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多克隆抗體的制備

一、抗原抗體反應

二、多克隆抗體制備原理

三、抗原的制備與純化

四、抗原純度的鑒定方法

六、免疫動物的選擇

七、動物的免疫

八、多克隆抗體制備的方法

九、抗血清效價及純度鑒定

十、抗血清的純化和保存

一、抗原抗體反應

1 抗原的概念：抗原（antigen,Ag)：是一類能刺激機體免疫系統發生免疫應答，并能與相應免疫應答產物（抗體和致敏淋巴細胞)在體內外發生特異性結合的物質。抗原的兩種特性：免疫原性和抗原性免疫原性（immunogenicity),即能與TC 或BC 抗原受體結合，刺激細胞活化、增殖、分化，產生抗體和致敏淋巴細胞的性能。抗原性（antigenicity),能與相應的免疫應答產物抗體或致敏淋巴細胞發生特異性結合的性能。

2 抗原的分類：根據抗原的性質分類：完全抗原（complete antigen）同時具備抗原性和免疫原性的物質。半抗原（hapten）（incomplete antigen）只有抗原性而不具有免疫原性的物質。半抗原與蛋白質類物質結合可具有免疫原性即成為完全抗原。賦予半抗原以免疫原性的蛋白質稱為載體。依抗原不同的物理性狀分類：顆粒抗原：細胞，微生物之類屬顆粒抗原；可溶性抗原蛋白質一般屬于可溶性膠體抗原。顆粒性抗原的免疫原性一般強于可溶性膠體抗原的免疫原性。

3 抗原的免疫原性：

異物性：抗原的異物性（foreignness）是指一種物質被機體免疫系統識別為非己的抗原異物的特性，特指外源性物質。外源性抗原作為異物一般具有免疫原性，可刺激機體產生免疫應答，最終被機體清除，如感染的病原微生物。異物性的物質包括以下幾類：① 異種物質如：馬血清蛋白、各種微生物及其代謝產物對人體而言都是異種物質，具有強的免疫原性；② 同種異體物質如：ABO 血型抗原、人類主要組織相容性抗原； ③ 自身抗原物質如：自身組織成分結構改變、隱蔽性自身成分暴露構成自身抗原。

一定的理化性狀：大分子膠體物質凡具有免疫原性的物質，分子量都較大，一般在10kDa 以上,在一定范圍內,分子量越大免疫原性越強。一定的化學組成和結構從化學組成來看，凡含有芳香族氨基酸（尤其是酪氨酸）的蛋白質，其免疫原性較強。從結構來看，結構越復雜其免疫原性越強。分子構象與易接近性分子構象是指抗原分子中一些特殊化學基團的三維結構，它決定抗原分子是否能與淋巴細胞表面的抗原受體相互吻合。易接近性是指抗原分子的特殊化學基團與淋巴細胞表面相應的抗原受體相互接觸的難易程度。完整性：具有一定理化性狀的物質須經非消化道途徑進入機體（包括注射、吸入、混入傷口等），并接觸淋巴細胞，才能成為良好抗原。如果是口服后可被消化酶水解成胨、氨基酸，破壞了其結構，就喪失了免疫原性。自然界中天然的抗原物質有：蛋白質、多糖、核蛋白。

宿主遺傳性：抗原的免疫原性也與機體的應答能力有關, 同種動物不同個體對同一種抗原的免疫應答存在明顯的差異，這種差異受遺傳因素控制，控制免疫應答的基因稱為免疫應答基（immune response,Ir)。

4 抗原的特異性：抗原特異性（antigenic specificity）：是指抗原與其受體（TCR 和BCR）和免疫應答產物抗體專一結合的性質。即抗原物質進入機體被淋巴細胞識別，產生的是針對蛋白質、多糖及其它大分子抗原物質的不同構成部位特異的免疫答。

