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畜牧人

標(biāo)題: 甜菜堿藥物分析進展 [打印本頁]

作者: wlei908 時間: 2010-3-31 14:36
標(biāo)題: 甜菜堿藥物分析進展
甜菜堿藥物分析進展

關(guān)鍵詞】
甜菜堿
提取分離
定量
高效液相色譜法

甜菜堿（betaine，Bet）又名甘氨酸甜菜堿、甜菜素，化學(xué)名稱是三甲基氨基乙酸或三甲銨乙內(nèi)酯，19世紀(jì)最早發(fā)現(xiàn)于歐洲，是一種季銨型水溶性生物堿，廣泛存在于動植物和微生物體內(nèi)。其分子式為C5H11NO2，結(jié)構(gòu)式為（CH3）3N+CH2COO?，外觀物理形狀呈流動性，為鱗狀或棱狀白色結(jié)晶，易溶于水和甲醇，由于常溫時極易吸濕潮解，應(yīng)用時常將其制成甜菜堿鹽酸鹽（鹽酸甜菜堿）。自上世紀(jì)70年代以來，甜菜堿的研究漸成熱點，已被廣泛應(yīng)用于畜牧、醫(yī)藥、農(nóng)林、食品和日化等領(lǐng)域。特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域，甜菜堿許多優(yōu)良的藥理作用被相繼發(fā)現(xiàn)，可用于對抗高同型半胱氨酸綜合癥，能保肝護腎、保持心臟與血管健康、維護消化系統(tǒng)、抑瘤抗癌、降壓鎮(zhèn)靜、解熱鎮(zhèn)痛、耐缺氧、保護細(xì)胞抵抗高滲等等。體內(nèi)組織或排泄物中甜菜堿的測定有助于臨床上診斷人體內(nèi)代謝異常與否［1］，許多甜菜堿藥效研究需要對其進行治療藥物監(jiān)測，這都涉及到甜菜堿的分析測定。如何更準(zhǔn)確、簡單、快速、經(jīng)濟地從生物樣品中分離并定量甜菜堿，一直是學(xué)者們努力的方向。

1 從生物樣品中提取分離甜菜堿

基于甜菜堿的溶解性特點，從生物樣品中提取甜菜堿最常用的方法有水提和醇提兩種，如Hitz和Hanson［2］將生物樣品90℃水浴1h，冷卻后研磨，2 ℃去離子水浸提共3次，最后65 ℃減壓濃縮；最早提出提取甜菜堿方法的Pearce等［3］使用甲醇對生物樣品反復(fù)提取3次，然后于65 ℃減壓濃縮。國內(nèi)有用堿性三氯甲烷提取甜菜堿的報道［4］,樸茨茅斯大學(xué)的楊昕等［5］則采用了混合提取法，將甲醇?氯仿?0.2 mol·L?1碳酸氫鉀（12：5：1 v/v）加入生物樣品，60 ℃分別提取2次，然后用甲醇?水（1：1 v/v）60 ℃加熱提取，取得較好效果。

基于甜菜堿的兩性季銨型生物堿的特殊結(jié)構(gòu)，對其分離純化大多使用離子交換法。該方法是利用離子交換劑上的可交換離子與周圍介質(zhì)中被分離的各種離子間的親和力不同,經(jīng)過交換平衡達到分離目的的一種柱色譜法［6］。Horst［7］、劉新亞等［8］、尹昆等［9］分離提純甜菜堿均使用了此類方法，都是將提取液依次通過強堿性陰離子交換樹脂、強酸性陽離子交換樹脂，最后用氫氧化銨洗脫。此法能除去提取液中的氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖和苷類等成分，最終使測量結(jié)果準(zhǔn)確可靠。吳志榮［10］、楊東輝［11］則利用了薄層層析法來分離純化甜菜堿，但如何選擇優(yōu)良的展開劑、顯色劑仍是制約該法的一個瓶頸。另外谷大建等［12］采用Oasis HLB固相萃取小柱對樣品進行純化，得到較好的效果。

