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畜牧人

標(biāo)題: 轉(zhuǎn)基因技術(shù)與動(dòng)物育種 [打印本頁(yè)]

作者: shigang 時(shí)間: 2009-4-9 17:25
標(biāo)題: 轉(zhuǎn)基因技術(shù)與動(dòng)物育種
轉(zhuǎn)基因技術(shù)與動(dòng)物育種
摘
要：從20世紀(jì)80年代中后期以來(lái)，現(xiàn)代生物技術(shù)的出現(xiàn)和各種分子生物技術(shù)的應(yīng)用，使動(dòng)物育種已開(kāi)始從群體水平進(jìn)入分子水平。轉(zhuǎn)基因技術(shù)最為21世紀(jì)發(fā)展最為迅速的生物高新技術(shù)之一，隨著其不斷發(fā)展在動(dòng)物育種中取的很大的成果。因此轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有誘人的前景和發(fā)展前途。本文簡(jiǎn)要總述了轉(zhuǎn)基因技術(shù)的原理、方法、研究前沿領(lǐng)域以及應(yīng)用與動(dòng)物育種的進(jìn)展情況。
關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因技術(shù)
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物
動(dòng)物育種
引言:常規(guī)育種方法是建立在利用種內(nèi)遺傳變異的基礎(chǔ)之上的。但對(duì)于遠(yuǎn)緣生物的雜交是及其困難的，有些甚至是不可能的，這就是眾所周知的種間生殖隔離。那么能否打破這種隔離，使一種生物同時(shí)具有一種或幾種生物的優(yōu)良性狀，進(jìn)而培育符合人們意愿的生物新品種，更好的服務(wù)于人類？科學(xué)家們經(jīng)過(guò)多年艱苦的努力和探索，已經(jīng)使其成為可能，這就是在基因工程發(fā)展的基礎(chǔ)上，融基因工程和胚胎工程為一體的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。這種技術(shù)的應(yīng)用可以打破這種種的界限而使育種工作可以充分利用所有遺傳變異，其實(shí)質(zhì)就是通過(guò)對(duì)胚胎導(dǎo)入、去除或抑制部分基因，培養(yǎng)出獨(dú)具特色的動(dòng)物。自Palmiter和Brinster1982年將大白鼠生長(zhǎng)激素基因顯微注射到小白鼠受精卵獲得比正常小鼠大1倍的“超級(jí)巨鼠”以來(lái)，世界各國(guó)科學(xué)家競(jìng)相開(kāi)展轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究，通過(guò)多種轉(zhuǎn)基因方法在豬、牛、雞、兔、羊等動(dòng)物上獲得成功。轉(zhuǎn)基因技術(shù)不僅可以加快改良遺傳性狀的進(jìn)程，使選擇的效率提高，改良的機(jī)會(huì)更多，而且可以提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度以及動(dòng)物的抗病力。如今轉(zhuǎn)基因技術(shù)正在對(duì)動(dòng)物育種產(chǎn)生一場(chǎng)新的革命[1]。
1 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的概述
1.1轉(zhuǎn)基因技術(shù)的概念

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是一門起始于20世紀(jì)70年代高新技術(shù)，是按照科研和生產(chǎn)需要在分子水平上用人工方法提取或合成不同生物的遺傳物質(zhì)（DNA片段）,然后在體外切割,并連接形成重組 DNA,重組DNA再與載體的遺傳物質(zhì)重新組合，將其引入到?jīng)]有DNA的受體細(xì)胞中，進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，生產(chǎn)出符合人類需要的產(chǎn)品或創(chuàng)造出生物的新性狀,并使之能穩(wěn)定地遺傳給下一代[2]。簡(jiǎn)要地說(shuō)是指將體外重組DNA通過(guò)顯微注射或載體系統(tǒng)導(dǎo)入胚胎細(xì)胞中，并整合到基因組中，得到穩(wěn)定地表達(dá)的技術(shù)[3]。
1.2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的概念

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)是在20世紀(jì)80年代初發(fā)展起來(lái)的。從這項(xiàng)技術(shù)誕生的那天起,它就在改良畜禽生產(chǎn)性狀、提高畜禽抗病力以及利用轉(zhuǎn)基因畜禽生產(chǎn)非常規(guī)畜牧產(chǎn)品(如人藥用蛋白和工業(yè)用酶)等方面顯示了廣闊的應(yīng)用前景[4]。它是將外源基因或體外重組的基因轉(zhuǎn)移到動(dòng)物的受精卵內(nèi),使其在隨后發(fā)育的動(dòng)物體內(nèi)得到整合和表達(dá)，以產(chǎn)生具有新的遺傳特征或性狀的動(dòng)物個(gè)體的過(guò)程，或者是將外源基因在特定調(diào)控元件作用下在某些宿主組織中進(jìn)行獨(dú)立的復(fù)制,并在一定的時(shí)間內(nèi)表達(dá)外源蛋白的過(guò)程[1]。
1.3轉(zhuǎn)入基因的選擇[5]

