微生物發酵飼料生產關鍵因素的優化及發酵過程成分變化分析

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　　微生物發酵飼料是一種利用乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌等有益微生物對一種或多種飼料原料進行厭氧或好氧發酵，提高飼料原料營養物質的利用率，消除抗營養因子，同時有益微生物大量繁殖、富集，功能性初級、次級代謝產物大量生成的一種新型發酵生物飼料。近年來，隨著生物技術的迅猛發展、腸道微生態研究的不斷深入和認可，發酵飼料在畜牧業中的應用越來越廣泛，其產量、質量均得到了顯著的增長和提高。但相對于其他的如氨基酸、抗生素等發酵產品，發酵飼料的附加值還較低，從業人員多數無發酵專業背景，如何進一步降低生產成本，滿足動物不同生長階段產品細分和特異性營養需求是今后發酵飼料的重要發展方向。

　　目前，國內外對發酵飼料的研究主要集中在發酵菌株類型、生理功能、飼喂效果上，但對其發酵基質選擇的科學性、發酵眾多代謝物質的活性成分分析缺乏研究，成為了阻礙微生物發酵飼料進一步發展的壁壘。因此，筆者將著重研究水分、溫度、能量和蛋白等關鍵因素對發酵飼料生產的影響，對其進行優化選擇，并對發酵過程中各營養成分的變化進行測定分析，以期能降低發酵飼料的生產成本，為其產品的細分、不同發酵階段的營養組成提供理論依據，最終將發酵飼料的生產技術推向生產實際。

　　01　材料與方法

　　1.1 材料

　　發酵菌株：復合發酵制劑，內含乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌，以乳酸菌為主，總菌數108個/g，由北京某公司提供。
　　培養基：MRS培養基（乳酸菌）、YPD培養基（酵母菌）、LB培養基（枯草芽孢桿菌培養基）。
　　發酵設備及方式：帶有單向排氣呼吸閥的PE膜密封包裝，生料發酵，裝袋量2kg；包裝后堆積發酵，一堆6~8袋，夏天用大功率排氣扇通風降溫，冬天用爐火或布簾遮蓋保溫。
　　試驗在福建省預防獸醫學與獸醫生物技術重點實驗室，于2015年2-7月進行。

　　1.2 方法

　　1.2.1 發酵物料組成對發酵效果的影響

　　配方1（常規飼料）組成（干物質含量）：米糠13.0%、木薯粉9%、玉米粉37.5%、麩皮15.0%、棉粕23.0%、復合多維1.0%、紅糖1.5%。
　　配方2（高糖分飼料）組成（干物質含量）：米糠13.0%、玉米粉42.5%、麩皮15.0%、棉粕12.5%、復合多維1.0%、玉米漿16%。
　　配方3（高蛋白飼料）組成（干物質含量）：豆粕52.0%、玉米蛋白粉20.0%、麩皮13.0%、花生粕4.0%、玉米胚芽粕7.0%、復合多維1.0%、賴氨酸1.0%、紅糖2.0%。
　　各配方中設定比例的紅糖用37℃溫水攪拌溶解，加入總物料0.1%的菌株混勻，再與其他原料組成混合，含水量最終控制在35%~36%、裝入發酵袋中進行密封發酵（生料密封發酵），發酵溫度30℃，發酵12h后每隔12h取樣測定其乳酸菌含量和pH變化，分析不同發酵物料組成對發酵效果的影響。
　　發酵過程中菌種含量、營養成分變化復雜，由于發酵過程是各菌共同作用結果，其中又主要以乳酸菌為主，因此最終選定以總菌含量和pH變化為指標考察發酵效果。

　　1.2.2 發酵物料含水量、溫度對發酵效果的影響

　　在配方1（常規飼料）條件下，設定控制發酵物料含水量為24%~40%，30℃生料密封發酵7天，從第3天開始取樣測定其總菌含量和pH，分析不同含水量對發酵效果的影響。
　　在配方1（常規飼料）、選定的最優發酵物料含水量條件下，在夏天、春天、冬天庫房環境溫度下進行生料密封發酵，對應發酵溫度和取樣時間分別為：夏天25~35℃，發酵7天，每天取樣1次；春天15~25℃，發酵14天，每2天取樣1次；冬天5~15℃，發酵21天，每3天取樣1次。同樣測定各取樣樣品的總菌含量和pH，分析不同環境溫度對發酵效果的影響。

