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畜牧人

標(biāo)題: 有機(jī)礦物質(zhì)添加物的“快速測(cè)定” [打印本頁(yè)]

作者: yisiyi 時(shí)間: 2009-10-14 13:39
標(biāo)題: 有機(jī)礦物質(zhì)添加物的“快速測(cè)定”

有機(jī)礦物質(zhì)添加物的“快速測(cè)定”
——比色法銅和鋅有機(jī)礦物質(zhì)的金屬絡(luò)合度測(cè)定
　　Robert Holwerda著張淑枝譯王永康校

　　微量礦物質(zhì)含量及其生物有效性問(wèn)題，對(duì)飼料配方者依然是一個(gè)棘手的挑戰(zhàn)。一方面，這些微量元素是必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，即使是很少的數(shù)量對(duì)動(dòng)物的健康和生長(zhǎng)也是至關(guān)重要的。另一方面，若補(bǔ)充過(guò)多，則伴隨著中毒風(fēng)險(xiǎn)的增加。為了在日漸增多的微量礦物元素產(chǎn)品中迅速做出事先了解的選擇，配方者通常需要了解礦物元素在水溶液中主要是呈游離態(tài)的或是絡(luò)合態(tài)的。

　　許多實(shí)驗(yàn)室方法已經(jīng)用于定量地回答這一問(wèn)題。但是，這些方法昂貴且費(fèi)時(shí)。有一種新的比色測(cè)定法可以定性地回答有機(jī)物的“絡(luò)合”效率問(wèn)題。這種“快速測(cè)定”依靠化學(xué)反應(yīng)所誘導(dǎo)的顏色變化，類(lèi)似于實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)測(cè)試，但不是定量的。相比之下，比色測(cè)定更為低廉、快速并易在飼料廠或現(xiàn)場(chǎng)操作。

游離、絡(luò)合以及鰲合態(tài)有機(jī)微礦
　　動(dòng)物飼料中有機(jī)礦物元素產(chǎn)品通常包含游離和絡(luò)合金屬離子的混合物。離子化合物如硫酸鋅，溶解釋放游離和水合的金屬離子，僅有水分子與金屬離子相結(jié)合。相比而言，有機(jī)配體（organic-parters）通過(guò)單點(diǎn)的附著與金屬元素相連接形成“絡(luò)合”，或通過(guò)多點(diǎn)連接而形成“鰲合”。有機(jī)絡(luò)合或鰲合形式添加的微量元素有提高金屬元素生物可利用性、改善動(dòng)物性能的潛力（Spears等, 1992）。

　　雖然絡(luò)合或鰲合都不能絕對(duì)保證它們的生物有效性，但了解商品性礦物元素產(chǎn)品中游離、絡(luò)合和鰲合金屬的的相對(duì)數(shù)量，將有利于做出合理的選擇。然而，通常有機(jī)微量元素供應(yīng)商不提供測(cè)定游離、絡(luò)合金屬離子的定量方法，僅提供總金屬元素的常規(guī)報(bào)告。

　　研究者已經(jīng)提出了許多鑒別游離和絡(luò)合金屬元素的定量分析方法（見(jiàn)參考文獻(xiàn)）。但是，為了滿(mǎn)足日糧配方的即刻需求，配方者可能只是想要了解某些礦物產(chǎn)品的金屬元素是否主要是游離的或是絡(luò)合的。

氯醌酸鹽比色指示劑
　　有機(jī)礦物元素絡(luò)合效率的快速測(cè)定，采用氯醌酸（2, 5- 二羥基-3, 6-二氯-1, 4-苯醌），該酸易被中和（pKa1=0.7, pKa2=2.6；Martell等，2001），形成紫色的二價(jià)氯醌酸鹽（CA2－）。指示劑三乙銨氯醌酸鹽（TEAC）的合成和快速測(cè)定都頗為簡(jiǎn)單和直觀，幾乎在所有飼料實(shí)驗(yàn)室和飼料廠質(zhì)檢人員的能力范圍之內(nèi)。

