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畜牧人

標題: 大腸桿菌的獸醫實驗室檢測方法步驟 [打印本頁]

作者: wangqiaomei 時間: 2009-11-2 09:06
標題: 大腸桿菌的獸醫實驗室檢測方法步驟
各位同仁：我現要做大腸桿菌的分離培養，具體該如何做？以及最新檢測方法、各培養基的選擇和制作該如何進行，請大家指教！

作者: kdnmk 時間: 2009-11-2 11:48
一、培養基配置

我們一般用LB液體培養基來擴大培養大腸桿菌，培養后可在LB固體培養基上劃線分離。以下為本實驗中培養基配置步驟：

1．稱量：準確稱取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化鈉0.5g，加水50ml。配置LB固體培養基時還需加1g瓊脂。

2．溶化：加熱熔化，用蒸餾水定容到50mL。配置LB固體培養基時還需加瓊脂，整個過程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導致燒杯破裂。

3．調pH：用1mol/L NaOH溶液調節pH至偏堿性。

4．滅菌：在兩個250ml的三角瓶中分別裝入50ml LB液體培養基和50ml LB固體培養基，加上棉塞。將培養皿用牛皮紙包好，放入滅菌鍋內，1kg壓力滅菌15min。

5．倒平板：滅菌后，待固體培養基冷卻至60℃左右時在酒精燈火焰附近操作進行。其過程是：①將滅過菌的培養皿放在火焰旁，右手拿裝有培養基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通過火焰；③用左手將培養皿打開一條稍大于三角瓶口的縫隙，右手將培養基倒入培養皿，立刻蓋上皿蓋；④待平板冷卻凝固后，將平板倒過來放置。

二、滅菌和消毒

1．無菌技術：①對實驗操作空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒；②將培養器皿、接種用具和培養基等器具進行滅菌；③為避免周圍微生物污染，實驗操作應在酒精燈火焰旁進行；④避免已滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。

2．消毒方法：①日常生活經常用到的是煮沸消毒法；②對一些不耐高溫的液體，則使用巴氏消毒法；③對接種室、接種箱或超凈工作臺首先噴灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強消毒效果，然后使用紫外線進行物理消毒；④實驗操作者的雙手使用酒精進行消毒。

3．滅菌方法：①接種環、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；②培養基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋；③表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。

三、細菌的分離

采用劃線分離法，其操作步驟是：將培養皿底部用拇指和無名指固定成傾斜狀態，在火焰旁將培養皿稍微打開。在此同時，用環狀接種針在火焰旁取少許菌懸液，迅速送入培養皿內，在平板培養基的一邊，作第1次平行劃線 3～5條，轉動培養皿約70°角，用燒過冷卻的接種針，通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線時，接種針應與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養皿邊緣，也不要將培養基劃破。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于恒溫箱培養。

四、菌落和菌種種類的辨認

細菌的菌落表面一般是光滑而濕潤的，有黏稠性，多數透明或半透明，但也有細菌的菌落表面是干燥、有褶皺的；放線菌由于有纖細的菌絲并可產生孢子，所以菌落表面是緊密的絨狀、堅實多皺，長孢子后就成粉末狀，由于菌絲和孢子有多種色素，所以在菌落培養基底部和菌落表面都有不同的顏色，菌落不易用接種環挑動；酵母菌落類似于細菌菌落，表面光滑而濕潤，有黏稠性但大多呈乳白色，少數呈紅色。

共同學習

作者: wangqiaomei 時間: 2009-11-2 15:46
樓上朋友謝謝你的回答，有兩個地方不太明白，
在兩個250ml的三角瓶中分別裝入50ml LB液體培養基和50ml LB固體培養基這話啥意思不明白呢？能否說清楚點呢？
用1mol/L NaOH溶液調節pH至偏堿性，偏堿性具體的數值是多少？

作者: haiwuya 時間: 2009-11-6 22:11
其實pH值可以不調的，大腸桿菌對PH的要求不是特別苛刻。
所謂固體的LB培養基，就是再液體LB培養基的基礎上添加1.5%-3%的瓊脂粉，高壓以后，添加了瓊脂粉的培養基在60℃左右倒入平皿中，冷卻后即為固體的平板。在該平板上劃線培養大腸桿菌
順便問問樓主，你那有普通的光學顯微鏡嗎？大腸桿菌如果做個簡單的革蘭氏染色，在顯微鏡下是很容易分辨的。

作者: wangqiaomei 時間: 2009-11-7 13:43
有哈~~~~~

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