目前，在動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的選擇上主要考慮能提高動(dòng)物的生長(zhǎng)速度、產(chǎn)生性能、繁殖性能、抗性及開(kāi)拓新的經(jīng)濟(jì)用途等幾個(gè)方面，主要包括四大類: 1）編碼蛋白基因，這類基因參與機(jī)體組織生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)，如生長(zhǎng)激素基因等；2）抗性基因，抗逆、抗病等; 3）經(jīng)濟(jì)性狀的主效基因，如豬和綿羊的高繁殖力基因和肉牛的“雙肌”基因等，這些基因與動(dòng)物的生產(chǎn)力密切相關(guān)；4）治療人類疾病所需的蛋白質(zhì)基因,以拓寬動(dòng)物的經(jīng)濟(jì)用途

1.4轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的遺傳修飾策略[6]
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的遺傳修飾策略包括：
（1）導(dǎo)致產(chǎn)生新功能的基因組修飾（gain of function,GOF）,主要有普通轉(zhuǎn)基因及基因重復(fù)；
（2）導(dǎo)致功能丟失的基因組修飾（loss of function, LOF），主要有插入突變、大片段缺失突變、點(diǎn)突變及條件性基因缺失突變；
（3）導(dǎo)致基因替換的基因組修飾，主要利用基因打靶技術(shù)使替換位點(diǎn)上的內(nèi)源基因被另一個(gè)基因取代，使得內(nèi)源基因丟失的同時(shí)，獲得另外一個(gè)基因的功能，這種策略通常比較精確，不影響鄰近位點(diǎn)基因結(jié)構(gòu)；
（4）染色體畸變。
1.5 生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一般步驟包括[5]:
（1）選擇能有效表達(dá)的蛋白質(zhì)。

（2）克隆與分離編碼這些蛋白質(zhì)的基因。

（3）選擇能與所需動(dòng)物組織特異性表達(dá)方式相適應(yīng)的基因調(diào)節(jié)序列。

（4）把調(diào)節(jié)序列與結(jié)構(gòu)基因重組拼接，并在培養(yǎng)細(xì)胞或小鼠中預(yù)先檢驗(yàn)其表達(dá)情況。

（5）把拼接的基因引入到受精卵的細(xì)胞核中。

（6）把引入后的受精卵移植到子宮，完成胚胎發(fā)育。

（7）檢測(cè)幼畜是否整合外源基因、外源基因的表達(dá)情況以及外源基因在其后代中的傳遞情況。部分后代細(xì)胞攜帶有轉(zhuǎn)入的外源基因，利用這些動(dòng)物培育的新的品系。
2 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的一般方法

使動(dòng)物組織能夠特異性地表達(dá)外源蛋白質(zhì)，需要人為地將編碼這種蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)移到動(dòng)物的胚胎中,使目的基因能夠整合到動(dòng)物染色體上，進(jìn)而得到表達(dá) [7] 。
制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法主要有以下幾種。
2.1顯微注射法
是由美國(guó)人Gordon于1980 年首次發(fā)明。顯微注射法的制作過(guò)程是將SV40 的TK基因整合的質(zhì)粒以顯微注射法注入到小鼠受精卵原核中,首次成功地培育出轉(zhuǎn)基因小鼠。其基本原理是通過(guò)顯微鏡注射將外源基因直接注射到受精卵的雄原核內(nèi),將外源基因整合到DNA 中,發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。其優(yōu)點(diǎn)是直接對(duì)基因進(jìn)行操作,整合率較高.缺點(diǎn)是技術(shù)難度高,成功率低[8,9,10,11]。
2.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒傳染法

此法的研究是1974 年Janenissh等將SV40DNA注入小鼠囊胚腔中，獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。其原理是利用逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs區(qū)域具有的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性這一特點(diǎn)，將外源基因連接到 LTRs的下部進(jìn)行重組后，再使之包裝成為高滴度的病毒顆粒，直接感染受精卵或注入囊胚中，攜帶外源基因的反轉(zhuǎn)錄病毒DNA可以整合到宿主染色體上。逆轉(zhuǎn)錄病毒法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，外源基因的整合率高，動(dòng)物病毒所具有的啟動(dòng)子不但可以引發(fā)一些選擇標(biāo)記基因的表達(dá)，還能引發(fā)所導(dǎo)入的外源基因的表達(dá)，缺點(diǎn)是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體容量有限并且外源基因

