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畜牧人

標(biāo)題: 米曲霉、黑曲霉發(fā)酵紅三葉草對(duì)異黃酮的影響研究 [打印本頁]

作者: apple12151007 時(shí)間: 2010-9-29 11:05
標(biāo)題: 米曲霉、黑曲霉發(fā)酵紅三葉草對(duì)異黃酮的影響研究
　　米曲霉、黑曲霉發(fā)酵紅三葉草對(duì)異黃酮的影響研究
　　陳鳳風(fēng) 成文曉張福元
　　摘要本研究利用引進(jìn)的產(chǎn)纖維素酶活高的米曲霉菌株1、2和黑曲霉3.3148，對(duì)紅三葉草固態(tài)發(fā)酵，通過比較不同菌發(fā)酵處理后酒精提取物在不同紫外波段吸光度曲線，研究了其對(duì)異黃酮結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明：米曲霉菌株2對(duì)異黃酮結(jié)構(gòu)有很大的破壞作用，而米曲霉菌株1和黑曲霉3.3148對(duì)其無影響。
　　關(guān)鍵詞紅三葉米曲霉、黑曲霉異黃酮
　　紅三葉 (Red Clover)為豆科多年生草本植物，又名紅花苜蓿、紅菽草、紅荷蘭翹搖、金雀菜等，屬車軸草屬(TrifolIUm L.)[1]。紅三葉草原產(chǎn)于小亞西亞和西南歐，在歐洲各國及俄羅斯、澳大利亞、新西蘭、美國等國海洋性氣候地區(qū)廣泛栽培。紅三葉草在我國新疆、吉林、云貴高原、北鄂西山地都有野生，另外我國江淮流域、華北、華南、西南等地均有栽培，是一種優(yōu)良的豆科牧草[2]。
　　紅三葉草主要含有異黃酮、維生素、氨基酸、糖類和等多種生物活性成分，其中異黃酮是紅三葉草中特殊的活性成分[3]。
　　異黃酮具有多種生理活性,概括起來主要有兩個(gè)方面：即植物雌激素功能和抗氧化功能[4、5、6]。
　　異黃酮在結(jié)構(gòu)上與哺乳動(dòng)物的雌激素——雌二醇相似,都具有雌激素的活性，它可與生物體內(nèi)雌激素受體ER結(jié)合而表現(xiàn)出一定的雌激素功能。由于異黃酮活性組分與ER的結(jié)合力和甾體雌激素與ER的結(jié)合力相比低近千倍,因此,其結(jié)合后的潛在健康效應(yīng)存在U型劑量-效應(yīng)關(guān)系,即低劑量時(shí)由于它與雌激素競爭結(jié)合ER而降低了雌激素活性,因而表現(xiàn)為抗雌激素作用;而中劑量時(shí)可產(chǎn)生一定的雌激素活性;高劑量時(shí),補(bǔ)充的異黃酮?jiǎng)t可活化因雌激素水平限制而未能活化的ER,產(chǎn)生雌激素增強(qiáng)效應(yīng)。這種U型劑量-效應(yīng)關(guān)系使得異黃酮具有雌激素樣的多種功能[7、8、9、10]。
　　在生產(chǎn)中應(yīng)用有顯著的效果：
　　(1).提高繁殖性能和提高泌乳性能，張榮慶和韓正康 [11]通過研究證實(shí),大豆異黃酮可以顯著提高二花臉母豬在試驗(yàn)初期的泌乳量。
　　(2).提高產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能，劉燕強(qiáng)等[12]將320日齡羅曼蛋雞隨機(jī)均分為對(duì)照組,喂基礎(chǔ)日糧-和試驗(yàn)組,基礎(chǔ)日糧中添喂大豆異黃酮 3mg/kg，結(jié)果試驗(yàn)組產(chǎn)蛋率顯著提高，且蛋重和飼料轉(zhuǎn)化率也有所提高，表明大豆異黃酮可能通過調(diào)控血液激素水平而提高產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能。馬學(xué)會(huì)[13]等研究：飼糧添加大豆黃酮可增加蛋殼厚度和蛋殼重，降低破蛋率，改善蛋殼品質(zhì)。
　　(3).提高肉雞生產(chǎn)性能，郭曉紅等 [14]分別在肉仔雞日糧中添加大豆異黃酮5、10、15mg/kg,結(jié)果表明,添加大豆異黃酮可顯著增加肉公雞的平均體增重、飼料效率及平均日采食量。添加量為10mg/kg效果最好。飼料利用率和平均日采食量較對(duì)照組均顯著提高(P<0.05)。還有報(bào)道異黃酮能夠提高奶牛的產(chǎn)奶性能和肉牛的生長性能。因此，異黃酮可作為畜禽生長促進(jìn)劑。后來的研究結(jié)果表明這類物質(zhì)還具有強(qiáng)心、降血脂、對(duì)抗性激素依賴性腫瘤生長和抗癌等作用。鑒于此，我們利用米曲霉、黑曲霉固態(tài)發(fā)酵紅三葉草產(chǎn)高活性的纖維素酶的同時(shí)，首先有必要研究其對(duì)異黃酮的影響。
　　1.材料與儀器
　　1.1試驗(yàn)材料
　　紅三葉草：購自甘肅岷海制藥有限公司，40目粉碎。
　　米曲霉菌株1：引自山西農(nóng)大食品學(xué)院
　　米曲霉菌株2(Aspergillus oryzae var. effusus 3.2824)：購于中國普通微生物保藏管理中心
　　黑曲霉(Aspergillus.niger 3.3148) ：購于中國普通微生物保藏管理中心