　　1.2.3 發酵過程菌株生長、營養成分變化分析

　　在配方1（常規飼料）、選定的最優發酵物料含水量，夏天25~35℃庫房環境溫度下，發酵8天，定時取樣，測定各取樣時間的乳酸菌、酵母菌等微生物含量和主要生成物乳酸的含量，并對發酵過程中pH、水分、纖維、能量、蛋白、氨基酸、維生素、異硫氰酸酯等指標的變化進行分析，試驗重復3次，取平均值。樣品取樣除乳酸菌、蛋白濃度、維生素含量等需原樣外，其余樣品均是原樣70~75℃干燥粉碎后過100目篩待用。

　　1.2.4 各指標測定分析方法

　　各微生物及總菌數含量：平板菌落計法；pH：梅特勒FE.20pH計測定；水分：105℃烘箱干燥，GB/T6435-2006；能量：KT-R4300全自動量熱儀測定，ISO9831：1988；纖維：ANKOM220纖維分析儀測定，GB/T6434-2006；粗蛋白測定：Tecator1035全自動定氮儀測定，GB/T6432-1994；異硫氰酸酯：氣相色譜法，GB/T13087-91；維生素、氨基酸測定采用島津LC-20AHPLC檢測；乳酸：乳酸脫氫酶法，試劑盒購買于南京某公司。

　　02　結果與分析

　　2.1 發酵物料組成對發酵效果的影響結果

　　不同發酵物料組成對發酵效果的影響結果見圖1所示，在3個不同配方中，菌株生長曲線和pH變化基本一致。發酵開始時，菌株大量生長，主要發酵菌株乳酸菌分泌乳酸，pH下降；發酵120~132h左右以后，發酵趨于成熟，大量的乳酸產生抑制了菌株的生長，發酵菌株部分死亡、裂解，數量有所下降。高糖分的配方2其菌株的生長速度要明顯高于其余2組，其玉米漿所含的高糖分給菌株的生長提供了大量的能量。高蛋白的配方3其菌株的生長速度明顯小于其余2組，表明隨著蛋白含量的增加，微生物生長速率下降。但實際畜禽飼養中，畜禽的生長不僅需要足夠量的活菌，同時一定濃度的蛋白也是必須的，綜合考慮，配方1中蛋白含量和糖分含量適中，更有益于發酵菌株生長和滿足畜禽生長的蛋白需求。

　　2.2 發酵物料含水量、溫度對發酵效果的影響結果

　　不同發酵物料含水量、溫度對發酵效果的影響結果見圖2~5所示，結果表明：物料的含水量越高，菌株生長越快，發酵效果越好，但在實踐操作中，水分含量越高，其包裝、運輸、保持等操作成本越高，市場的接受度也越小。圖2結果顯示當含水量在32%~40%時，其總菌數含量差別不大，因此，綜合考慮選定34%~36%為最適含水量，既能保證菌株快速生長，又能適當的降低生產操作成本。

　　圖3~5結果顯示，溫度對發酵菌株的生長有著重要的影響，溫度越高，菌株生長越快，其發酵成熟所需時間越段。在最優發酵條件下，夏天發酵5天，春天發酵12天，冬天發酵18天，發酵菌株的總菌數達到平衡為2.20×109個/g，物料pH4.0~4.1。