抗原決定簇（基）（antigenic determinant,AD) 被抗原受體TCR 和BCR 特異性識別的抗原部分稱為抗原決定基或表（epitope)。是抗原特異性的物質基礎。體內存在的具有不同特異性的淋巴細胞克隆能識別不同的抗原決定基。表位的性質、數目和空間構象決定著抗原的特異性。抗原通過AD 與相應淋巴細胞表面的抗原受體結合，激活淋巴細胞，引起免疫應答。一個抗原分子可以有一種或多種不同的AD ，一種AD 決定著一種特異性，多種AD決定著多種特異性。

載體決定基和半抗原決定基：一個抗原分子具有載體決定簇和半抗原決定簇。

載體效應：初次免疫和再次免疫時，半抗原需要在相同的載體上才能使機體產生抗半抗原抗體，稱為載體效應，在免疫應答中，B 細胞識別半抗原決定簇，是抗體產生細胞，T 細胞識別載體決定簇，是輔助B 細胞產生抗體。半抗原決定簇又稱B 細胞決定簇；載體決定簇又稱T 細胞決定簇。

抗原刺激機體，產生免疫學反應，由機體的漿細胞合成并分泌的與抗原有特異性結合能力的一組球蛋白，這就是免疫球蛋白，這種與抗原有特異性結合能力的免疫球蛋白就是抗體，是介導體液免疫的重要效應分子，主要存在于血清等體液中。

（三）抗原抗體反應

抗原抗體反應:是指抗原與相應抗體之間的特異性結合反應。

原理：抗原抗體反應的物質基礎是抗原分子表面的抗原決定定簇與抗體分子高變區之間

的互補結合，在適宜條件下出現可見反應。這種互補性是由抗原、抗體分子的空間構型所決

定的，是抗原決定簇與抗體高變區的溝槽分子表面的結合。抗原抗體之間的結合力參與并促

進抗原與相應抗體結合形成抗原抗體復合物。

抗原抗體反應的特點：

1 Ag 與Ab 結合的特異性（Lock and Key Concept）：抗原與抗體的結合具有高度特異性，即一種抗原通常只能與由它刺激所產生的抗體結合。是由抗原決定簇與抗體分子高變區之間空間構型的互補性所決定的。這種特異性如同鑰匙和鎖的關系

2 可逆性：抗原與抗體的結合為非共價的可逆性結合，它們之間空間結構的互補程度不同，結合力強弱也不一樣，互補程度越高，則親和力越大。氫鍵（ Hydrogen bonds）、離子鍵（Electrostatic bonds）、范德華力（Van der Waal forces）、疏水力（Hydrophobic bonds）。

抗體的親和力（ affinity ）指一個抗體的一個抗原結合位點與抗原決定簇之間以非共價鍵相互作用強度。

抗體的親合力（avidity）指抗體多價情況下對抗原的結合力稱為親合力。與單價Ig 的親和力、Ig 的價數、抗原決定簇的數目有關。

3 比例性在抗原抗體特異性反應時，抗原抗體復合物的生成量與反應物的濃度有關。在恒定量的抗體中逐漸加入抗原量，免疫復合物的沉淀量逐漸增加然后又逐漸減少。

抗體過剩區：抗原總量不足以和全部抗體反應，在上清中可檢測到游離的抗體，此為前帶現象（prezone)；

等價區：加入的抗原量足以結合所有的抗體上清中檢測不到游離的抗原或游離的抗體；

抗原過剩區：抗原量多于結合所有抗體所需的量，導致被沉淀（或被凝集）的抗體減少，此為后帶現象（postzone)

4 階段性Ag-Ab 反應的兩個階段：Aggregation and Precipitation or agglutination。

（四）抗原抗體反應的影響因素

① 抗原：抗原的理化性狀、抗原決定簇的種類和數目。

② 抗體：特異性和親和力、抗體來源、效價。

③ 電解質：常用0.85%NaCl 溶液或各種緩沖液作Ag 及Ab 的稀釋液及反應液。；

④ 酸堿度：抗原抗體必須在合適的pH 環境中進行。抗原抗體反應一般在pH 為6~9為宜。

⑤ 溫度：適當的溫度加速抗原抗體反應的進行。常用的抗原抗體反應溫度為37oC

（五）抗原抗體復合物解離

抗原抗體復合物解離取決于兩方面的因素:：① 抗體對相應抗原的親和力；② 環境因素對復合物的影響。高親和性抗體的抗原結合點與抗原表位的空間構型上非常適合，兩者結合牢固，不容易解離；低親和性抗體與抗原結合形成的復合物較易解離。解離后的抗原或抗體均能保持未結合前的結構、活性及特異性。