　　當(dāng)與金屬離子相結(jié)合的時(shí)候，氯醌酸鹽可以作為絡(luò)合劑和鰲合劑，或簡(jiǎn)單作為一種抗陰離子劑（counteranion）（Johnston和Holwerda，1985）。此外，金屬氯醌酸鹽的顏色對(duì)金屬－CA的結(jié)合模式是高度敏感的（Jeong和Holwerda，1989；Bessire等，1995）。又由于氯醌酸鹽不是一種很強(qiáng)的絡(luò)合劑（Martell等，2001），在良好絡(luò)合的有機(jī)礦物質(zhì)中，其結(jié)合配體不會(huì)被CA2－所替代，因而使特征性氯醌酸鹽的紅紫色基本上不發(fā)生變化。

　　這種比色快速測(cè)定設(shè)計(jì)目的是用于在稀釋水溶液中主要是絡(luò)合金屬元素的銅、鋅營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的鑒別。雖然絡(luò)合在護(hù)送金屬離子至吸收的生理學(xué)位點(diǎn)的過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用，但要注意的是，在有機(jī)礦物質(zhì)溶液中不可避免地存在一些游離金屬離子，這是合理的（Holwerda，2001）。

快速測(cè)定的解釋
　　在對(duì)快速測(cè)定進(jìn)行解釋的時(shí)候，每一樣品的顏色需與預(yù)先準(zhǔn)備好的空白對(duì)照小瓶顏色進(jìn)行比較，空白對(duì)照為：在10 mL蒸餾水中加入3滴TEAC指示劑。將樣品置于白色光前面進(jìn)行觀察，其顏色最易辨別。在記錄上清夜的測(cè)定顏色之前，需要使深色的不溶物先行沉淀。以下所講述的是典型的快速測(cè)定觀察，并附有化學(xué)解釋。

　　迅速形成橄欖綠（銅）或棕綠色（鋅）沉淀，上清夜中無(wú)任何的紫色：溶解樣品中的銅或鋅大部分是非絡(luò)合的（游離的）或者是非常輕度的絡(luò)合。形成的固體物是Cu (CA) -2H2O或Zn (CA) -2H2O (Bottei和Green, 1968)。

　　無(wú)沉淀物形成，但是顏色由紅紫色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)紫色：溶解樣品中的銅或鋅已很好絡(luò)合，在平衡液中尚有少量濃度的未絡(luò)合金屬離子；氯醌酸鹽能與金屬離子相互作用，但是其它的結(jié)合配體阻止了Cu (CA) -2H2O或Zn (CA) -2H2O的形成和沉淀。

　　形成沉淀，上清夜中有少量紫色：在樣品中存在相當(dāng)濃度的絡(luò)合和游離金屬離子。
　　無(wú)沉淀物形成，而且指示劑顏色保持不變（紅紫色）：溶解樣品中的銅或鋅已強(qiáng)有力和充分地絡(luò)合或鰲合的，平衡液中僅含有非常少量濃度的未絡(luò)合金屬離子；氯冉酸鹽完全沒(méi)有與金屬離子相互作用。

　　指示劑從紫色變?yōu)槌壬簶悠肥菑?qiáng)酸性的，僅含有非絡(luò)合的金屬離子；未溶解的氯醌酸使之轉(zhuǎn)變?yōu)槌壬?br /> 　　一些其他類(lèi)型的顏色變化或沉淀物產(chǎn)生：有可能出現(xiàn)其他的顏色變化，但有機(jī)礦物質(zhì)樣品似無(wú)這種可能。
　　蛋白質(zhì)與指示劑也可能相互作用而形成不溶性鹽（但仍為紫色）。在這種情況下，如果溶解的金屬是良好絡(luò)合的，那么紫色度會(huì)降低。在任何情況下，不要試圖對(duì)以上未涉及的顏色變化進(jìn)行解釋。另外，還要高度注意：在某些情況下，這樣一簡(jiǎn)單的測(cè)定可能出現(xiàn)非結(jié)論性的結(jié)果。