難以植入生殖系統(tǒng)。成功率較低。而且逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體具有致癌性，所攜帶的外源基因片段的長(zhǎng)度受到限制，一般不超過(guò)10kb [8,12,13,14,15]
。
2.3精子載體法
Lavitrano等1989 年首次報(bào)道把PSV CAT質(zhì)粒與小鼠的附睪精子共育30min,進(jìn)行體外受精和移植,獲得了陽(yáng)性鼠并能遺傳給后代。但不少實(shí)驗(yàn)利用相似的方法進(jìn)行研究，未能重復(fù)這一結(jié)果。直到十年后Anthomy等才驗(yàn)證了這一事實(shí)。其原理是直接用精子作為外源DNA載體的基因轉(zhuǎn)移法，精子直接與外源的DNA混合培養(yǎng)，外源基因可以進(jìn)入精子頭部，受精后可以發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是利用精子的自然屬性克服人為機(jī)械操作給胚胎
的損傷，整合率高，成本低。缺點(diǎn)是結(jié)果不穩(wěn)定 [9, 10,11,13,15,16]
。
2.4 體細(xì)胞核移植法

1997 年，英國(guó)PPL公司的科學(xué)家Schnieke與羅斯林研究所的Wilmut等聯(lián)手通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)率先在世界上制作了轉(zhuǎn)基因綿羊Dolly。研究者將人凝血因子IX基因整合到羊胎兒的成纖細(xì)胞中，然后用整合了IX基因的羊胎兒成纖細(xì)胞作核供體，獲得了3只轉(zhuǎn)基因綿羊（其中一只生后不久死去）。該技術(shù)的步驟是：首先將外源基因?qū)氲襟w細(xì)胞中，再將該細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，選擇其中有外源基因的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，再把這種細(xì)胞的細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞中，將重組胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)或者植入同步化的假孕動(dòng)物的輸卵管進(jìn)行動(dòng)物克隆，從而獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。體細(xì)胞核移植制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物總效率高于原核顯微注射法，另外可以在核移植前選擇后代的性別，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代遺傳背景及遺傳穩(wěn)定性一致，故不需選配，僅一代就可建立轉(zhuǎn)基因群體，節(jié)約時(shí)間和費(fèi)用。存在的問(wèn)題是研究基礎(chǔ)較為薄弱，體細(xì)胞系難以建立，細(xì)胞的傳代次數(shù)有限，成功率低 [10,14,17,18,19,20,21]
。
2.5 胚胎干細(xì)胞法
胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞,Embryo
Stem
Cell)
指囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中尚未進(jìn)行分化的細(xì)胞。這種細(xì)胞具有類似癌細(xì)胞無(wú)限繁殖和高度分化的潛能，將目的基因轉(zhuǎn)移入ES細(xì)胞導(dǎo)入囊胚或經(jīng)篩選后對(duì)轉(zhuǎn)入外源基因的ES細(xì)胞進(jìn)行克隆，可培育轉(zhuǎn)基因個(gè)體。1981 年Evans等用不同的培養(yǎng)系統(tǒng)從小鼠囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離開(kāi)建立了多潛能干細(xì)胞。Bradly等于1984年用顯微注射法將從 129/SV/EV 鼠中分離的ES細(xì)胞株移植到胚泡腔，植入受體母鼠子宮，發(fā)育成生殖嵌合體。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，可對(duì)轉(zhuǎn)化的干細(xì)胞進(jìn)行陽(yáng)性選擇，提高了轉(zhuǎn)基因效率；可以克服外源基因隨機(jī)整和所帶來(lái)的一些弊端，而且可在體外條件下對(duì)外源今音的表達(dá)進(jìn)行篩選，為創(chuàng)造特定的預(yù)知轉(zhuǎn)基因動(dòng)物開(kāi)拓了一條新的途徑。缺點(diǎn)是第一代一般是嵌合體，很難把外源基因遺傳給后代；而動(dòng)物育種需經(jīng)過(guò)嵌合體途徑，受ES細(xì)胞的生殖嵌合能力以及交配概率的影響，實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng) [8,13,14,17,18,22]
。
2.6
人工酵母染色體法
人工件木染色體法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型載體，能夠克隆出百萬(wàn)堿基對(duì)的大片段外源DNA 。該方法可以通過(guò)兩條技術(shù)途徑達(dá)到轉(zhuǎn)基因的目的。第一條途徑是胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染酵母人工染色體后，體外篩選。陽(yáng)性胚胎干細(xì)胞囊胚腔注射；第二條途徑是酵母人工染色體的原核注射。其優(yōu)點(diǎn)是：（1）保證巨大基因的完整性；（2 ）保證較長(zhǎng)的外源片段在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中的整合率提高；（3）鑒于基因的完整性，目的基因上下游側(cè)翼序列可以消除或減弱基因整合后的位置不變。因此，人工酵母染色體法具有廣闊的應(yīng)用前景。Fujiwara等建立210KB人工酵母染色體DNA轉(zhuǎn)基因小鼠，在乳腺獲得高水平表達(dá)人乳白蛋白，而未表現(xiàn)出普通轉(zhuǎn)基因鼠所出現(xiàn)的位置效應(yīng) [14,15,18,22]
。
2.7
基因打靶技術(shù)

