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畜牧人

標(biāo)題: 禽流感抗體濫測(cè)血凝和血凝抑制試驗(yàn) [打印本頁(yè)]

作者: nsqs020701 時(shí)間: 2009-6-29 13:03
標(biāo)題: 禽流感抗體濫測(cè)血凝和血凝抑制試驗(yàn)

血凝抑制（HI）試驗(yàn)

流感病毒顆粒表面的血凝素（HA）蛋白，具有識(shí)別并吸附于紅細(xì)胞表面受體的結(jié)構(gòu)，HA試驗(yàn)由此得名。HA蛋白的抗體與受體的特異性結(jié)合能夠干擾HA蛋白與紅細(xì)胞受體的結(jié)合從而出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。
該試驗(yàn)是目前WHO進(jìn)行全球流感監(jiān)測(cè)所普遍采用的試驗(yàn)方法?？捎糜诹鞲胁《痉蛛x株HA亞型的鑒定，也可用來(lái)檢測(cè)禽血清中是否有與抗原亞型一致的感染或免疫抗體。
HA-HI試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是目前WHO進(jìn)行全球流感監(jiān)測(cè)所普遍采用的試驗(yàn)方法，可用來(lái)鑒定所有的流感病毒分離株，可用來(lái)檢測(cè)禽血清中的感染或免疫抗體。它的缺點(diǎn)是只有當(dāng)抗原和抗體HA亞型相一致時(shí)才能出現(xiàn)HI象，各亞型間無(wú)明顯交叉反應(yīng)；除雞血清以外，用雞紅細(xì)胞檢測(cè)哺乳動(dòng)物和水禽的血清時(shí)需要除去存在于血清中的非特異凝集素，對(duì)于其它禽種，也可以考慮選用在調(diào)查研究中的禽種紅細(xì)胞；需要在每次試驗(yàn)時(shí)進(jìn)行抗原標(biāo)準(zhǔn)化；需要正確判讀的技能。
1
阿氏（Alsevers）液配制
稱量葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g，加蒸餾水至100mL，散熱溶解后調(diào)pH值至6.1，69kPa 15min高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/font>
2
10%和1%雞紅細(xì)胞液的制備
2.1采血
用注射器吸取阿氏液約1mL，取至少2只SPF雞（如果沒(méi)有SPF雞，可用常規(guī)試驗(yàn)證明體內(nèi)無(wú)禽流感和新城疫抗體的雞），采血約2～4mL，與阿氏液混合，放入裝10mL阿氏液的離心管中混勻。
2.2 洗滌雞紅細(xì)胞
將離心管中的血液經(jīng)1500～1800 r/min 離心8分鐘，棄上清液，沉淀物加入阿氏液，輕輕混合，再經(jīng)1500～1800 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，再重復(fù)2次以上過(guò)程后，加入阿氏液20 mL，輕輕混合成紅細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆?，不超過(guò)5天。
2.3
10%雞紅細(xì)胞懸液
取阿氏液保存不超過(guò)5天的紅細(xì)胞，在錐形刻度離心管中離心1500～1800 r/min 8分鐘，棄去上清液，準(zhǔn)確觀察刻度離心管中紅細(xì)胞體積(mL)，加入9倍體積(mL)的生理鹽水，用吸管反復(fù)吹吸使生理鹽水與紅細(xì)胞混合均勻。
2.4
1%雞紅細(xì)胞液
取混合均勻的10%雞紅細(xì)胞懸液1 mL，加入9 mL生理鹽水，混合均勻即可。
3 抗原血凝效價(jià)測(cè)定（HA試驗(yàn)，微量法）
3.1 在微量反應(yīng)板的1孔～12孔均加入0.025mL PBS，換滴頭。
3.2吸取0.025mL病毒懸液（如感染性雞胚尿囊液）加入第l孔，混勻。
3.3從第1孔吸取0.025mL病毒液加入第2孔，混勻后吸取0.025mL加入第3孔，如此進(jìn)行對(duì)倍稀釋至第11孔，從第11孔吸取0.025mL棄之，換滴頭。
3.4每孔再加入0.025mL PBS。
3.5每孔均加入0.025mL 體積分?jǐn)?shù)為1%雞紅細(xì)胞懸液（將雞紅細(xì)胞懸液充分搖勻后加入）見(jiàn)附錄B。
3.6振蕩混勻，在室溫（20～25℃）下靜置40min后觀察結(jié)果（如果環(huán)境溫度太高，可置4℃環(huán)境下反應(yīng)1小時(shí)）。對(duì)照孔紅細(xì)胞將呈明顯的鈕扣狀沉到孔底。
3.7結(jié)果判定
將板傾斜，觀察血凝板，判讀結(jié)果（見(jiàn)下表）。

表1：血凝試驗(yàn)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

類別	孔底所見(jiàn)	結(jié)果
1 2 3 4 5	紅細(xì)胞全部凝集，均勻鋪于孔底，即100%紅細(xì)胞凝集紅細(xì)胞凝集基本同上，但孔底有大圈紅細(xì)胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝塊紅細(xì)胞于孔底形成小圓點(diǎn)，四周有少許凝集塊紅細(xì)胞于孔底呈小圓點(diǎn)，邊緣光滑整齊，即紅細(xì)胞完全不凝集	++++ +++ ++ + -

能使紅細(xì)胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝效價(jià)，此效價(jià)為1個(gè)血凝單位（HAU）。注意對(duì)照孔應(yīng)呈現(xiàn)完全不凝集（-），否則此次檢驗(yàn)無(wú)效。
4 血凝抑制（HI）試驗(yàn)（微量法）
4.1 根據(jù)3的試驗(yàn)結(jié)果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點(diǎn)，終點(diǎn)稀釋倍數(shù)除以4即為含4HAU的抗原的稀釋倍數(shù)。例如，如果血凝的終點(diǎn)滴度為1:256，則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1:64（256除以4）。
4.2 在微量反應(yīng)板的1孔～11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mL PBS。
4.3 吸取0.025mL血清加入第1孔內(nèi)，充分混勻后吸0.025mL于第2孔，依次對(duì)倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025mL棄去。
4.4 1孔～11孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液0.025mL，室溫（約20℃）靜置至少30min。
4.5 每孔加入0.025mL體積分?jǐn)?shù)為1%的雞紅細(xì)胞懸液混勻，輕輕混勻，靜置約40min（室溫約20℃，若環(huán)境溫度太高可置4℃條件下進(jìn)行），對(duì)照紅細(xì)胞將呈現(xiàn)鈕扣狀沉于孔底。
4.6 結(jié)果判定
以完全抑制4個(gè)HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。
只有陰性對(duì)照孔血清滴度不大于21og2，陽(yáng)性對(duì)照孔血清誤差不超過(guò)1個(gè)滴度，試驗(yàn)結(jié)果才有效。HI價(jià)小于或等于21og2判定HI試驗(yàn)陰性；HI價(jià)等于31og2為可疑，需重復(fù)試驗(yàn)；HI價(jià)大于或等于41og2為陽(yáng)性。

作者: quancheng5566 時(shí)間: 2010-2-6 11:39
不錯(cuò)的資料。值得借鑒。

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