陸文清：以純麥麩為底物檢測(cè)飼料用非淀粉多糖酶效價(jià)的方法【完整版】

畜牧人小李

農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)中心  陸文清 副研究員

陸文清 ，1997 年畢業(yè)于無(wú)錫輕工大學(xué)生物工程學(xué)院，獲博士學(xué)位。1998~2000 任遼寧省飼料研究所所長(zhǎng)助理，2000~2002 在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)做博士后研究，現(xiàn)任農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)中心副研究員。多年來(lái)，一直從事微生物發(fā)酵技術(shù)在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用研究。作為技術(shù)負(fù)責(zé)人，主持了可移動(dòng)式微生物厭氧發(fā)酵飼料的研究和推廣工作，目前該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)在國(guó)內(nèi) 30 多家飼料生產(chǎn)企業(yè)推廣應(yīng)用，為生豬的健康養(yǎng)殖提供了很好的技術(shù)支持。

第1則

前言

飼料用非淀粉多糖酶是目前飼料工業(yè)中應(yīng)用最廣的飼料酶，主要包括木聚糖酶、纖維素酶、葡聚糖酶、果膠酶和甘露聚糖酶，它們少部分以單體酶形式使用，大部分以復(fù)合酶形式使用。在我國(guó)，非淀粉多糖酶占飼料酶市場(chǎng)總量的 65% 左右。在歐洲和北美，非淀粉多糖酶占飼料酶市場(chǎng)總量的 70% 左右。

對(duì)于非淀粉多糖酶的分析測(cè)定，無(wú)論是單體酶還是復(fù)合酶，都很繁瑣，而且分析數(shù)據(jù)的實(shí)用性和重復(fù)性也不理想。目前，實(shí)驗(yàn)室的分析底物都是純度比較高而且易溶于水的聚合物，但是它們實(shí)際的天然底物都是不溶于水的聚合物，而且這些聚合物往往相互交聯(lián)在一起，組成成分也比較復(fù)雜。非淀粉多糖酶對(duì)天然底物的降解效率很差，往往只有可溶性底物的 5%~10% 左右，而且很難準(zhǔn)確定量。動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)雖然直觀，可靠性也比較好，但是試驗(yàn)周期太長(zhǎng)（至少需要 2 個(gè)月），成本也很高，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中很難推廣，與科研過(guò)程中要求的快速分析相差甚遠(yuǎn)。

本文提供的快速檢驗(yàn)飼料用非淀粉多糖酶效價(jià)的方法，以消除淀粉的麥麩為分析底物，在設(shè)定的溫度和溶液中加入需要分析的飼料用非淀粉多糖酶。這種飼料酶可以是單體酶，也可以是復(fù)合酶。經(jīng)過(guò)設(shè)定的反應(yīng)時(shí)間以后，經(jīng)過(guò)濾洗滌、干燥，測(cè)定殘留底物的干重，計(jì)算降解效率，以此作為評(píng)價(jià)比較所分析酶效價(jià)的主要指標(biāo)。這種試驗(yàn)方法不僅可以快速檢測(cè)單酶在實(shí)驗(yàn)室配制緩沖液中的效價(jià)，也可以快速檢測(cè)復(fù)合酶在實(shí)驗(yàn)室配制的緩沖液中的效價(jià)。不僅可以快速檢測(cè)單酶在動(dòng)物消化液中的效價(jià)，也可以快速檢測(cè)復(fù)合酶在動(dòng)物消化液中的效價(jià)。

第2則

無(wú)淀粉麥麩的制備

1、原麥麩預(yù)處理

麥麩是一種很典型的非淀粉多糖復(fù)合物和理想的試驗(yàn)用底物。但是常規(guī)的飼料用麥麩中含有大量的淀粉殘余物不僅會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，而且還有黏性，對(duì)測(cè)定過(guò)程中涉及的分離、過(guò)濾、干燥等操作都有很不利的影響。為了確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，需要消除麥麩中的殘留淀粉，獲得比較純凈的非淀粉多糖復(fù)合物。