　　鷹嘴豆素標(biāo)準(zhǔn)品：購于天津尖峰天然產(chǎn)物研究所
　　1.2儀器設(shè)備
　　生化培養(yǎng)箱：LRH-250A，廣東省醫(yī)療器械廠
　　高壓滅菌鍋：中國上海醫(yī)療器械廠
　　搖床：TZ-ZBH臺(tái)式恒溫振蕩器，北京沃德創(chuàng)意技貿(mào)有限責(zé)任公司(250mL三角瓶用)
　　超凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造公司
　　干燥箱：101-A型，上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠
　　電子天平：Adventurer OHAUS
　　植物粉碎機(jī)：江蘇省東臺(tái)市電器廠
　　電熱恒溫水浴鍋：江蘇省東臺(tái)市電器廠
　　紫外可見分光光度計(jì)：UV2100 尤尼克上海儀器有限公司
　　500ml三角瓶、棉塞、牛皮紙等
　　2.實(shí)驗(yàn)方法
　　2.1菌種的制備
　　馬鈴薯葡萄糖斜面試管培養(yǎng)基(PDA)
　　將馬鈴薯洗凈去皮,稱取200g,切成小塊,放入1000ml水中煮沸至土豆塊變軟,用紗布過濾，在濾液中加入稱好的20g瓊脂,不斷攪拌至瓊脂完全溶化,然后加入20g葡萄糖,攪拌至溶解,停止加熱補(bǔ)足水分至1000ml,分裝于試管,包裝,121℃高壓蒸汽滅菌30min，趁熱擺好斜面，備用。
　　將米曲霉菌株1、米曲霉菌株2、黑曲霉在超凈工作臺(tái)內(nèi)接種于上述培養(yǎng)基，27℃恒溫培養(yǎng)至菌絲長滿試管，備用。
　　2.2紅三葉草發(fā)酵物的制備：
　　稱取20g紅三葉草粉于500ml三角瓶，加水40ml,攪勻，蓋好棉塞,外包牛皮紙，121℃高壓蒸汽滅菌45min。冷卻后于無菌條件下接2.1中備好的各菌種。每個(gè)菌種重復(fù)3瓶，于27℃培養(yǎng)至菌絲長滿2周后取出，干燥后40目粉碎待測(cè)。
　　2.3鷹嘴豆素標(biāo)準(zhǔn)物紫外吸收曲線圖的制作
　　精確稱取鷹嘴豆素5.2mg，用無水酒精定容于50ml容量瓶中。量取1ml于25ml容量瓶用無水酒精定容后，在230-300nm不同的波長測(cè)吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)物鷹嘴豆素的吸收峰圖如下：
　　 (, 下載次數(shù): 3)
　　Fig.1 The curve diagram of biochanin’s absorptance on different waveband
　　注：鷹嘴豆素在262nm處有最大吸收值
　　2.4紅三葉草和發(fā)酵基質(zhì)酒精提取物不同波段吸收峰圖的制作：
　　準(zhǔn)確稱取紅三葉干粉和經(jīng)米曲霉菌株1、米曲霉菌株2、黑曲霉發(fā)酵后烘干物1g，裝于濾紙包內(nèi)，置于索氏抽提管，用無水酒精90℃條件下提取完全，將索氏儀底部的圓瓶內(nèi)提取物全部轉(zhuǎn)移到200ml容量瓶內(nèi)，定容后在230-300nm測(cè)吸光值，制得酒精提取物在不同波段的吸光值曲線圖如下：
　　 (, 下載次數(shù): 7)
　　Fig.2 The curve diagram of alcoholic extractions ’absorptance by different waweband
　　3 結(jié)果與分析
　　由圖2結(jié)合圖1知：紅三葉草無水酒精提取物在260nm處有最大吸收值，經(jīng)黑曲霉3.3148、米曲霉菌株1發(fā)酵后的紅三葉酒精提取物在波長為260nm左右仍有最大吸收值，而且與未發(fā)酵紅三葉草酒精提取物的不同波段吸收曲線極為相似，可以推斷酒精提取物主要成分沒有變化，而經(jīng)米曲霉2發(fā)酵的紅三葉的酒精提取物在250-270nm波段內(nèi)沒有最大吸收值，其波段-吸光度曲線幾乎成為一直線，說明紅三葉草經(jīng)米曲霉菌株2發(fā)酵后的酒精提取物成分發(fā)生了很大變化。結(jié)合舒淑等高效液相色普法檢測(cè)大豆異黃酮和陳封政等紅三葉中總異黃酮含量的測(cè)定的報(bào)道，酒精提取物內(nèi)主要成分為異黃酮[34、35、36、37]，可以推斷米曲霉菌株2降解了紅三葉草內(nèi)異黃酮。
　　4結(jié)論
　　米曲霉菌株2為米曲霉變種，雖然其產(chǎn)纖維素酶活高，但通過對(duì)紅三葉的發(fā)酵發(fā)現(xiàn)其不利于異黃酮的應(yīng)用，因此選擇米曲霉菌株1、黑曲霉3.3148做進(jìn)一步研究。
　　作者簡介：陳鳳風(fēng) 成文曉，山西農(nóng)大碩士研究方向：生物飼料工程
　　張福元：山西農(nóng)大動(dòng)物科技學(xué)院，教授

作者: amypx 時(shí)間: 2010-9-29 11:23
謝謝收藏啦

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