（六）交叉反應

共同抗原：兩種來源不同的抗原，除各有其主要的特異性抗原決定簇外，相互之間也存在部分相同的抗原決定簇，這種共有的抗原決定簇稱為共同抗原

交叉反應:
一種共同抗原刺激機體產生的抗體，可與其他含有共同抗原的物質發生結合反應，稱為交叉反應。

二、多克隆抗體制備原理

1 多克隆抗體的概念

多克隆抗體：在含有多種抗原決定簇的抗原刺激下，體內多個 B 細胞克隆被激活并產生針對多種不同表位的單克隆抗體，其混和物為多克隆抗體。★ 機體內所產生多克隆免

疫血清實質上是由多種抗體組成的混合物，又稱多克隆抗體。

2 多克隆抗體產生原理

初次反應的抗體持續時間較短，親和力也較低，多無實際應用價值。機體初次接觸抗原后，激發體液免疫應答反應。在Mø 和Th 的作用下，B 細胞被激活,增生分化為漿細胞和記憶B 細胞（Bm）。漿細胞產生特異性抗體。由于初次反應時，只有少量對該抗原特異的免疫活性細胞被誘導而增生分化為漿細胞。隨著抗原的消耗，抑制T 細胞（Tc）的激活和循環抗體的反饋抑制作用，漿細胞減少，抗體滴度很快下降。

二次反應產生的抗體主要是高親和力的IgG。

機體再次受同一抗原刺激后，對該抗原特異性的Bm 迅速增殖分化為漿細胞，產生特異性抗體。Th 的記憶細胞也加快反應的進行，在抗原作用1~2 天后，抗體滴度迅速上升。抗體合成率為初次反應的幾倍到幾十倍。

三、抗原的制備與純化

1 顆粒抗原制備

細胞抗原：自然界中某些細胞組分的抗原性不僅取決于組成它的蛋白分子的一級結構，有時也要求完整的二級結構甚至三級結構。將細胞組分整體分離直接免疫動物會得到事半功倍的效果。

利用細胞個組分質量大小的不同，通過密度梯度離心的方法，在適當的介質中，各組分沉降于離心管內的不同區域，分別收集，即可得到所需組分。

細菌類抗原：細菌類抗原首先應該選好免疫用菌株，在適宜條件下培養增殖，刮取菌苔，經殺菌后稀釋成適當濃度作為抗原液。

2 可溶性抗原制備與純化

可溶性抗原包括蛋白質、多肽、脂蛋白、鐵蛋白、類脂、糖蛋白、細菌毒素、酶、補體等均為良好的抗原。為制備特異性高的抗血清一般均需加以純化。抗原純化常用的方法：中性鹽沉淀法、凝膠過濾層析法、離子交換層析法、免疫吸附親和層析法。

3 半抗原的免疫原制備法

半抗原：多肽，甾族激素，藥物，脂肪胺，核苷等小分子物質僅能與相應的抗體發生特異性結合反應，而它們本身并不是免疫原，不能刺激機體產生抗體。

半抗原免疫原制備: 將小分子半抗原制備成免疫原通常可用物理吸附方法和化學方法。

物理吸附方法: 通過電荷和微孔吸附半抗原。

物理吸附劑有：碳粉，聚乙，葡聚糖硫酸鈉，甲基纖維素等。

化學方法: 應用某些功能團試劑把半抗原連接到載體上。

載體: 包括血清蛋白（牛血清白蛋白，甲狀腺球蛋白，血藍蛋白，卵白蛋白以及人工合成的多聚賴酸等。半抗原結合到載體上的數目直接與抗體生成有關，半抗原連接在載體上的數目至少有20 個以上，才能有效地產生抗體。