稱取 10kg 普通商品麥麩，用 60kg 清水在常溫（20~30℃）浸泡 24h，清洗其中的泥渣和其他可溶性雜物，撇除漂浮的皮殼和麥秸等粗纖維。用清水反復(fù)清洗3 次，然后再過(guò)濾、擠壓，獲得潔凈的麥麩，其含水量為 65%，總重量為 25kg。將所得麥麩分批平攤在托盤上，挑除其中未破碎的麥粒。這部分未破碎的麥粒雖然很少，但是對(duì)后期試驗(yàn)結(jié)果的精度有影響，所以必須剔除。

2、酶解麥麩殘余淀粉

在容量為 100L 的不銹鋼容器中，加入上述獲得的清潔麥麩，再加入 45kg 蒸餾水，然后通蒸汽加熱升溫至 98℃，保持 12min，充分糊化麥麩中殘留的淀粉。然后冷卻至 65℃，加入 10gα- 淀粉酶（酶活為 4 000u/g），保持 30min。然后逐步加熱至 95℃，再加入 20g 糖化酶（酶活為 80 000u/g），保溫 60min，以充分糖化殘留的淀粉使其成為溶解于水的葡糖糖和麥芽糖。自然冷卻至室溫，過(guò)濾，擠壓，獲得濾渣，再用蒸餾水清洗濾渣 3 次，以充分濾除殘留的葡萄糖和麥芽糖，獲得純凈的麥麩，其含水量為 65%，重量為 22kg。

3、氣流干燥純麥麩

把含水量為 65% 的麥麩分批平攤在托盤上進(jìn)行常溫氣流干燥，24h 以后基本達(dá)到恒重，得到純麥麩 7.6kg，含水量為 8.0%，殘余淀粉含量不超過(guò) 0.01%，分裝在密封在容器中，于 4℃冰箱中保存。

第3則

酶活效價(jià)的測(cè)定

1、純緩沖液中酶活的效價(jià)測(cè)定

取 12 個(gè) 500mL 的三角瓶，在每個(gè)三角瓶中加入 250mL 緩沖液（pH 為 5.5，在 5 000mL 蒸餾水中加入 4.5mL 冰醋酸和34.85g 無(wú)水醋酸鈉，徹底溶解，醋酸根離子的濃度為 0.1mol/L），接著再各加入 10g 制備所得的純麥麩，在 37℃恒溫放置在水浴中，然后在這 12 個(gè)三角瓶中加入等量的待分析飼料酶 A。每隔 30min抽取 1 個(gè)三角瓶，用 8 層醫(yī)用紗布進(jìn)行過(guò)濾，時(shí)間不超過(guò) 2min。過(guò)濾結(jié)束后，用 250mL 蒸餾水清洗，3 次過(guò)后取過(guò)濾渣，平攤在不銹鋼托盤上，80℃氣流干燥8h 至恒重，再常溫冷卻 2h，然后稱重，根據(jù)所得降解效率評(píng)價(jià)飼料酶 A 的效價(jià)，測(cè)定結(jié)果參見(jiàn)圖 1。

麥麩的降解率：被降解的麥麩與起始麥麩的重量之比。

隨著浸泡酶解時(shí)間的增加，純麥麩中干物質(zhì)的降解率也在增加，但是降解速度在不斷減弱。經(jīng)過(guò) 6h 的酶解，純麥麩干物質(zhì)的降解率達(dá)到 14.2%。

2、豬胃液中酶活的效價(jià)測(cè)定

取 3 個(gè)飼料用非淀粉多糖酶樣品，分別標(biāo)記為：A、B 和 C。采用純麥麩降解法比較效價(jià)。

在屠宰場(chǎng)收集 10 個(gè)豬胃（生豬的體重在95~130kg 之間），取它們的內(nèi)容物，混合均勻。然后用紗布過(guò)濾，獲得過(guò)濾液。