基因打靶技術(shù)，也稱定位整合技術(shù)。基因打靶的方法是將細(xì)胞基因組中的某一序列克隆并加以改造后重新導(dǎo)入細(xì)胞中，這一序列就可以與基因組內(nèi)的同源序列發(fā)生重組，從而將改造后的基因轉(zhuǎn)移到基因組沒(méi)，實(shí)現(xiàn)基因的定位突變。1988 年Mansow首次采用該技術(shù)使轉(zhuǎn)移基因在體內(nèi)的定點(diǎn)整個(gè)成為現(xiàn)實(shí)，產(chǎn)生了敲除特定基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。該技術(shù)的方法包括基因敲除和基因契入，同源重組等方法。此方法的優(yōu)點(diǎn)在于清除了盲目性和偶然性，并且整合位點(diǎn)，精確表達(dá)水平高。其缺點(diǎn)是產(chǎn)生的串聯(lián)重復(fù)序列不穩(wěn)定，能自發(fā)進(jìn)行二次同源重組
[8,11,12,14,16,18]
。
2.8
原始生殖細(xì)胞技術(shù)

原始生殖細(xì)胞（Primordial germ cell,PGC ）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)在原理和方法上與ES細(xì)胞技術(shù)相似。而且制作轉(zhuǎn)基因家禽方面有明顯的優(yōu)勢(shì)。Brimster將ZF---LacZ系供小鼠的PGC植入C57B2/6XSTL雜交一代小鼠的曲精管，發(fā)現(xiàn)移植后的PGC能發(fā)育成具有受精能力的精子細(xì)胞，并能產(chǎn)生后代，Nationtff等于1994 年用此方法制作了轉(zhuǎn)基因雞。而大家畜PGCS可否像小鼠ES細(xì)胞那樣抑制分化并增加，到目前還不能得出確切結(jié)論。如果能，這將為動(dòng)物轉(zhuǎn)基因帶來(lái)一場(chǎng)革命 [9,19]。
2.9脂質(zhì)體介導(dǎo)法

將構(gòu)件的還有外源基因的載體通過(guò)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將外源基因轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的體細(xì)胞，然后，篩選的細(xì)胞與轉(zhuǎn)核的卵母細(xì)胞融合，經(jīng)電激活在體外培養(yǎng)至囊胚移入受體,最終獲得轉(zhuǎn)基因個(gè)體。脂質(zhì)體易于制備并具有高效運(yùn)載DNA片段的能力,其最大特點(diǎn)是可與受體細(xì)胞類型發(fā)生結(jié)合,受體細(xì)胞會(huì)將含外源基因的脂質(zhì)體吞噬進(jìn)來(lái),從而實(shí)現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)移.岳軍明等采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)技術(shù)將人EPO基因轉(zhuǎn)移到小鼠體內(nèi),為貧血病人的基因治療提供了科學(xué)依據(jù) [11,18]
。
2.10 電擊法
電擊法又叫電穿孔法，電脈沖刺激法或電場(chǎng)轉(zhuǎn)移法。其原理是外界的高電壓脈沖可以改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使膜產(chǎn)生可變性的電穿孔，從而使得一定大小的DNA分子通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞核，并進(jìn)一步整個(gè)到宿主DNA上。1992年，Lonue等利用該方法在魚類的轉(zhuǎn)基因研究中獲得成功。許麗艷等利用該方法制作了轉(zhuǎn)人A Y W基因家蠅 [8,11,18]
。
2.11胞質(zhì)內(nèi)顯微注射法
鑒于精子載體法存在較大爭(zhēng)論，1999 年Authony CF perry等預(yù)先將小鼠精子進(jìn)行破膜處理，與編碼綠色熒光蛋白GTP或S—半乳糖苷酶報(bào)道分子的外深DNA短時(shí)間共孵育，然后微注射入減數(shù)分裂Ⅱ期的卵母細(xì)胞中，最后可獲得轉(zhuǎn)基因的表達(dá)胚胎，然后通過(guò)胚胎移植能得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 [15,21,22]
。
2.12
扎刺法
這種方法是先將胚胎放在含有目的基因的培養(yǎng)液里，然后用針扎到細(xì)胞或細(xì)胞里。針快速拔出，此時(shí)外源基因就進(jìn)入細(xì)胞核。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的流動(dòng)性隨之而關(guān)閉，胚胎內(nèi)進(jìn)入的溶液很少。這種方法比顯微注射快，對(duì)胚胎損害小，但轉(zhuǎn)基因頻率低 [8]
。