四、抗原純度的鑒定方法

蛋白質抗原純化以及抗血清制備后均需作純度鑒定，通常采用的鑒定方法有

1、醋酸纖維薄膜電泳，此法可以初步鑒定抗原純度，不需要抗血清，較為方便。

2、SDS-PAGE，是鑒定純度最為常用的方法，分辨率高，不需要抗血清，可以從樣品的泳動率初步了解其分子量。還可以和標準樣品相比較，對各電泳區帶的物質加以定型。

3、雙向瓊脂擴散法，是鑒定抗原純度最為簡單的方法，主要是通過各種特異性抗血清鑒定抗原純度，首先必須有抗體才能用這一方法。

五、免疫佐劑

1 佐劑的概念和種類

佐劑的概念：佐劑是非特異性的免疫增強劑，有些物質與抗原一起或預先注入機體，可增強機體對該抗原的特異性免疫應答或改變免疫應答類型。

1）微生物及其產物：如分枝桿菌（結核桿菌、卡介苗) 短小棒狀桿菌、白日咳桿菌、革蘭氏陰性菌的內毒素。

2）無機化合物：氫氧化鋁、明礬等

3）合成佐劑：如雙鏈多聚肌胞苷酸（polyI:C)

4）油劑：如弗氏佐劑、礦物油、植物油

2 佐劑的生物學作用

增加抗原的免疫原性，使無或微弱免疫原物質變成有效的免疫原；提高抗體的滴度，提高初次免疫應答和再次免疫應答抗體的滴度；改變抗體的類型，由產生IgM 轉變成IgG；引起或增強遲發型超敏反應。

3 佐劑的作用機制

① 改變抗原物理性狀，延緩抗原降解和排除，延長體內存留的時間，從而更有效的刺激免疫系統；

② 刺激單核巨噬細胞增強其對抗原的處理和遞呈能力；

③ 刺激淋巴細胞增生和分化，從而增強和擴大免疫應答的效應。

弗氏不完全佐劑（IFA) 石蠟油+羊毛脂

弗氏完全佐劑 (CFA) 石蠟油+羊毛脂+ 卡介苗

抗原和佐劑的比例為 1：1，由于佐劑是油劑，加抗原后要充分混合成乳劑。

六、動物的選擇

1 動物的種類和種系：供免疫用的動物主要是哺乳動物和禽類，常選擇家兔、綿羊、山羊、馬、騾和豚鼠及小鼠等。動物的免疫應答受動物的遺傳基因影響，同一種系的動物對不同抗原的免疫應答和不同種系的動物對同一抗原的免疫應答均不盡相同。抗原的來源與免疫動物的親緣較遠，產生的抗體效價高，同種系或親緣較近，產生的抗體的效價就差。

2 動物的生理狀況：由于個體差異的存在，同一抗原免疫同一種系不同個體的動物，產生的抗體的效價有很大的差異。與動物的年齡和營養狀況密切相關。免疫用的動物最好選擇適齡的健康雄性動物，雌性動物特別是妊娠動物用于制備免疫抗體則非常不合適，有時甚至不產生抗體。

3 抗血清的需要量：根據實驗中抗血清的需要量，選用最經濟的動物和免疫動物的只數。一般實驗室采用的抗體，多用兔和羊制備。

七、動物的免疫

1 抗原劑量：抗原的免疫劑量應根據抗原的免疫原性強弱、抗原來源難易、動物的種類、免疫周期等來選擇抗原劑量。

免疫劑量過低，不能引起足夠強的免疫刺激，免疫劑量過多，有可能引起免疫耐受。在一定的范圍內，抗體的效價是隨注射劑量的增加而增高。蛋白質抗原的免疫劑量比多糖類抗原寬。一般情況下，小鼠的首次免疫劑量為50μg～400μg/次，大鼠為100μg～1 000μg／次，家兔為500μg～1 000μg/kg/次，加強劑量為首次劑量的1／2～1／3。