取3個(gè)500mL的三角瓶，分別放入A、B和C飼料用非淀粉多糖酶樣品各0.1g，再分別加入 250mL 豬胃過(guò)濾液，在 37℃恒溫水浴 2min，使酶蛋白充分溶解。然后同時(shí)加入 10g 純麥麩（制備參見(jiàn)上述方法）。60min 以后，同時(shí)進(jìn)行過(guò)濾，洗滌。取過(guò)濾渣，在常溫下氣流干燥 12h 至恒重，比較干重，按照如下公式計(jì)算得到降解效率，根據(jù)所得降解效率評(píng)價(jià)標(biāo)記分別為 A、B 和 C 的 3 個(gè)非淀粉多糖酶樣品的效價(jià)所得結(jié)果參見(jiàn)表 1。

由表1可知，在上述3種非淀粉多糖酶中，C酶的功效最顯著。在測(cè)定過(guò)程中，不需要進(jìn)行復(fù)雜的酶學(xué)分析就可以獲得直觀的對(duì)比結(jié)果。而且上述方法已經(jīng)綜合了胃液中多種成分對(duì)酶蛋白活性的影響。

3、豬腸液中酶活的效價(jià)測(cè)定

待分析樣品為非淀粉多糖酶 X、Y 和 Z，均為粉狀。

在屠宰場(chǎng)收集 10 副豬小腸（生豬的體重在 95~130kg 之間），取其內(nèi)容物，混合均勻。用紗布包埋過(guò)濾、擠壓，獲得 3L 過(guò)濾液。把過(guò)濾液存放在 1 個(gè)大玻璃瓶中，在 4℃冰箱中存放 24h，取上清液作為飼料酶的溶劑。取 3 個(gè) 500mL 的三角瓶，分別加入 X、Y 和 Z  3 種飼料酶樣品各 0.1g。再分別加入 250mL 豬小腸上清液，在 37℃水浴保溫 5min，使酶蛋白充分溶解。

然后依次在 X、Y 和 Z  3 個(gè)酶樣溶液中分別加入 10g 純麥麩，在 37℃水浴保溫60min。

同時(shí)準(zhǔn)備 3 個(gè)平行漏斗，配置同樣的紗布（重量、層數(shù)和疊放方式都一致）。水浴保溫結(jié)束以后，依次取出 X、Y 和 Z  3 個(gè)處理液（酶解時(shí)間間隔盡可能與加入麥麩的時(shí)間間隔一致），分別進(jìn)行過(guò)濾、洗滌（重復(fù) 3 次，用蒸餾水）、擠壓和氣流干燥（所有的操作方式都一致）。最后，對(duì)獲得的干燥物進(jìn)行稱量，按照如下公式計(jì)算得到降解效率，根據(jù)所得降解效率評(píng)價(jià)標(biāo)記分別為 X、Y 和 Z 的 3個(gè)飼料酶樣品的效價(jià)。所得結(jié)果參見(jiàn)表 2。

由表 2 可知，比較上述 3 種非淀粉多糖酶，在豬腸液中，樣品酶 Y 的降解效果最好。

第4則

結(jié)論

該方法直觀、簡(jiǎn)便，不需要很精密的分析儀器，而且能同時(shí)檢驗(yàn)動(dòng)物消化道的環(huán)境對(duì)酶蛋白作用效果的影響，從而能更客觀全面地反映這些飼料酶的實(shí)際效價(jià)。飼料生產(chǎn)企業(yè)和養(yǎng)殖戶可以參照上述方法對(duì)非淀粉多糖酶的效價(jià)進(jìn)行分析和比較，適用于飼料用非淀粉多糖酶的研究、生產(chǎn)和應(yīng)用，特別適用于畜禽和水產(chǎn)飼料中非淀粉多糖酶效價(jià)的快速檢測(cè)。

原創(chuàng)： 陸文清     來(lái)源：康普利德