　　通過(guò)與現(xiàn)有成熟方法測(cè)定的絡(luò)合及游離金屬離子結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，可以證實(shí)指示劑快速測(cè)定方法的有效性。第二層次的驗(yàn)證是以快速測(cè)定的顏色與商業(yè)有售的銅鋅營(yíng)養(yǎng)物經(jīng)電化學(xué)確定的組成系數(shù)間的相關(guān)為特征（Holwerda等, 1995和Holweda, 1997）。穩(wěn)定性低的絡(luò)合物，例如蛋氨酸鋅和蛋氨酸銅，在滴加TEAC時(shí)產(chǎn)生不穩(wěn)定的沉淀物，與快速分解成相應(yīng)的游離金屬離子相一致。相反，用極普法檢測(cè)并顯示出75％以上絡(luò)合作用的有機(jī)礦物質(zhì)，在快速測(cè)定中并不形成沉淀物，而且上清液的顏色與TEAC的空白對(duì)照相似。

快速測(cè)定的必備條件和局限性
　　比色快速測(cè)定是在非緩沖的水溶液中進(jìn)行的，因此，樣品可以與其在純水中的溶解進(jìn)行準(zhǔn)確的比較。因而，不可能得到在生理?xiàng)l件下金屬絡(luò)合有效性的結(jié)論。由于樣品未予以稱(chēng)重，而且也未測(cè)定濃度，因而無(wú)法得到溶液中絡(luò)合或鰲合物百分率的定量結(jié)論。雖然快速測(cè)定提供了鑒別含有大部分游離金屬離子樣品的簡(jiǎn)易方法，但是僅按照比色法尚不能在簡(jiǎn)單的絡(luò)合和鰲合之間予以區(qū)別。在TEAC檢測(cè)中觀察到的細(xì)微指示劑顏色差異，與氯醌酸鹽結(jié)合金屬離子的能力有關(guān)，但與其他的結(jié)合配體是否形成鰲合環(huán)無(wú)關(guān)。

　　為了使快速測(cè)定更為有效，總的金屬溶解度應(yīng)該等于或大于TEAC濃度。加入過(guò)量的指示劑或者金屬溶解度很低，由于沒(méi)有足量的金屬離子與全部指示劑進(jìn)行反應(yīng)，將會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性的絡(luò)合測(cè)定（保留其紫色）。因此快速測(cè)定僅應(yīng)用于至少是中等溶解性的樣品。高度不溶性的鋅氧化物，是快速測(cè)定不能得出有意義結(jié)論的一個(gè)典型例子。

　　快速測(cè)定的局限性包括：1）背景色，可能會(huì)使測(cè)試結(jié)果模糊；2）二次反應(yīng)，可能會(huì)使比色測(cè)定解釋無(wú)效。一些有機(jī)礦物質(zhì)溶解后成為深黃色或深棕色溶液，這些顏色反映了有機(jī)物的含量。如果固形物不能在推薦的30秒測(cè)定并觀察顏色變化期間快速產(chǎn)生沉淀，那么在加入TEAC指示劑之前，離心清除這些不溶物將是必需的。當(dāng)TEAC紫色更濃于有機(jī)銅的藍(lán)色時(shí)，其背景銅的比色干擾是最小的。當(dāng)測(cè)試樣品瓶緊靠于白色光線觀察時(shí)，有可能檢測(cè)到大多數(shù)深黃色樣品上清液中殘存的紫色。

　　這種快速測(cè)定，對(duì)溶解釋放良好絡(luò)合金屬離子的有機(jī)銅和有機(jī)鋅產(chǎn)品的鑒別，是一種直觀、價(jià)格低廉的比色方法。該測(cè)定適用于有機(jī)礦物質(zhì)樣品的現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試，不需要專(zhuān)門(mén)的設(shè)備或訓(xùn)練。盡管定性測(cè)定用于鑒別游離和絡(luò)合銅或鋅源是高度有效的，但為了區(qū)別簡(jiǎn)單絡(luò)合和鰲合則仍然需要更精密的方法。

