8 種植物精油對腸道常見微生物體外抑菌效果的研究

畜牧人小李

近幾年來，細菌耐藥性的問題已引起了世界各國的廣泛關注，抗生素的不合理應用甚至濫用是造成細菌耐藥的重要因素之一[1,2]。抗生素的濫用主要表現在臨床用藥、病患者以及畜牧業使用不合理等 3 個方面，在畜牧業中濫用的問題尤為嚴重，正威脅著人類的健康[3,4]。2015 年我國史上最嚴《食品安全法》和 2016年“禁抗令”的出臺，預示著尋找開發新型、綠色、安全、高效的抗生素替代品已成大勢所趨。

植物精油是一類植物體內的次級代謝物質，是世界公認安全性的物質。許多研究證實，植物精油憑借自身具有抗菌消炎、抗氧化、延緩衰老等多種生物活性，已被廣泛應用于醫療保健、食品工業和日化產品等領域中[5]。牛至油因其天然、無殘留、抗菌及不容易產生抗藥性等特點，已被我國農業部批準作為一種可長期添加的藥物飼料添加劑[6]，從而說明天然植物提取物作為抗生素替代品是一種具有較大潛力的方向。腸道菌群是一個由益生菌、條件致病菌和病原菌組成的復雜微生態系統，其微生物種類超過 1000 種。

其中益生菌主要有乳桿菌和雙歧桿菌等，大腸埃希氏菌屬是腸道最為常見的引起腹瀉的致病菌，腸道的病原菌還包括通過食用外界霉變的食物而進入腸道的霉菌，其中常見的有黃曲霉。抗生素主要作為抗菌素使用，對致病微生物有著良好的抑制和殺滅作用，適量的使用在腸道體內起到的主要作用是調節腸道菌群[7]。然而眾多資料顯示，根據植物精油的抑菌機理可知其對任何微生物都會起到抑制作用，但是不同活性成分的植物精油對微生物的抑制強度都不一樣[8]。因此，通過植物精油間協同增效可能有助于尋找出在抑制致病菌生長的同時對益生菌生長沒有顯著影響的復配植物精油，從而能達到抗生素調節腸道內菌群平衡作用。

國內外一直致力于植物精油對致病菌抑菌活性的研究，事實證明植物精油有著無法比擬的天然抑菌功效，但是植物精油對益生菌生長影響的研究尚未見報道[9]。所以本文研究了不同活性成分的植物精油對常見腸道微生物的抑菌效果，通過植物精油間協同增效效應進行復配，以篩選出抑制腸道致病菌生長的同時對腸道有益菌生長沒有顯著影響的復配精油，并分析其化學組成成分，為開發新型綠色、安全、高效的抗生素替代品提供理論依據。

1、材料與方法

1.1、材料試驗
菌種：腸產毒性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC) (K88ac 菌株)，廣州美瑞泰科生物工程技術有限公司惠贈；腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhage Escherichia coli ， EHEC)ATCC35150(O157：H7)、致瀉性大腸桿菌(Enteropathogenic Escherichia coli，EPEC)CICC 10411(O127：K63)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC 4356、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium Bifidum)ATCC 29521、黃曲霉(Aspergillus flavus)ATCC 9643、藥敏質控菌株大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC 25922 均由廣東省微生物研究所提供。

植物精油(肉桂油、牛至油、百里香油、茶樹油、桉葉油、薄荷油、迷迭香油和茴香油)：廣東香飄三創（產學研）眾創平臺提供。

抗生素藥敏片(四環素、阿莫西林、多粘菌素 B、卡那霉素和恩諾沙星)：杭州微生物試劑有限公司。

厭氧培養袋、厭氧產氣袋、氧氣指示劑：日本三菱瓦斯化學株式會社（INC）。

M-H 瓊脂培養基、M-H 液體培養基、營養瓊脂培養基、營養肉湯、孟加拉紅培養基、霉菌液體培養基、MRS 瓊脂培養基、MRS 液體培養基、BBL 瓊脂培養基和 BBL 液體培養基：廣東環凱微生物科技有限公司。

無水乙醇，為分析純。

1.2、儀器與設備
YX-280D MODE 不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋：合肥華泰醫療設備有限公司；DHG-9140 電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-2F超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；SPX-250生化培養箱：上海銳豐儀器儀表有限公司；SHA-BA恒溫振蕩器：常州澳華儀器有限公司；GCMS-QP2010Plus 氣相色譜-質譜聯用儀：日本島津公司。