除上述幾種常用的轉(zhuǎn)基因方法外，人們?yōu)榱诉m應(yīng)于一些特殊需要也探索了一些其他的方法。如畸胎瘤細(xì)胞介導(dǎo)法，激光導(dǎo)入法，受體介導(dǎo)法，染色體片段顯微注射法，高效微彈法等，但均因不太成熟不能廣泛使用。綜上所述，雖然目前使用的制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法也不少，但總體看來(lái)，仍不是十分理想，效率較低 [22]
。

3提高轉(zhuǎn)基因效率的方法[10,22]

轉(zhuǎn)基因的效率主要體現(xiàn)在導(dǎo)入基因的整合與表達(dá)上。轉(zhuǎn)基因在宿主體內(nèi)的整合與表達(dá) 一直是轉(zhuǎn)基因基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是基因構(gòu)件的設(shè)計(jì)和轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性胚的篩選方法，二是對(duì)“位置效應(yīng)”有緩解作用的特殊DNA 序列的研究和基因共轉(zhuǎn)移的探索。
3.1 基因構(gòu)件的設(shè)計(jì)
3.1.1 啟動(dòng)子和內(nèi)含子

啟動(dòng)子決定了外源基因在體內(nèi)能否表達(dá)及表達(dá)效率的高低。把外源基因及其相配套的啟動(dòng)子重組后，導(dǎo)入受體動(dòng)物細(xì)胞，使其在染色體特異位點(diǎn)上進(jìn)行定向重組，整合與表達(dá)，是建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其應(yīng)用研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。選擇能指導(dǎo)外源基因高水平表達(dá)的啟動(dòng)子，對(duì)于研究外源基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的表達(dá)十分重要外源基因的有效表達(dá)還取決于轉(zhuǎn)入基因是否有內(nèi)含子，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中用 DNA比CDNA 有更適宜的表達(dá)。Chol 和Palmiter 分別用實(shí)驗(yàn)證明了這一點(diǎn)。
3.1.2 增強(qiáng)子，反式作用因子和載體

由于增強(qiáng)子的作用無(wú)方向性和位置性，外源DNA 整合后可能受插入位點(diǎn)臨近部位宿主增強(qiáng)子序列的作用，因而，構(gòu)建基因時(shí)帶有增強(qiáng)子序列，將會(huì)有效地提高目的基因的表達(dá)水平。另外，研究發(fā)現(xiàn)，某些增強(qiáng)子具有組織特異性，對(duì)實(shí)現(xiàn)目的基因的組織特異性表達(dá)有重要作用。反式作用因子在外源基因的特異表達(dá)中不僅能激活不同種外源基因轉(zhuǎn)錄，而且能結(jié)合到染色體的不同位點(diǎn)，同時(shí)，將一個(gè)基因的調(diào)節(jié)序列與另一個(gè)基因的結(jié)構(gòu)序列重新組合，可以產(chǎn)生新的組織特異性表達(dá)。自從Cohen 等1973 年引入質(zhì)粒PSC101 作克隆載體以來(lái)，克隆載體的整體結(jié)構(gòu)與效率已有極大的發(fā)展改進(jìn)，酵母人工染色體載體是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型載體。利用該載體能保證巨大基因的完整性，可清除或減弱位置效應(yīng)，從而提高外源基因的表達(dá)水平。
3.1.3 轉(zhuǎn)基因定位整合設(shè)計(jì)

轉(zhuǎn)基因的定位整合，可通過(guò)打靶技術(shù)實(shí)現(xiàn)，該技術(shù)可以清除操作過(guò)程的盲目性和偶然性，進(jìn)行有目的基因定位，從而提高轉(zhuǎn)基因效率。
3.2 體內(nèi)標(biāo)志系統(tǒng)的應(yīng)用

解決轉(zhuǎn)基因動(dòng)物效率低的一個(gè)方法是發(fā)展一種著床前篩選轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性胚胎的方法，目前應(yīng)用的有PCR 法和體內(nèi)標(biāo)志系統(tǒng)即使用報(bào)道基因的方法，一般常用的報(bào)道基因有細(xì)菌氯酶素乙酰基轉(zhuǎn)移酶（CAT），S—半乳糖苷酶，將其作為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的標(biāo)志，這些標(biāo)志系統(tǒng)的成功應(yīng)用大大提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)效率。另外，修正外源基因mRNA
的錯(cuò)誤剪接，增加外源基因拷貝數(shù)，增加核糖體進(jìn)入位點(diǎn)等方法也可以提高轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平。
3.3
特殊DNA 序列的研究

