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畜牧人

標題: 豬病實驗室常規(guī)診斷技術(shù)（連載）之七、豬瘟檢測方法 [打印本頁]

作者: nnii521 時間: 2009-6-23 22:02
標題: 豬病實驗室常規(guī)診斷技術(shù)（連載）之七、豬瘟檢測方法

七、豬瘟檢測方法

豬瘟間接血凝試驗操作方法

（一）試驗材料

1．96孔110~120°V型醫(yī)用血凝板

2．10~100微升可調(diào)微量移液器

3．塑料咀

4．豬瘟間接血凝抗原（豬瘟正向血凝診斷液），每瓶5毫升，可檢測血清25~30頭份

5．陽性對照血清，每瓶2毫升；陰性對照血清，每瓶2毫升

6．稀釋液每瓶10毫升

7．待檢血清每份0.2~0.5毫升（56℃水浴滅活30分鐘）

（二）操作步驟

1．檢測前，應(yīng)將凍干診斷液，每瓶加稀釋液5毫升浸泡7~10天后方可應(yīng)用。

2．稀釋待檢血清：在血凝板上的第1孔~第6孔各加稀釋液50微升。吸取待檢血清50微升加入第1孔，混勻后從中取出50微升加入第2孔，依此類推直至第6孔混勻后丟棄50微升，從第1孔——第6孔的血清稀釋度依次為1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64。

3．稀釋陰性和陽性對照血清：在血凝板上的第11排第1孔加稀釋液60微升，取陰性血清20微升混勻取出30微升丟棄。此孔即為陰性血清對照孔。

在血凝板上的第12排第1孔加稀釋液70微升，第2——7孔各加稀釋液50微升，取陽性血清10微升加入第1孔混勻，并從中取出50微升加入第2孔混勻后取出50微升加入第3孔……直到第7孔混勻后棄50微升，該孔的陽性血清稀釋度為1：512。

4．在血凝板上的第1排第8孔加稀釋液50微升，作為稀釋液對照孔。

5．判定方法和標準：先觀察陰性血清對照孔和稀釋液對照孔，紅血球應(yīng)全部沉入孔底，無凝集現(xiàn)象（—）或呈（+）的輕度凝集為合格；陽性血清對照應(yīng)呈（+++）凝集為合格。

在以上3孔對照合格的前提下，觀察待檢血清各孔的凝集程度，以呈“++”凝集的待檢血清最大稀釋度為其血凝效價（血凝價）。血清的血凝價達到1：16為免疫合格。

“-”表示紅細胞100%沉于孔底，完全不凝集

“+”表示約有25%的紅細胞發(fā)生凝集

“++”表示50%紅細胞出現(xiàn)凝集

“+++”表示75%紅細胞凝集

“++++“表示90—100%紅細胞凝集

6．注意事項

（1）
勿用90°或130°血凝板，以免誤判。

（2）
污染嚴重或溶血嚴重的血清樣品不宜檢測。

（3）
凍干血凝抗原，必須加稀釋液浸泡7~10天，方可使用，否則易發(fā)生自凝現(xiàn)象。

（4）
用過的血凝板，應(yīng)及時沖冼干凈，勿用毛刷或其他硬物刷洗板孔，以免影響孔內(nèi)光潔度。

（5）
使用血凝抗原時，必須充分搖勻，瓶底應(yīng)無血球沉積。

（6）
液體血凝抗原4~8℃貯存有效期四個月，可直接使用。凍干血凝抗原4~8℃貯存有效期三年。

（7）
如來不及判定結(jié)果或靜置2小時結(jié)果不清晰，也可放置第2天判定。

（8）
每次檢測，只設(shè)陰性、陽性血清和稀釋液對照各1孔。

（9）
稀釋不同的試劑要素時，必須更換塑料咀。

（10）血凝板和塑料咀洗凈后，自然干燥，可重復(fù)使用。

(李樹春)

豬瘟病毒強弱毒鑒別診斷ELISA操作方法

（一）試驗材料

1．豬瘟弱毒單抗純化酶聯(lián)抗原和豬瘟強毒單抗純化酶聯(lián)抗原，分別供檢測經(jīng)豬瘟弱毒疫苗免疫后產(chǎn)生的抗體和感染豬瘟強毒后產(chǎn)生的抗體之用。

2．酶標抗體

3．豬瘟陽性、陰性血清

4．酶聯(lián)板及其他必要的試劑。

（二）操作步驟

1．用包被液將豬瘟弱毒單抗純化酶聯(lián)抗原、豬瘟強毒單抗純化酶聯(lián)抗原各作100倍稀釋，以100微升分別加入做好標記的酶聯(lián)板孔中，置濕盒于4℃過夜。

