雙連翹粉針的質量標準研究
張國紅 王剛 杜國清
（四川華西動物藥品研究所，綿陽高新區， 621000 ）
汪勇熊劍于飛
（四川華西動物藥業集團有限公司，綿陽高新區，621000）
關鍵詞：連翹苷；高效液相色譜法；雙連翹粉針
雙連翹粉針是由連翹、雙花和板藍根三味中藥的全提取物經科學方法精制而成，是治療傳染性胸膜肺炎、肺疫、喘氣病、葡萄球菌病、鏈球菌病、大腸桿菌病、痢疾桿菌病、肺炎球菌病、綠膿桿菌病、腦膜炎雙球菌病、結核病、乳房炎、子宮炎等細菌性疾病和流行性腹瀉、流感、圓環病毒病、藍耳病等病毒性疾病的中藥注射制劑[1,2]。具有抗菌抗病毒、利膽保肝、止咳平喘、調節免疫等作用[3]。其主藥連翹具有清熱止嘔、清利肝膽、除濕退黃、通調三焦等多種作用[4]。連翹中的主要生物活性成分連翹苷具有較強的抗菌作用，并能抑制CAMP磷酸二酯酶的活性[5]，故以連翹苷作為指標成分，進行了含量測定。
以往文獻報道對連翹苷的測定方法有薄層色譜法[6]、梯度洗脫的RP-HPLC法[7]等。鐘品以硅膠G-4%NaAc薄層板鑒別連翹時，供試品溶液在與連翹對照藥材色譜相應位置上顯2個顏色相同的斑點;而陰性對照液不顯相應主斑點[8]。張玲等采用雙波長薄層掃描法測定青翹和老翹中連翹苷的含量，青翹中連翹苷含量為0.076%；老翹中僅為0.012%。作者認為雙波長薄層展開及顯色系統測定連翹苷，方法簡便、快速、靈敏度高、重現性好，可作為連翹藥材及含連翹制劑的質控方法。在連翹苷提取分離中，采用氯仿進行提取，再用水洗去氯仿提取液中水溶性雜質，可有效地去除干擾，薄層效果較好[9]。中藥制劑中連翹苷的測定未曾報道過。王雪等用反相高效液相色譜法測定連翹生藥及銀甲婦康液等含連翹制劑中連翹苷的含量。線性范圍為0.15～1.95 μg，方法回收率為101.3%，RSD為1.3%。作者認為該方法能消除中藥制劑中復雜組分的干擾，準確地對連翹苷進行含量測定[10]。我們用氧化鋁柱層析對樣品進行凈化處理后，采用ODS柱、乙腈-水(22∶78)為流動相的RP-HPLC法，能夠準確地對雙連翹粉針中的連翹苷含量進行測定，陰性對照不干擾，取得較為滿意的結果。
1 儀器與試藥
日本島津LC-6A高效液相色譜儀，SPD-6AV紫外檢測器，C-R4A數據處理機。連翹苷對照品(中國藥品生物制品檢定所)，雙連翹粉針(四川華西動物藥業有限公司)。乙腈(色譜用)，重蒸餾水。
2 實驗方法
2.1 供試品溶液的制備
2.1.1雙連翹粉針 精密稱取雙連翹粉針0.5g，加甲醇10 mL，充分攪拌后過氧化鋁柱(17 cm×2 cm，中性氧化鋁20 g)，用50%的甲醇35 mL少量多次洗脫，收集洗脫液于水浴上揮干，殘渣用50%的甲醇溶解后轉移至25 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，過濾，棄去初濾液，收集續濾液備用。
2.1.2雙連翹粉針陰性對照 去掉處方中的連翹全提取物后，照生產工藝制備得到雙連翹空白粉針（由四川華西動物藥業有限公司提供），然后按“2.1.1”項的方法制備得到陰性對照液。
2.1.3連翹 取適量連翹生藥粉碎后，精密稱取生藥粉末0.5 g，加甲醇15 mL超聲提取30 min后，轉移至25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻后過濾，棄去初濾液，取續濾液備用。
2.2 連翹苷對照品溶液的配制 精密稱取連翹苷對照品25 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度約為0.50 mg。mL-1的對照品貯備液。精密量取對照品貯備液15 mL于50 mL容量瓶中，用50%的甲醇稀釋到刻度，搖勻，即得濃度約為0.15mg。mL-1的對照品溶液。
2.3 色譜條件 經試驗后選定的色譜條件為色譜柱:Shim-Pack CLC ODS柱(150 mm×6.0 mm)，柱溫:30℃;流動相:乙腈-水(22∶78)，流速:1.0 mL。min-1;檢測波長為230 nm。
3 實驗結果