譯自：Feed International, October 2001。

供飼料實(shí)驗(yàn)室和質(zhì)檢人員應(yīng)用的試劑準(zhǔn)備和操作程步驟

　　微礦補(bǔ)充物中銅和鋅絡(luò)合度快速比色測(cè)定，所用的指示劑鹽是冉氯酸三乙基銨（TEAC），之所以選擇它的原因是由于其高水溶性、熱穩(wěn)定性和易于配制的特點(diǎn)。雖然TEAC尚未有商品銷(xiāo)售，但是可以利用現(xiàn)有的廉價(jià)有機(jī)物前體——三乙銨和氯醌酸進(jìn)行合成。

　　TEAC的制作：在200 mL甲醇中加入氯醌酸（52.25 g，0.250 mol）攪拌均勻，在煙霧罩內(nèi)與三乙胺(100 mL, 72. 6 g, 0.717 moL) 混合。在混合時(shí)間內(nèi)，橙色的氯醌酸就轉(zhuǎn)變成紫色的TEAC產(chǎn)品。在蒸發(fā)甲醇和過(guò)量的三乙胺之后，將固體產(chǎn)品碾成細(xì)粉末。TEAC是一種無(wú)味的物質(zhì)，在環(huán)境溫度下可以長(zhǎng)期貯存。分子式為[HN(C2H5)3]2(C6Cl2O4) = C18H32N2Cl2O4 (分子量＝ 411.37 g / moL)，產(chǎn)量102 g（99％）。

　　TEAC尚無(wú)現(xiàn)成的安全數(shù)據(jù)資料，因而建議參照氯醌酸（CAS no. 87-88-7）的安全指導(dǎo)。稀釋的TEAC比色試劑無(wú)害無(wú)毒，若撒在手上或胳膊上，立即用清水沖洗即可。桌面上的溢出物應(yīng)該使用吸水性好的一次性紙巾進(jìn)行清理。

　　進(jìn)行快速測(cè)定操作，操作人員只需要基本的實(shí)驗(yàn)室儀器，包括：抹刀、約37mL的旋蓋小瓶、一次性的聚乙烯吸量管和廢液瓶。所需的化學(xué)試劑包括：比色測(cè)試溶液（1.0 gTEAC溶于10 mL蒸餾水，室溫貯存于深色瓶中）、蒸餾水、金屬硫酸鹽以及有機(jī)礦物元素樣品。只要不暴露于高溫或遭受太陽(yáng)直射，TEAC指示劑溶液可以穩(wěn)定保存數(shù)個(gè)月。

快速測(cè)定程序包括以下幾個(gè)步驟：
1．取10 mL蒸餾水加入帶塞子的試管中（大約一次性吸量管容積的3倍）；必須使用優(yōu)質(zhì)蒸餾水，因?yàn)樽詠?lái)水中存在的礦物質(zhì)會(huì)對(duì)測(cè)試產(chǎn)生干擾；
2．使用抹刀取少量固體樣品（約30 – 50 mg）加入試管中，塞緊蓋子，振蕩30秒以上直至樣品全部溶解。樣品不需要準(zhǔn)確地稱(chēng)量，但是用量不足的話(huà)，將會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果無(wú)效；有些有機(jī)礦物質(zhì)不能全部溶解，但是殘留的固體一般不影響測(cè)試。在滴加TEAC之前，必須達(dá)到溶解平衡（solubility equilibrium）。樣品振蕩不均勻，比色反應(yīng)將有誤；
3．小心翼翼地向樣品溶液中精確滴加3滴指示劑（TEAC）。輕輕搖晃確保完全混合，注意觀察30秒后所形成的顏色。30秒內(nèi)形成的顏色一般至少保持一個(gè)小時(shí)不變，但是在幾分鐘之內(nèi)可能發(fā)生二次反應(yīng)，逐漸改變上清液顏色。游離態(tài)或絡(luò)合差的銅和鋅離子的指示劑反應(yīng)非常迅速，因此混合30秒后所形成的顏色為化學(xué)解釋提供了一個(gè)公正、穩(wěn)定的基礎(chǔ)；
4．測(cè)定完全結(jié)束之后，將試管中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到廢液瓶中。樣品與指示劑的混合廢液不可以直接倒入下水道，請(qǐng)參照氯醌酸廢棄處理的安全注意事項(xiàng)。使用蒸餾水洗凈試管和塞子。

作者: lcy0610 時(shí)間: 2009-10-15 11:44
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