1.3、實驗方法
1.3.1、菌懸液的制備
大腸桿菌屬菌懸液的制備：先在平板上劃線活化菌種，置于 37 ℃培養箱有氧培養 24 h 后，從平板上挑取單個菌落，采用麥氏比濁法制成 0.5 麥氏單位的菌懸液（1.5×108CFU/mL），用無菌水倍比稀釋到所需濃度的菌懸液（105~106CFU/mL），備用。

乳酸菌屬菌懸液的制備：先在平板上劃線活化菌種，與厭氧產氣袋和氧氣指示劑一并放入厭氧培養袋中，然后鎖緊厭氧培養袋并觀察氧氣指示劑的顏色由藍色變成粉紅色后，再置于 37 ℃培養箱厭氧培養 48h，從平板上挑取單個菌落，采用麥氏比濁法制成 0.5麥氏單位的菌懸液（1.5×108CFU/mL），用無菌水倍比稀釋到所需濃度的菌懸液（105~106CFU/mL），整個操作需要在 20 min 內完成，備用。

霉菌孢子懸液的制備[19]：先在平板上劃線活化菌種，置于 28 ℃培養箱培養 5~7 d，待長出孢子后用無菌水進行洗脫，并置于 196 r/min、28 ℃恒溫振蕩器中進行 30 min 充分震蕩，然后使用血球計數板進行計數，最后將孢子懸液稀釋為 105~106CFU/mL，保存在4 ℃冰箱中不超過 7 d，備用。

1.3.2、抑菌圈的測定
通過測定植物精油和抗生素對供試菌的抑菌圈來分析抗菌敏感性。先將高壓滅菌的瓊脂培養基（大腸桿菌屬用 M-H 瓊脂培養基、黃曲霉用孟加拉瓊脂培養基、嗜酸乳桿菌用 MRS 瓊脂培養基、兩歧雙歧桿菌用 BBL 瓊脂培養基）的溫度降至 45 ℃左右，在干燥滅菌的直徑 9 cm 培養皿內加入 15 mL 培養基，待冷卻凝固后，再吸取 100 μL 的菌懸液，并用無菌涂布棒均勻涂布于相對應瓊脂平皿，備用。

抗生素組：采用 WHO 推薦的 K-B 瓊脂擴散紙片法[10]。用無菌鑷子夾取不同抗生素藥敏紙片（d=5 mm）貼在含菌平皿上，呈正三角形放置 3 片在瓊脂平板中央周圍，其中 2 片為抗生素藥敏片和 1 片為等大小的已滅菌濾紙做空白對照，每個紙片輕輕壓一下以保證與瓊脂表面完全接觸(放置時切勿拖動)；植物精油組：采用瓊脂孔注入法[11]。用無菌金屬打孔器（d=5 mm）在含菌平板上等距離地打三個小孔，用無菌鑷子剔去孔內瓊脂，吸取 10 μL 不同的純植物精油加入其中兩個孔內，并用等量的無菌水加入第三個孔內做空白對照；將平皿蓋上后平置于恒溫培養箱中培養(大腸桿菌屬 37 ℃有氧培養 24 h，乳酸菌屬 37 ℃厭氧培養 48h，霉菌 28 ℃有氧培養 72 h)。以十字交叉法測量抑菌圈直徑，每個處理設 3 次重復，取其平均直徑。

1.3.3、最低抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定
采用直接接觸法。在 5 mL 相應的液體培養基中加入 100 μL 菌懸液，將供試精油用無水乙醇稀釋配制成 10%精油溶液，然后分別吸取不同量的 10%精油溶液加入裝有等量液體培養基的試管中，使精油濃度為31.25 μL/L~3000 μL/L，且用無水乙醇做空白對照，置于 196 r/min 恒溫振蕩器中進行培養，觀察生長情況。

然后取 0.2 mL 培養液于相應的平板中進行涂布，倒放置于培養箱中培養(大腸桿菌屬 37 ℃有氧培養 24 h，乳酸菌屬 37 ℃厭氧培養 48 h，霉菌 28 ℃有氧培養 72h)，觀察生長情況。若不長菌的最小精油濃度為該精油的最小抑菌濃度（MIC），繼續培養 3 d 以上，若仍不長菌的即為最低精油濃度為最小殺菌濃度（MBC）。