2 甜菜堿定量分析方法

對于甜菜堿的定量測定，自Pearce等發(fā)布碘量法［3］以來，又出現(xiàn)了可見一紫外分光光度法［13?14］、薄層掃描法［15］、非水滴定法［16］等許多分析方法，目前的主流方法是高效液相色譜（HPLC）法。

2.1 高效液相色譜（HPLC）法

該法準(zhǔn)確、快速，再現(xiàn)性高，可連續(xù)進樣，能滿足體內(nèi)藥物分析大樣本快速分析要求。根據(jù)選用色譜柱、檢測器種類及是否對甜菜堿進行衍生化，目前HPLC法大致分為以下幾種方案。

2.1.1 反相C18柱?紫外檢測器?直接測定

陳少良等［17］在測定甜菜堿時采用的流動相為50 mmol·L?1KH2PO4(pH4.45)和0.1%PIC B_8(辛烷磺酸)，流速0.7 ml·min?1,檢測波長為192 nm，測得甜菜堿的保留時間為6.3 min,加樣回收率達到90 %左右；尹昆等［9］、谷大建等［12］均采用類似的方法，測得甜菜堿保留時間分別為2.5 min、4.01 min，加樣回收率在90%以上。

2.1.2 LC?SCX、CLC?ODS柱?紫外檢測器?甜菜堿衍生化后測定

基于甜菜堿在近紫外區(qū)測定干擾大，保留時間短的特點，人們采用先將其衍生化再測定的方法。Laryea等采用［18］?冠醚?6及4?溴代苯甲酰甲基溴作為衍生試劑與樣品和KH2PO4混勻后80 ℃加熱60 min，制得甜菜堿的衍生物，使用強酸性陰離子交換色譜柱（LC?SCX），流動相為乙腈?水（90：10 v/v），10 mmol·L?1膽堿，流速1.5 ml·min?1,檢測波長為254nm來測定血樣和尿樣中的甜菜堿含量，發(fā)現(xiàn)衍生物保留時間為14.8 min，檢測最低限為5 μmol·L?1，效果良好。Lever等［19］、Mar MH等［20］亦采用這種方法對甜菜堿進行了成功檢測。許明旺等［21］則采用了18?冠醚?6及2，4?溴代苯甲酰甲基溴作為衍生試劑，使用CLC?ODS色譜柱，流動相為乙腈?水(35：65,其中含有0.1 mol/L的NaClO4),流速1 ml·min?1,檢測波長254 nm，測得衍生物保留時間為13 min，加樣回收率在95%以上。姚少威等［22］采用相同的方法檢測了復(fù)方枸杞顆粒中的甜菜堿含量，加樣回收率亦在95%以上。

2.1.3 胺基柱?紫外檢測器?直接測定

廖國玲等［23］采用Lichrospher NH2色譜柱，以乙腈?水(85：15 v/v)為流動相，流速0.7 ml·min?1，檢測波長195 nm，測定枸杞中甜菜堿，保留時間為16.58 min，平均回收率為98.9%，方法較為簡單，重現(xiàn)性好。

2.1.4 胺基柱?蒸發(fā)光檢測器?直接測定

基于甜菜堿在近紫外區(qū)測定干擾大的特點，龔立冬等［24］使用蒸發(fā)光檢測器代替紫外檢測器，采用Waters Spherisorb S5 NH2色譜柱，流動相為0.1％(體積分?jǐn)?shù))三氟乙酸水溶液?甲醇(l5：85 v/v)，流速為0.6 ml·min?1，蒸發(fā)光散射檢測器中漂移管溫度90 ℃，測定肉蓯蓉中的甜菜堿，加樣回收率達到99%以上。李向陽等［4］也采用胺基柱、蒸發(fā)光檢測器，流動相為乙腈?水(25：75 v/v)，流速1.0 ml·min?1，漂移管溫度50 ℃，進行甜菜堿含量測定，加樣回收率在97%以上。