對(duì)位置效應(yīng)有緩解作用的特殊的DNA 序列包括MAR、LCR 及隔離子，這些DNA 序列要通過(guò)特殊的分子機(jī)制來(lái)激活外源DNA 的表達(dá)。MAR 序列是指細(xì)胞核中與核工業(yè)骨架基質(zhì)結(jié)合的DNA
區(qū)段。其特點(diǎn)是富含DNA 拓?fù)涿涪蚩汕懈畹男蛄袑?duì)MAR 序列可以提高基因表達(dá)效率的原因尚不是很清楚.鑒于MAR幾個(gè)物種共同的特征是位于其機(jī)能轉(zhuǎn)錄單位的邊界,因此推測(cè)MAR 序列有可能通過(guò)核內(nèi)因子(拓?fù)涿涪虻?使附近基因形成獨(dú)立的調(diào)控元,從而屏蔽位置效應(yīng)對(duì)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的影響。LCR 是另一類對(duì)基因表達(dá)有促進(jìn)作用的特殊DNA,其結(jié)構(gòu)和機(jī)能在進(jìn)化上是相當(dāng)保守的。通過(guò)幾個(gè)物種B-珠蛋的附近LCR
序列研究表明:⑴ LCR 序列使與其相連的外源基因在轉(zhuǎn)基因鼠系中表現(xiàn)出非位點(diǎn)依賴性高效表達(dá);⑵LCR 影響下游附近 200Kb 區(qū)域染色體結(jié)構(gòu)及DNA 復(fù)制模式;⑶LCR 與珠蛋的基因相互作用具有組織及發(fā)育特征性;⑷珠蛋的基因LCR 具有組織特異性DNaseI 超敏位點(diǎn).綜合實(shí)驗(yàn)推測(cè),LCR 可以摒除位置效應(yīng)的主要原因可能是通過(guò)其鄰近染色體開(kāi)放組織來(lái)起作用。隔離子序列在染色體中的作用可能是干擾其上游順式元件和其下游DNA
序列之間的相互作用,這只是一種假設(shè),深層原因還需進(jìn)一步研究。
3.4 利用基因共轉(zhuǎn)移提高表達(dá)效率

利用基因共轉(zhuǎn)移提高外源基因表達(dá)效率的途徑又稱基因拯救。具體是將高效表達(dá)的基因結(jié)構(gòu)與低效表達(dá)基因結(jié)構(gòu)共轉(zhuǎn)移,其表達(dá)效率往往得到改善。共轉(zhuǎn)移之所以能提高外源基因的表達(dá)效益,有可能是因?yàn)槟承┗蛑写嬖谠鰪?qiáng)子或隔離子序列或是某些基因的轉(zhuǎn)錄激活同時(shí)帶動(dòng)其它基因的轉(zhuǎn)錄激活。共轉(zhuǎn)移緩解外源基因的染色質(zhì)化,則可能涉及內(nèi)元的存在.
內(nèi)元的存在可能使異染色質(zhì)化受到某種程度的抑制。

4 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物檢測(cè)的方法[5]

以轉(zhuǎn)基因鼠為例，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因動(dòng)物檢測(cè)的方法。雌鼠受精后12h分離受精卵，在體外將加工的外源基因注射到受精卵原核內(nèi)，將10-30個(gè)注射過(guò)的卵移植到假孕母鼠的輸卵管種，待幼鼠出生后采樣提取DNA。將制備好的DNA樣品點(diǎn)到尼龍膜或硝酸纖維素膜上，再用所注射的基因做成探針，做斑點(diǎn)雜交，檢測(cè)出帶有外源基因的小鼠。然后采集血樣或外源基因表達(dá)的器官組織用以制備RNA 。用外源基因作為探針與制備的RNA進(jìn)行Northern分子雜交，檢查外源基因是否轉(zhuǎn)錄成mRNA.接著對(duì)帶有外源基因的小鼠進(jìn)行放射免疫測(cè)定，以檢測(cè)由外源基因合成的蛋白質(zhì)。可用原位雜交法測(cè)出外源基因在染色體上的整合部位，還可將帶外源基因的小鼠進(jìn)行繁殖，檢查基因是否進(jìn)入生殖系統(tǒng)，以及在后代中的傳遞情況；另外，還可通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)建立轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞株，研究基因在染色體上的位置和基因的調(diào)節(jié)，找出基因的表達(dá)與基因在染色體上的整合部位的關(guān)系。對(duì)其他動(dòng)物除了收集受精卵的方式，注射外源基因和胚胎移植不同之外，其余的檢測(cè)方法都是相同的。

5轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)在動(dòng)物育種中的應(yīng)用[23]
5.1 通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良重要經(jīng)濟(jì)性狀利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以培育出生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高、回報(bào)率好的優(yōu)良品種[24]
。
例如，Harnmer 等（1985）首先利用轉(zhuǎn)基因操作技術(shù)獲得了轉(zhuǎn)基因豬。
5.2 通過(guò)轉(zhuǎn)基因可實(shí)現(xiàn)抗病育種

例如，外源Mx-基因在豬體內(nèi)的表達(dá)，可增強(qiáng)豬抗流感病毒的能力。導(dǎo)入乳鐵蛋白基因的轉(zhuǎn)基因奶牛，具有很強(qiáng)的乳房炎抗病力。
5.3 通過(guò)轉(zhuǎn)基因還可改進(jìn)動(dòng)物產(chǎn)品的質(zhì)量

例如，β-乳球蛋白在奶牛和奶山羊中的表達(dá)，可改變?nèi)榈鞍椎臉?gòu)成，從而提高奶的質(zhì)量和價(jià)值。再如，一種調(diào)控蛋白結(jié)構(gòu)基因的導(dǎo)入，可以改變羊或蠶支持蛋白的合成，進(jìn)而改變羊毛或絲的成分，提高其質(zhì)量。
5.4 通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可使奶牛或奶山羊獲得在乳腺中生產(chǎn)對(duì)合成藥物有重要意義的肽和蛋白質(zhì)的新功能，即乳腺生物反應(yīng)器。
其核心內(nèi)容是通過(guò)各種轉(zhuǎn)基因技術(shù),將乳腺組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的外源基因,在動(dòng)物乳腺組織高效表達(dá),在乳汁中生產(chǎn)目的產(chǎn)品[25]。目前研制生物反應(yīng)器的主要目的基因有：人類凝血因子、α抗胰蛋白酶、胰島素、人體白蛋白、干擾素等等。
5.5 通過(guò)轉(zhuǎn)基因可建立毒理試驗(yàn)的動(dòng)物模型

如生產(chǎn)對(duì)致癌物質(zhì)、誘變劑和毒物敏感的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，從而有助于對(duì)環(huán)境中的危險(xiǎn)因素的認(rèn)識(shí)。
5.6 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在人類醫(yī)學(xué)研究中也有廣闊的應(yīng)用

例如，通過(guò)研究制備用于人類臟器移植轉(zhuǎn)基因豬。通過(guò)轉(zhuǎn)基因還可為胃腸癌的研究和治療提供動(dòng)物模型系統(tǒng)。
5.7 通過(guò)轉(zhuǎn)基因可使動(dòng)物產(chǎn)生新的代謝途徑，從而提高其生產(chǎn)性能

例如，具有外源半胱氨酸生物合成基因的轉(zhuǎn)基因羊，其生長(zhǎng)速度得到大幅度提高。
6 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)應(yīng)用于動(dòng)物育種中存在的問(wèn)題及對(duì)今后育種工作的建議
6.1 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)應(yīng)用于動(dòng)物育種中存在的問(wèn)題
動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)目前存在的問(wèn)題主要有以下幾個(gè)方面：
6.1.1 目前制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的效率還很低

綜合各國(guó)實(shí)驗(yàn)研究的報(bào)道可以看出，目前動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的效率仍然很低，這是制約轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題之一。經(jīng)典的轉(zhuǎn)基因技術(shù)（通常指顯微注射法）應(yīng)用在牛上，形成的合子存活率僅15%，其中僅約18%能發(fā)育為活犢牛[26]。
6.1.2 難以控制轉(zhuǎn)基因在宿主基因組中的行為

現(xiàn)有的動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)仍無(wú)法實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的定點(diǎn)整合，轉(zhuǎn)基因在宿主基因組中的插入是隨機(jī)的。轉(zhuǎn)基因在宿主基因組中的隨機(jī)插入可能導(dǎo)致內(nèi)源基因的破壞或失活，也可能激活某
些正常狀態(tài)下關(guān)閉的基因，結(jié)果導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性個(gè)體出現(xiàn)不育、胚胎死亡和畸形等不良現(xiàn)象[27]。
6.1.3 難以形成轉(zhuǎn)基因畜禽品種或品系

轉(zhuǎn)基因的隨機(jī)整合使得每個(gè)個(gè)體的外源基因在其基因組上的位置均不一樣，因此無(wú)法使轉(zhuǎn)基因固定，加上轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定遺傳問(wèn)題也未能解決，因而也就無(wú)法形成轉(zhuǎn)基因畜禽品種或品系。迄今為止，雖然有一些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物個(gè)體的后代也表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性，但未見(jiàn)有培育成功轉(zhuǎn)基因畜禽品種或品系的報(bào)道。
6.1.4 無(wú)法控制轉(zhuǎn)基因的表達(dá)頻率和水平[27]
多數(shù)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)強(qiáng)烈地受著其在宿主染色體上整合位點(diǎn)的影響，即存在著所謂的位置效應(yīng)(position
effect)，相鄰基因或異染色質(zhì)區(qū)域影響著外源基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致同樣的基因在不同的轉(zhuǎn)基因個(gè)體表達(dá)的水平很不一致，大部分轉(zhuǎn)基因(尤其是cDNA) 的表達(dá)水平低得難以檢測(cè)，而個(gè)別個(gè)體轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平卻又太高，使宿主動(dòng)物難以承受。
6.1.5轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型可能與預(yù)期不符