其中每個處理設 3 次重復，本實驗中精油濃度 3000μL/L 仍不能抑制細菌視為該精油對其沒有作用。

1.3.4、復配植物精油聯合抑菌效果的測定
根據單一植物精油的抑菌圈和最低抑菌濃度(MIC)的測定結果，選取對腸道菌抑菌效果明顯的植物精油進行聯合抑菌實驗。植物精油的復配實驗采用棋盤稀釋法[12]，同時加入等量對應的單一植物精油作為對照。觀察培養液倒平板后菌株的生長情況，記錄復配精油的最小抑菌濃度(MIC)，實驗重復 3 次。以分級抑菌濃度指數(FICI)作為聯合抗菌試驗效果的判定依據[12]，FICI 的計算公式如下所示。

B MIC B MIC A MIC A MIC FICI FICA FICB 單用時的聯合時的單用時的聯合時的= + = +FIC 指數的判斷標準為：FIC<0.5 時為協同作用（S）；0.5≤FIC≤1 為相加作用（A）；1<FIC<4 為無關作用（I）；FIC≥4 時為拮抗作用（AN）。

1.3.5、植物精油有效成分分析
氣相色譜儀條件：DB-MS 毛細管色譜柱(30m×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為氦氣，進樣口溫度250 ℃，分流比 50:1，流速 1 mL/min，進樣量 1 μL。

(牛至油)升溫程序：初始柱溫 60 ℃，保持 3 min，以 5 ℃/min 升溫速率升至 300 ℃，保持 5 min。

(肉桂油)升溫程序：初始柱溫 100 ℃，以 4 ℃/min升溫速率升至 150 ℃，保持 3 min，再以 5 ℃/min 升溫速率升至 280 ℃，保持 5 min。

質譜儀條件：EI 電離源，電子轟擊能量 70 eV，離子源溫度 230 ℃，四級桿溫度為 150 ℃，質譜接口溫度為 250 ℃，掃描范圍 m/z 為 25~450 u。

根據總離子流圖分離出來的各組分，利用WILEY275 譜庫和 NBS75K 標準質譜庫檢索，查閱質譜手冊并根據相關文獻進行化學成分鑒定，采用峰面積歸一化法算出植物精油各種組分的相對含量。

1.3.6、數據統計分析
每個實驗分別進行三次平行，并且數據以平均值（mean）±標準差（sd）表示，方差分析（ANOVA）是用于兩個及以上樣本均數差異的顯著性檢驗，p≤0.05 時說明具有統計學的意義。

2、結果與討論

2.1、植物精油抑菌活性的測定
不同活性成分的植物精油和抗生素對腸道微生物的體外抑菌效果測定結果見表 1 和表 2。按照美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）頒布的《抗微生物藥物敏感性試驗執行標準》判斷對藥物的敏感性，抑菌圈試驗的判定標準為：抑菌圈直徑>20 mm 為最敏感，10 mm~20 mm 為中度敏感，5 mm~10 mm 為低度敏感，無抑制作用者（≤5 mm）為不敏感[13]。就抗生素組總體上看，恩諾沙星對 4 種大腸桿菌和兩歧雙歧桿菌的抑菌圈直徑均>20 mm，屬于最敏感；卡那霉素對各種類大腸桿菌的抑菌圈>20 mm，屬于最敏感，對兩歧雙歧桿菌是中度敏感；多粘菌素 B和四環素對各種類大腸桿菌都為中度敏感，但對兩歧雙歧桿菌的抑菌圈直徑均>20 mm，屬于最敏感；阿莫西林對各種類大腸桿菌和兩歧雙歧桿菌抑菌直徑均在10 mm~20 mm 之間，屬于中度敏感。綜合比較來看，若要篩選出具有抑制腸道致病菌生長的同時對腸道益生菌的生長沒有顯著影響效果的抗生素，那就是卡那霉素的效果最為明顯。

就植物精油組總體上看，肉桂油、牛至油和百里香油無論是對腸道致病菌還是益生菌，都表現出較強的的抑制作用；桉葉油對大腸桿菌、腸產毒性大腸桿菌和兩歧雙歧桿菌的抑菌效果都表現為最敏感，茶樹油對兩歧雙歧桿菌表現出較強的抑制作用，抑菌圈直徑達到 34.0±2.6 mm，屬于最敏感，而對黃曲霉和嗜酸乳桿菌僅表現出低度敏感；薄荷油對兩歧雙歧桿菌的抑菌圈直徑>20 mm，屬于最敏感，對其他 6 種供試菌均為中度敏感，迷迭香油對腸產毒性大腸桿菌的抑制效果較強，對大腸桿菌和兩歧雙歧桿菌的抑菌作用表現為中度敏感，對其他兩種菌的抑制作用不明顯；茴香油只有對兩歧雙歧桿菌表現出中度敏感，對其他菌種都是低度敏感。綜合來看，上表中的植物精油要么對所有的試驗菌同時起較強或較弱抑制作用，要么只對特定菌種上表現出較強的抑菌作用；沒有一種精油對腸道致病菌起較強抑制作用同時，對腸道益生菌生長沒有明顯的影響，這與 Joris 等[14]研究結果相同。