2 注射途徑：抗原的進入途徑決定了抗原吸收、分布和代謝的速度。吸收越快，分解代謝越快，對機體影響的時間越短。吸收越快，單位時間的有效抗原量就越大，機體的免疫應答就越強，毒副作用也越強。根據免疫應答過程中各階段的特點，選擇注射途徑。常用的途徑有：靜脈、脾臟、淋巴結、腹腔、肌肉、皮下、皮內、掌內、跖內皮下。對抗原吸收的速度：靜脈=脾臟=淋巴結>腹腔>肌肉>皮下>皮內>掌內=跖內皮下。基礎免疫應選擇緩慢吸收的途徑，延長抗原刺激時間。

3 加強免疫時間：與抗原的理化性質、劑量、進入途徑、機體狀況和所處的免疫應答階段有關。抗原理化性質穩定，吸收分布速度慢或機體處于免疫應答的早期，應延長間隔時間。兩次注射的間隔時間應長短適宜,太短起不到再次反應的效果，太長則失去了前一次激發的敏感作用。一般情況下，第一次加強免疫應在基礎免疫后的2~3 周，以后每7~10 天加強一次。加佐劑間隔時間應為2 周左右。注射的Ig 純度高，則一般不易引起過敏反應，如注射血清，即使是少量，在再次免疫時，極易引起過敏反應，所以一定要采取措施。

4 加強免疫次數：抗原的免疫原性強弱和動物對抗原的敏感性有關。抗原免疫原性弱，需多次加強才能獲滿意的抗血清。得制備高度特異性的抗血清,可選用低劑量抗原短程免疫法需要獲得高效價的抗血清，宜采用大劑。量長程免疫法。免疫周期長者，可少量多次。免疫周期短者，應大量少次。最簡單的方法是直接檢測血清中的抗體滴度，觀察免疫效果。

5 佐劑應用：加佐劑比不加佐劑的注射劑量要小，對家兔而言，采用弗氏完全佐劑，則需注射0.5mg～1mg/kg./次，如采用弗氏不完全佐劑則注射劑量應大10 倍以上。

八、多克隆抗體制備方法

1 多克隆抗體制備方法流程

純化的抗原→與弗氏佐劑一起充分乳化→注射動物體內（劑量，次數，途經等均要適宜）→測定效價（如效價高，則不必加強免疫） → 1 周后經動脈放血→分離血清→純化抗血清備用。

九、抗血清效價及純度鑒定

抗血清效價：指抗血清中抗體含量的某一相應的近似值。

抗血清純度：指只與相應的抗原產生沉淀線，而不與其它血清學無關的抗原物質發生反應。抗血清效價鑒定方法：雙向免疫擴散試驗、凝集反應。結果判定：根據出現沉淀線的數量和位置來鑒定免疫血清的純度和效價。

十、抗血清的純化和保存

由抗原免疫動物制得的多克隆抗血清是一個非常復雜的復合體。包括了全部血清成分。對于一些試驗來說，免疫血清無需純化即可應用，如用于FACS 分析，大多數ELISA，以及細胞毒試驗等。有些試驗則要求應用進一步純化的抗體，如需要精確知道抗體濃度時進行化學修飾標記熒光素時或放射物時，以及制備抗體片段（F（ab’）2，Fab 等）時。抗體存在于抗血清中時，其活性相對穩定。每一次的純化過程都會使抗體的活性和絕對量損失。因此抗體的純化要根據實驗需要進行，盡量減少不必要的純化過程。主要純化方法：中性鹽沉淀法、凝膠過濾層析法、離子交換劑層析法、免疫吸附親和層析法。

免疫血清的保存：制備的抗血清如果保存得當，可數月至數年效價無明顯變化。常用的保存方法：⑴ 冰凍保存； ⑵ 冷凍干燥保存； ⑶ 加防腐劑保存； ⑷ 中性甘油保存；

畜牧人