擴試驗
１、按打孔圖紙所示模式打孔，燙孔。
２、每只受檢雞拔取6根新羽（最好是羽根帶血的新羽），剪下羽根，長約0.5ｃｍ。
３、在孔內加抗MD陽性血清。
４、距血清孔內約3mm的四周上均勻六點垂直插入同一只雞的六根羽根，并做陽性羽根對照。在平皿壁上標記受檢的號碼。
５、平皿置濕盒中，于37℃進行擴散。
６、 24小時后觀察結果，同一只雞的六根羽根只要有一根與抗MD陽性血清孔間出現沉淀即可判定為MD陽性雞。
（三）血清瓊擴和羽根浸液瓊擴試驗
１、受檢雞血清分離
以帶20號針頭的1ml玻璃注射器從雞翅靜脈采血約0.5ml注入滅菌試管，也可以刺破靜脈后，將一滅菌試管靠近流血處使血流流入試管約0.5ml，將試管擺成斜面，待血凝固，血清析出，供實驗用。
２、羽根浸液的制備
將受檢雞新生羽根10條放在小試管內，加生理鹽水約0.5ml，用玻璃棒輕壓羽根，使囊內的MDV浸出，上清液供實驗用。
３、按打孔圖紙模式打孔、燙孔，共九個區。
４、實驗程序
（1）血清瓊擴
將MD診斷抗原液加入中間孔，受檢雞血清加入周圍孔，每個檢樣用一孔，并設抗MD 陽性血清對照，每區最接近平皿壁的孔定為第1孔，由此按順時針方向定為2、3、4、5、6孔，在記錄本上記下與孔號相對應的雞號。
（2）羽根浸液瓊擴
將MD陽性血清加入中間孔，受檢羽根浸液加周圍孔，每個檢樣用一孔，并設陽性MD 抗原對照，記錄雞號的方法，同血清瓊擴。
５、將平皿置濕清加入中，于37℃進行擴散。
６、 24小時后觀察實驗結果，出現沉淀線則為MD陽性雞。
四、思考題
１、羽根瓊擴和血清瓊擴各適用于何種月齡的雞的MD診斷？為什么？
２、血清瓊擴在實際工作中還可用于哪些禽病的診斷？
３、用雞血清進行瓊擴試驗，應用什么濃度NaCL 的瓊脂板？
４、瓊擴試驗的原理是什么？
５、瓊脂平板的保存應注意什么問題？
五、示教試驗：MDV單抗分型鑒定（IIF）
   注：雞傳染性法氏囊病（IBD）的瓊擴診斷是取待檢雞血清與傳染性法氏囊病診斷抗原作瓊擴試驗，其原理和操作方法同MD 的血清瓊擴試驗。
         實驗七沙門氏菌快速檢驗試驗
一、目的
   了解沙門氏菌快速檢驗的方法和原理；
   掌握FA和ELISA的操作步驟
二實驗器材
使用儀器、器械、試液，請參閱前述有關章節模擬待檢樣品
  三實驗步驟
（一）直接免疫熒光試驗檢測沙門氏菌
１、取勝模擬樣品增菌培養物10ml，于載玻片上涂成2cm（）面積的薄膜，空氣干燥。
２、以4℃或-20丙酮固定涂膜，室溫10—15分鐘，晾干。
３、加染熒光抗體（FITC標記兔抗菌素沙門氏菌血清或O 抗菌素原單抗），37℃45分鐘。
４、 PBS  PH7.4  0.01M攪拌下洗滌10分鐘,晾干.
５、于熒光鏡下鏡檢，陽性樣品在細菌四周有特異性黃綠色熒光，而陰性樣品未見黃綠色熒光。
（二）單抗夾心ELISA試驗檢測沙門氏菌
１、以方陣試驗確定單抗包被濃度和酶標制劑的使用濃度。
２、以pH9.6碳酸鹽緩沖液包被單抗，100ul/孔，4℃過夜，或37℃2hr。
３、PBST洗滌三次。
４、以10%CFS-PBS封閉37℃3hr。
５、PBST洗滌三次。
６、加模擬樣品增菌液，100ul/孔,室溫15分鐘。
７、PBST洗滌三次。
８、加新配套OPD底物緩沖液，100ul/孔,室溫15分鐘。
９、2M HSO終止反應（100ul/孔）。
10、加新配OPP底物緩沖液，100ul/孔，室溫15分鐘。
11、2M H2SO4終止反應（100ul/孔）
12、肉眼判定或測定OD496值。
（三）示教試驗沙門氏菌O-I噬菌體裂解試驗。