3.1 色譜圖 在選定條件下，連翹苷對照品、銀甲婦康液、連翹以及雙連翹粉針連翹陰性對照的色譜圖見圖1。可見，連翹苷出峰處陰性對照無干擾。
a.連翹苷對照品 b.連翹苷陰性對照c. 雙連翹粉針 d.連翹藥材
1.連翹苷(23.06 min)
3.2 線性與范圍 分別取連翹苷對照品溶液1，3，5，7，9，11，13 μL進樣，樣品平行操作，記錄色譜圖，以峰面積對連翹苷的進樣量X(μg)作線性回歸，得到線性方程為:A=8.446+759.6 Xr=0.9996。說明連翹苷進樣量在0.15～1.95 μg范圍內線性較好。
3.3 回收試驗
3.3.1凈化回收率 分別精密量取連翹苷對照品溶液2 mL，分別加水2 mL，照雙連翹粉針樣品預處理方法制備試驗溶液。另精密量取同一對照品貯備液2 mL，置25 mL容量瓶中，用50%的甲醇稀釋到刻度，即得對照溶液。供試溶液和對照溶液分別進樣10 μL，記錄色譜圖，根據所得峰面積，計算凈化回收率。平均凈化回收率為99.1%(n=6)，RSD=0.74%。說明采用選定方法凈化樣品有很好的凈化回收率。
3.3.2加樣回收率 取雙連翹粉針空白溶液(雙連翹粉針的處方中去掉連翹，但制備工藝相同)25 mL，分別準確加入一定量的連翹苷對照品，照雙連翹粉針樣品預處理方法制備得試驗溶液。進樣10 μL，另取連翹苷對照溶液1，3，5，7，9，11，13 μL進樣，按標準曲線法測定并計算加樣回收率，結果見表1。平均回收率為101.3%，RSD=1.3%，n=15。
表1 回收率測定結果(n=3)
| 加入量/mg | 回收率/% | RSD／% |
| 0.492 | 102.3 | 1.15 |
| 0.98 | 100.6 | 1.62 |
| 1.48 | 100.8 | 1.25 |
| 1.97 | 100.3 | 0.76 |
| 2.46 | 102.3 | 0.23 |
3.5 穩定性試驗 于0，2，4，6，8，12 h取同一供試品溶液和對照品溶液各10 μL，分別進樣2次，計算日內RSD分別為1.11%和0.91%。再于第1，2，3，4 d分別取同一供試品溶液和對照品溶液各10 μL，進樣2次，計算日間RSD分別為2.54%和0.84%。
3.6 進樣精密度試驗 取對照品溶液，重復進樣6次，根據峰面積值，計算得平均峰面積A=737880，RSD為0.85%。
3.7 系統適用性試驗 照“2.1.1”項下方法制備樣品溶液，照“2.3”項下的色譜條件進樣1次，以連翹苷峰計算，測得柱效為9.2×103，連翹苷與其前后雜質的分離度分別為8.85和5.31。
3.8 樣品測定 采用前述的樣品預處理方法和色譜條件，分別測定了5個批號的雙連翹粉針中連翹苷的含量以及連翹生藥中連翹苷含量，結果見表2。
表2 不同樣品中連翹苷的含量(n=3)
| 樣品 | 平均含量/mg。mL-1 | RSD/% |
| 雙連翹粉針20040315 | 0.584 | 1.11 |
| 20040326 | 0.512 | 0.15 |
| 20040407 | 0.757 | 1.19 |
| 20040428 | 0.892 | 0.42 |
| 20040509 | 0.255 | 0.61 |
| 連翹 | 0.0120(mg。mg-1) | 1.35 |
4.1我們曾經采用過甲醇(含1%的四氫呋喃)-水(含0.01 mol。L-1磷酸二氫鈉，pH 3.2)(40∶60)的系統，不同比例的乙腈-甲醇-水系統，以及不同比例的乙腈-水系統，結果表明：乙腈-水為22∶78時，連翹苷峰形對稱，分離完全，陰性對照不干擾。我們同時還發現，乙腈比例微小的變化會較顯著地影響連翹苷的保留時間。
4.2在樣品預處理方法中，我們曾嘗試采用過液液萃取法和硅膠柱作為層析柱的方法。前者由于凈化不完全，引入雜質多而放棄。后者則會使連翹苷在柱上的保留性較強，不易被完全洗脫。采用中性氧化鋁柱，連翹苷能很容易地被50%甲醇洗脫，而中藥制劑中黃酮類等干擾組分能夠有效地被保留在柱上，用于以上幾個品種的預處理，凈化效果好，故確定采用氧化鋁柱。
4.3在對不同批號的雙連翹粉針中連翹苷測定時，發現其含量差異較大。