在鐮刀狀貧血?jiǎng)游锬Ｐ脱芯恐校藗冊(cè)噲D將突變的血紅蛋的基因轉(zhuǎn)入小鼠以獲得鐮刀狀貧血?jiǎng)游铮Y(jié)果使研究者大失所望，所有的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物都只表現(xiàn)出鐮刀狀紅細(xì)胞的病變而未發(fā)現(xiàn)貧血 [10] 。
6.1.6
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的安全問(wèn)題

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物給人帶來(lái)好處的同時(shí) ，也存在著許多安全性問(wèn)題。其主要包括：（1）具有某些優(yōu)勢(shì)性狀的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可能會(huì)對(duì)生態(tài)平衡及物種多樣性產(chǎn)生不良影響；（2）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物器官移植可能會(huì)增加“人獸共患”病的機(jī)會(huì)；（3）用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的食品有可能使食用者發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)；（4 ）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究還將會(huì)引發(fā)一系列社會(huì)倫理問(wèn)題。為了確保轉(zhuǎn)基因動(dòng)物對(duì)人體的安全性，在大規(guī)模生產(chǎn)之前必須對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行嚴(yán)格和生物安全檢測(cè) [19] 。
6.1.7人們不了解哪些基因控制著多數(shù)生理過(guò)程，不了解基因表達(dá)的發(fā)育控制和組織特異性控制的機(jī)制。
6.1.8 沒(méi)有制定出申請(qǐng)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的合理方案，有關(guān)轉(zhuǎn)基因的倫理學(xué)問(wèn)題還困擾著許多人。
6.2 對(duì)今后轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種工作的建議[1]
6.2.1 進(jìn)一步加強(qiáng)基礎(chǔ)性問(wèn)題的研究

如在提高基因轉(zhuǎn)移效率和定點(diǎn)整合的方法學(xué)方面應(yīng)予以優(yōu)先研究;對(duì)一些已用于轉(zhuǎn)移的基因，對(duì)其發(fā)育和組織特異性表達(dá)的基因開(kāi)關(guān)和表達(dá)物水平控制的機(jī)制，應(yīng)給予充分重視。
6.2.2 加強(qiáng)學(xué)科間、部門間的合作

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物涉及生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、畜牧學(xué)、獸醫(yī)學(xué)的理論和技術(shù)問(wèn)題，需要多門類、多學(xué)科的研究人員通力合作。另外，此研究也是一個(gè)具有高風(fēng)險(xiǎn)、高投人的研究領(lǐng)域，需要政府企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)共同參與完成。
6.2.3 加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的安全性評(píng)估

隨著功能性基因組研究的開(kāi)發(fā)以及新基因的不斷發(fā)現(xiàn)和利用，需要積累相應(yīng)的大量科學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)為新基因?qū)Νh(huán)境和人體健康的影響做出正確評(píng)價(jià)。因此，有必要建立轉(zhuǎn)基因安全性評(píng)估中心和相關(guān)技術(shù)體系，為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物安全性提供科學(xué)依據(jù)盡管轉(zhuǎn)基因技術(shù)目前還不完善，還在發(fā)展之中，但與傳統(tǒng)的育種方法相比，它仍具有許多優(yōu)點(diǎn)。相信隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，它將逐步走向成熟，給動(dòng)物育種和生產(chǎn)帶來(lái)重大變革。

本人搜集總結(jié)愿于大家共享

作者: tianlei22 時(shí)間: 2009-5-20 11:20
好資料，頂一下！:)3:

作者: fqm1984 時(shí)間: 2009-5-20 14:58
轉(zhuǎn)基因大豆油和菜籽油已經(jīng)不好賣了

作者: xuhua 時(shí)間: 2009-5-20 16:10
歡迎以后多多發(fā)表這樣的帖子！

作者: 791010 時(shí)間: 2010-5-5 19:29
感謝樓主

作者: 小5的春天 時(shí)間: 2010-5-7 10:02
還是頂一下

所謂的科學(xué)是迷信！

作者: 茅草無(wú)敵 時(shí)間: 2010-5-15 19:19
可是我覺(jué)得這個(gè)很有潛力啊。可以大大縮短育種年限

歡迎光臨畜牧人 (http://www.cqnsfzw.com/)