　　2.3 發酵過程菌株生長及乳酸生成的變化分析

　　發酵8天，其菌株生長及乳酸生成的變化如圖6~7所示，發酵菌株由乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌組成，但各菌株的生長時間、速度不同。在密閉袋裝發酵過程中，發酵前36h，發酵袋中所含殘留氧供酵母菌和枯草芽孢桿菌生長，大量繁殖，乳酸菌基本不生長，乳酸生成量很少。發酵96h，發酵袋內氧氣逐漸耗盡，酵母菌和枯草芽孢桿菌基本不再生長，數量達到頂峰，分別為5.14×107、4.05×108個/g。厭氧環境條件下，乳酸菌開始大量生長，開始大量產生乳酸。發酵144h，發酵趨于成熟，乳酸菌生長達到頂峰1.86×109個/g，乳酸含量最高達到0.89%。隨后隨著乳酸的大量產生，乳酸菌、芽孢桿菌不再適合生長，部分菌株開始裂解，總菌數下降。圖6中總菌數的變化曲線與乳酸菌的變化曲線一致，表明發酵過程主要以乳酸菌為主，酵母菌和枯草芽孢桿菌的生長為乳酸菌提供了厭氧環境。

　　2.4發酵過程營養變化分析

　　發酵過程中能量、水分、異硫氰酸酯的變化分析如圖8~9所示，隨著發酵時間的延長，物料的總能、纖維、異硫氰酸酯含量緩慢減少，水分和蛋白含量略有增加。原因可能是酵母菌進行厭氧發酵，產生CO2和乙醇，CO2能從氣孔溢出，物料總重量降低，水分、蛋白含量相對增加，物料總能相對下降；纖維、異硫氰酸酯含量降低可能是發酵菌株中產生相應的酶降解所致。發酵飼料中水分、蛋白含量增加，乙醇的生成，纖維、異硫氰酸酯含量的降低對于減少畜禽飼喂致害、提高適口性具有一定的益處。

　　發酵過程中維生素的變化分析如圖10示，發酵飼料中各維生素含量的高低順序為：VB>VE>VK>VA>VD，不同的發酵時間，各維生素含量基本保持穩定，到達降解和合成的相對平衡。

　　發酵過程中，各氨基酸含量也基本不變，僅4種氨基酸發生了較明顯的變化，如圖11所示，谷氨酸、脯氨酸的含量緩慢下降，甘氨酸、苯丙氨酸的含量緩慢增加，表明畜禽生長必需氨基酸含量增加，發酵飼料中氨基酸組成在向優質化方向轉化。

　　03　結論

　　本研究對發酵飼料生產中的關鍵因素水分、溫度、能量和蛋白等進行了優化研究，并對發酵過程中各營養成分的變化進行測定分析，結果表明：高糖分、低蛋白的飼料配方、34%~36%含水量、較高的發酵溫度更有利于菌株生產和實際生產需求。酵母菌和枯草芽孢桿菌發酵先行開始，其大量生長為乳酸菌提供了厭氧環境，隨著時間的延長，發酵144h后，各菌株生長達到頂峰。發酵過程中，乳酸、乙醇等物質生成，水分、蛋白含量增加，纖維、異硫氰酸酯含量降低，維生素含量動態穩定，氨基酸優質轉變。因此，發酵飼料有利于提高畜禽飼養的腸道平衡、適口性和安全性。

　　04　討論

　　目前，國內外對微生物發酵飼料在畜禽飼養中的應用和理論研究較多，也取得了一定的成果，但對發酵飼料眾多代謝產物的有效成分缺乏較深入的研究，同時發酵飼料由于原材料、發酵菌株、保存等問題引發的產品穩定性問題還亟待進一步解決。因此，筆者對發酵生產的關鍵因素、發酵過程各菌株生長變化，發酵過程各營養成分變化情況的深入分析是十分必要的，對降低生產成本、滿足不同生長階段畜禽生長的產品細分和特異性營養需求，對將來完善發酵飼料品質鑒定、建立行業標準、促進微生物發發酵飼料的進一步研究發展均有著重要的參考依據。此外，發酵菌株的來源、種類、作用機理對發酵飼料的適應動物種類、添加劑量的選擇十分重要。筆者對各發酵菌株之間的協同作用機理進行了探討，對各菌株生長順序、相互作用進行了相關分析，但對其穩定性、耐受性、拮抗性、有益菌株變異性及發酵菌株在畜禽中的腸道定植部位、機理還需進一步的深入研究，也是發酵飼料尚未解決和將來探索的重要方向。


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　　責編：馬維軍；審閱：陳達博士
　　來源：中國農學通報；生物飼料工程研究中心 作者：林標聲,羅建,李益明,楊小燕


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