         實驗八  雞白痢的診斷
一、目的
掌握快速全血平板凝集反應并用來診斷雞白痢。
二、實驗器材
小搪瓷盤鐵絲環滴管玻璃板干凈紗布    24號針頭 7號針頭    滅菌大平皿
生理鹽水雞白痢凝集抗原液
三、實驗步驟
（一）快速全血平板凝集試驗
１、將雞白痢診斷抗原液充分振蕩混勻，用滴管吸取抗原滴2滴于玻板上。
２、一人保定雞，另一人用7號針頭刺破被檢雞的翅靜脈使其出血。
３、用鐵絲環沾取一滴環血液與玻板上的抗原液攪拌均勻，并涂開至直徑約1.5cm大小的涂面。
４、 25℃時，于2分鐘內出現明顯的凝集顆粒或凝集片則為陽性反應。
（二）示教實驗
１、雞白痢沙門氏菌的分離鑒定；
２、間接血凝試驗；
３、瓊脂擴散沉淀試驗；
４、抗體競爭ELISA試驗。
注：雞慢性呼吸道病的現場診斷是慢性呼吸病平板凝集抗原與受檢全血做凝集試驗。操作方法同雞白痢的快速全血玻板凝集實驗。

作者: 順風 時間: 2007-11-5 12:43
深深感謝樓主的慷慨行為！　　　　　　　　　　　

作者: ligye123 時間: 2007-11-5 16:17
樓主辛苦了!太感謝了!

作者: hzpig 時間: 2007-11-14 17:57
感謝樓主分享如此詳盡的好資料

作者: xiangtl168 時間: 2008-8-26 00:16
太辛苦了，我們連論壇幣就不用花了！謝謝了！！！！！

作者: jasminedl 時間: 2008-10-28 10:36
我怎么看不到內容？

作者: jasminedl 時間: 2008-10-28 10:48
現在看到了~~~~~~~~~~~~:tiaotiao:

作者: qiaoqiao 時間: 2008-12-30 23:33
感謝感謝。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。

作者: jiexiaodi 時間: 2009-2-12 16:07
真是非常感謝樓主，這是我找了很多地方都沒有找到的好東西啊

作者: ruiangulai 時間: 2009-4-20 08:35
資料十分詳細，太感謝了。

作者: 白鶴 時間: 2009-4-20 08:50
資料十分詳細，太感謝了

作者: xishanzhongke 時間: 2009-4-20 09:02
強烈建議該貼加精！

作者: 020712002 時間: 2009-8-8 10:41
真希望樓主把文件壓縮，下載方便

作者: 616842768 時間: 2009-8-14 19:00
好啊真的好太好了

作者: 王存海 時間: 2009-8-14 22:51
資源共享的品德值得學習

作者: jackwang 時間: 2009-8-16 22:59
樓主簡直是雪中送炭啊，敬禮！！！！

作者: 斯諾 時間: 2009-8-19 09:10
很實用呀，我正在弄一個實驗室，很多東西可以用的上！謝謝分享！

作者: kcwwy 時間: 2010-9-21 20:50
謝謝樓主的辛苦

作者: kcwwy 時間: 2010-11-7 11:01
樓主辛苦了

作者: kcwwy 時間: 2010-11-7 11:02
沒有看到資料

作者: kcwwy 時間: 2010-11-7 11:07
樓主能不能給我發一份資料xiaoyong8734@163.com,xiexie

作者: 高永長 時間: 2010-11-7 11:26
給我們省了，謝謝了

作者: 高永長 時間: 2010-11-7 11:27
給我們省了，謝謝了

作者: tom06 時間: 2011-1-5 16:04
深深感謝樓主的慷慨行為！

歡迎光臨畜牧人 (http://www.cqnsfzw.com/)