綜合比較來看，就腸道致病菌的抑制效果而言，抗生素和植物精油都具有對各種類大腸桿菌腸桿菌較強的抑菌效果，但植物精油比抗生素多具有對黃曲霉更強的抑菌效果，表明植物精油具有有效減少誤食黃曲霉食品對腸道產生危害的潛能；抗生素的抑菌圈直徑值的標準偏差均比植物精油的小，結果產生的差異可能是由兩者自身的性質決定的，抗生素是水溶性且不揮發，而植物精油具有揮發性的同時不是水溶性的，所以抗生素得出的抑菌圈直徑結果比植物精油的較為穩定。

2.2、植物精油最低抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)
為了解選用的不同活性成分的植物精油對腸道常見微生物的抗菌效果，通過直接接觸法測定各植物精油的最低抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)研究其抑菌效果。其中最小抑菌濃度（MIC）為減少 90%微生物菌落的最低精油濃度，而最小殺菌濃度（MBC）為殺死 99.9%微生物菌落的最低精油濃度。八種植物精油對致病菌和益生菌的MIC 和MBC 的測定結果分 別見表 2 和表 3 所示。由表 2 和 3 可知，八種植物精油對 7 種供試菌種的生長都有不同程度的抑制作用，其中抑菌效果較好的是肉桂油、牛至油和百里香油，對 5 種致病菌的MIC 值均≤500 μL/L，對2種益生菌的 MIC 值均≤700μL/L；這三種植物精油都表現出了廣譜抑菌性，在對腸道致病菌有較強抑制作用的同時對腸道益生菌也有著較強的抑制作用，而相對于牛至油和百里香油，肉桂油對黃曲霉和兩歧雙歧桿菌的抑菌效果較為明顯，分別為 125 μL/L 和 500 μL/L，其次是牛至油和百里香油；肉桂油對大腸桿菌和嗜酸乳桿菌的 MBC 值均比牛至油和百里香油的低，分別為250 μL/L和700 μL/L，但其對黃曲霉和兩歧雙歧桿菌的 MBC 值與牛至油的一樣，均分別為 500 μL/L 和 700 μL/L。另外，桉葉油與茶樹油相比，桉葉油對腸道致病菌的抑制強度比茶樹油強，但是對腸道益生菌的抑制效果不如茶樹油；薄荷油對 5 種致病菌的抗菌效果比迷迭香油的抗菌效果好些，特別是對大腸桿菌和腸產毒性大腸埃希氏菌的 MIC 值均為 700 μL/L，但對 2種益生菌的抑菌效果而言，兩者卻沒有明顯的差異；茴香油對大腸桿菌和黃曲霉的 MIC 值能與肉桂油、牛至油和百里香油等媲美，但是其 MBC 值都較高，與肉桂、牛至和百里香等精油的殺菌效果存在著較大的差距。

植物精油的 MIC 值和 MBC 值越低，其抑菌效果就越強。八種植物精油對腸道致病菌抗菌能力大小依次為：肉桂>牛至>百里香>茴香>薄荷>桉葉、茶樹>迷迭香；對腸道益生菌抗菌能力大小依次為：肉桂、牛至>百里香>茴香>茶樹>迷迭香>薄荷>桉葉。

2.3、植物精油聯合抑菌效果的測定
根據抑菌圈直徑以及 MIC 值的測定結果，采用棋盤稀釋法對腸道致病菌抑菌效果顯著的植物精油（肉桂油、牛至油和百里香油）進行聯合抑菌活性研究，并以 FICI 值進行效果評價。植物精油聯合抑菌效果見表 4 所示。