2.2 其他分析方法

2.2.1 可見一紫外分光光度法

這種方法應(yīng)用較早，主要利用樣品與顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)而生成有色物質(zhì)，以便使用分光光度計進行測定。Barak等［13?14］處理后的肝組織樣品與冷卻的KH2混合產(chǎn)生碘化物沉淀，離心后用二氯乙烷溶解沉淀，在365 nm處測定吸光度，通過工作曲線計算出了甜菜堿含量。但該法干擾因素較多，特別是在測定低含量樣品時誤差較大。

2.2.2 薄層掃描法

郭輝等［15］用0.5%羧甲基纖維素鈉的硅膠G薄層板,以氯仿?甲醇?甲酸?水(2：8：2.2：0.5)為展開劑，以改良碘化泌鉀溶液為顯色劑，掃描波長為498 nm，對肝腎滋中的甜菜堿含量進行了測定。其最低檢出限為22.8 μg，加樣回收率在95 %以上。由于操作中難以保持展開溫度、展開劑極性及蒸氣壓等諸多條件的恒定，該法重現(xiàn)性并不是很理想。

2.2.3 非水滴定法

這是一種經(jīng)濟簡便的測定方法，齊永秀等［16］以冰醋酸作為溶媒,以結(jié)晶紫作為指示劑,使用0.1 mol·L?1標(biāo)準(zhǔn)高氯酸溶液滴定并考察了不同廠家生產(chǎn)的鹽酸甜菜堿的純度，平均回收率為99.81%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.19%。該法穩(wěn)定性及重現(xiàn)性較好，但無法滿足大樣本連續(xù)分析的要求。

2.2.4 微型電極法

國外學(xué)者［25］曾用此法測定了甲基胺混合物中甜菜堿的含量。該法以甘汞電極為參比電極,玻璃微型電極為測定電極,用雙靜電計記錄電壓的方法測定甜菜堿含量,具有響應(yīng)快、靈敏度高的特點，但前處理過程麻煩，也無法滿足大樣本連續(xù)分析的要求。

2.2.5 質(zhì)譜法與核磁共振法

質(zhì)譜法通常與氣相色譜儀或液相色譜儀聯(lián)用來達到理想分離與精密測定的效果。Holm等［26］使用這種方法對血漿中的甜菜堿、膽堿、二甲基甘氨酸進行了測定。國外學(xué)者還利用1H NMR法測定了病人尿樣中的甜菜堿［27］。不可否認(rèn)這兩種方法具有較高的精確性與靈敏度，但儀器較為昂貴，難以在大范圍內(nèi)推廣。

3 小
結(jié)

對甜菜堿的提取分離應(yīng)結(jié)合具體生物樣品及檢測手段，隨著檢測手段的改進，提取分離也將趨向簡單化、自動化。提取一般使用水、甲醇，而分離純化一般使用離子交換樹脂法，更為簡單的SPE(固相萃取)法也將得到廣泛應(yīng)用。對甜菜堿進行測定一般使用HPLC法。基于甜菜堿的強極性特點，分析柱的選擇越來越傾向于使用胺基柱，它能克服甜菜堿保留時間短，干擾大的缺點；對于僅配有紫外檢測器的實驗室來講，從檢測效果看衍生化法具有一定優(yōu)勢，國外尤為盛行，但操作復(fù)雜；如若克服使用近紫外檢測干擾大的缺點，蒸發(fā)光檢測器不失為一種良好選擇。一般實驗室如處理樣品樣本量少、對自動化要求不高，則非水滴定法、微型電極法可滿足條件，且靈敏度較為理想。

作者: secwind 時間: 2010-4-3 09:55
好資料，謝謝LZ

作者: 波縱天下 時間: 2010-4-3 15:22
東西已經(jīng)分析到實質(zhì)了。

歡迎光臨畜牧人 (http://www.cqnsfzw.com/)