2．棄去孔內(nèi)液體。用洗滌液沖洗酶聯(lián)板3次，每次間隔3~5分鐘，拍干。
3．用稀釋液將待檢血清作400倍稀釋，每孔加100微升。同時，將豬瘟陽性、陰性血清以100稀釋作對照，37℃培育1.5~2小時。
4．重復(fù)第2步。
5．用稀釋液將兔抗豬IgG—辣根過氧化物酶結(jié)合物作100倍稀釋，每孔加入100微升，37℃培育1.5~2小時。
6．重復(fù)第2步。

7．每孔加入底物溶液（每塊板所需的底物溶液按鄰苯二胺5毫克+底物緩沖液5毫升+30%過氧化氫18.75微升配制）100微升，室溫下觀察顯色反應(yīng)（一般陰性對照孔略微顯色，立即終止反應(yīng)，并以陰性孔作空白調(diào)零）。
8．每孔加入終止液50微升，于酶聯(lián)讀數(shù)儀上測定490nm波長的光密度（OD）。
（三）判定標準
在豬瘟弱毒酶聯(lián)板上：OD>0.2為豬瘟弱毒抗體陽性

OD<0.2為豬瘟弱毒抗體陰性
在豬瘟強毒酶聯(lián)板上：OD≥0.5為豬瘟強毒抗體陽性

OD<0.5為豬瘟強毒抗體陰性
（四）注意事項

1．運輸單抗純化酶聯(lián)抗原時，必須使用冰盒低溫運輸；豬瘟強弱毒單抗純化酶聯(lián)抗原在4℃保存6個月，在—18℃保存12個月。

2．配制洗滌液時，應(yīng)使用新鮮蒸餾水或無離子水，每次洗板后，盡量不使孔中有殘余液體，以免影響結(jié)果。

3．底物溶液應(yīng)臨用前配制，待鄰苯二胺完全溶解于底物緩沖液后再加過氧化氫，混勻后立即加入孔中。
1．
終止反應(yīng)后，應(yīng)立即讀數(shù)。

(中國獸藥監(jiān)察所)

豬瘟反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

1．材料準備：待檢組織，勻漿器、氯仿、異丙醇、75%乙醇、生理鹽水，RNA提取試劑盒（Omega），RT-PCR試劑盒（TakaRa）等。
引物：擴增豬瘟病毒E2基因中585bp基因片段，由上海生物工程公司合成。
序列為：上游引物P1：5’—CCTGCAAGGAAGATCACACG—3’
下游引物P2：5’—CCGTGTAGGTCACTGGTTCA—3’
儀器設(shè)備為：PCR擴增儀，電泳儀，凝膠電泳紫外檢測儀。
2．操作步驟
2．1 樣品采集：動物病死或撲殺后，取扁桃體、淋巴結(jié)和脾組織，-20℃冷藏。
2．2 樣品處理：所采病料經(jīng)組織研磨器充分研磨，按1:5生理鹽水收集于離心管內(nèi)，-70℃反復(fù)凍融三次，7000r/min，離心5分鐘，取上清液。
2．3 RNA提取：依照Omega公司RNA提取試劑盒的操作程序提取總RNA。
2．4 RT-PCR操作程序：依照TakaRa公司的一步法RNA PCR試劑盒操作程序進行。
擴增條件為：50℃，反轉(zhuǎn)錄30分鐘，94℃變性5分鐘，進入循環(huán)，94℃ 50秒，72℃ 60秒，40個循環(huán)后72℃延伸10分鐘。
3．RT-PCR產(chǎn)物檢測：擴增產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外光下與標準分子量比較，如見585bp片段，初步診斷為陽性。

作者: luoyouyi 時間: 2009-6-23 22:28
檢測這搞體也不知道有沒有用，我檢測了好多次，但抗體高低不平，但也沒出問題。

作者: 姜寧 時間: 2009-6-23 22:38
謝謝，學(xué)習(xí)了。借此呼吁各位養(yǎng)豬人，為了你的輕松養(yǎng)豬，每年做兩次抗體檢測吧！

作者: xidaoli 時間: 2009-6-24 12:43
我們這邊的設(shè)備太不全。。也沒法測出來，看來得多弄點東西了。

作者: 362779682qqcom 時間: 2013-4-21 22:09
不錯哦，學(xué)習(xí)了

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