由表 4 可知，從整體來看，肉桂油-牛至油復配組合的效果更好，對 5 種腸道致病菌都具有相加作用，FICI 值均≤1，而對腸道益生菌的相加作用不如對致病菌的強；肉桂油-百里香油復配組合對產腸毒素大腸桿菌顯示出了協同作用，FICI 值為 0.5，對腸出血性大腸桿菌為無關作用，對大腸桿菌、致瀉性大腸桿菌、黃曲霉和嗜酸乳桿菌都表現出相加作用，FICI 值均≤l；牛至油-百里香油復配組合除了對大腸桿菌和兩歧雙歧桿菌的殺菌率達不到 99.9%外，對其余供試菌表現出相加作用（FICI 值均≤l）。2.4 肉桂精油和牛至精油抗菌成分分析2.4.1 肉桂精油的 GC/MS 分析用氣相色譜-質譜聯用儀對肉桂精油進行分析，得到總離子流圖共顯示 47 個峰，如圖 1，利用標準質譜庫檢索，結合查閱質譜手冊并根據相關文獻核對鑒定，針對主要色譜峰加以確認，共鑒定出 41 種化合物，其含量占色譜總流出峰相對百分含量的91.05%，見表5。

由氣質聯用分析結果（見表 5）可知，從肉桂精油中共分離鑒定出 41 種揮發性化合物，在已鑒定出的化合物中，含量最高的是肉桂醛，相對含量為 52.17%。

肉桂具有抗菌功效與其含有較高含量的肉桂醛有關[10]，除了肉桂醛(52.17%)外，相對含量較高的成分還有鄰甲氧基肉桂醛(15.18%)、香豆素(2.83%)、對傘花烴(2.00%)、苯甲酸香葉酯(1.92%)、γ-松油烯(1.69%)、苯丙醛(1.69%)、異丁香烯(1.15%)、α-蒎烯(1.11%)，從表 6 可以看出，從牛至精油中共分離鑒定出 25種揮發性化合物，包括 2 種酚(53.62%)、14 種烯(28.01%)、2 種烴(8.56%)、2 種醇(6.46%)、2 種酮(0.66%)、1 種醚(0.58%)和 1 種酸(0.13%)。其中相對含量較高的化學成分有香芹酚(51.73%)、間-異丙基苯(8.50%)、γ-松油烯(7.66%)、β-松油醇(6.26%)、α-蒎烯(3.97%)、β-月桂烯(3.95%)、石竹烯(3.81%)、氧化石竹烯(2.38%)、異松油烯(1.93%)以及麝香草酚(1.89%)，共占總化學成分含量的 92.08%。

由表 5 和表 6 可見，不同植物源的揮發油根據其主要活性成分的不同，會表現出不同的抑菌活性，肉桂油和牛至油的主要化學成分分別為醛類和酚類化合物。大量研究結果表明，肉桂醛和香芹酚是醛類和酚類揮發油中抑菌作用最強的活性成分[16]。經 GC-MS分析鑒定的肉桂油主要成分是肉桂醛(52.17%)，牛至油主要成分是香芹酚(51.73%)。根據目前已有報道可知，肉桂醛抑菌殺菌的作用機理可能主要是醛基是一個親水基團，易被細菌或真菌表面的親水基吸附而穿入細胞壁，從而破壞細菌或真菌的細胞壁多糖結構發揮其抑菌殺菌的效果；香芹酚可以通過擠壓開磷脂的脂肪酸鏈，增加細胞膜流動性和通透性，從而讓細胞質中的離子流出細胞外致細胞死亡[9,17]。兩者作用機制的不同是其表現出不同抗菌活性的原因。當肉桂油和牛至油進行復配時，具有相加效應，多種成分共存時可提高各成分單獨使用的效果，這可能是兩種或兩種以上的成分相互協同作用的結果[18]，這需進一步微觀的實驗驗證。

3、結論

植物揮發油對 7 種腸道微生物均有一定程度的抑菌作用，其綜合抑殺菌能力最好的是醛類的肉桂油和酚類的牛至油，其次為酚類的百里香油。最值一提的是，雖然這三種植物精油對所有供試菌具有較強的抑制作用，但是整體來看其對腸道致病菌的抑制作用強于對腸道益生菌的抑制作用；而桉葉油、茶樹油、薄荷油、迷迭香油、茴香油表現出的抗菌活性并不明顯，這與抑菌圈直徑測定的結果相吻合。當將抑菌效果最好的肉桂油、牛至油和百里香油進行復配時，整體抑菌效果最好的是肉桂-牛至復配組合，其對腸道致病菌的抑制作用全表現出相加作用(FICI≤0.75)，而對腸道益生菌的生長卻沒有影響(FICI=1)，為開發新型綠色、安全、高效的抗生素替代品提供理論依據。

作者：吳克剛 羅敏婷    來源：預混料家園