馮定遠教授：酶制劑在飼料養殖中發揮替代抗生素作用的領域及其機理

畜牧人小李

導讀：2020年飼料中全面禁止添加抗生素，抗生素減停對飼料養殖業帶來了持續挑戰，在飼料配方和養殖過程中代替抗生素的技術和尋找有效的替代產品已成為當前行業研究的熱點和焦點，到目前為止還沒有完全代替抗生素作用的單一產品，研究表明，飼料酶制劑具有替代抗生素的潛在價值,在眾多替代飼料養殖的抗生素技術與產品中是比較被認可的一種。飼料酶制劑研究的領航人華南農業大學馮定遠教授系統闡述了酶制劑能夠通過間接和直接兩種方式，滿足抗生素的改善營養代謝而提高動物生產性能和抗菌殺菌而保持健康狀況兩大需求。通過影響腸道的物理性狀、營養狀況、微生態平衡和組織結構的完整性等幾方面實現替代作用。酶制劑的替抗功能具有條件性、輔助性和累積性的特點，通過組合酶和配合酶及益生型酶制劑的篩選和高效配制才能發揮其替抗價值，相信一定會對生產和研究有所幫助和指導。全文已在《飼料工業》2020年第12期刊出。

抗生素減停對飼料養殖業帶來了持續挑戰，為此，人們不斷研究在飼料配方和養殖過程中代替抗生素的技術和尋找有效的替代產品，各種技術措施和替代產品不斷出現，不同理論假說和應用效果眾說紛紜，這些情況大部分都有一定的效果和依據。但是，到目前為止，還沒有哪一種技術和產品能夠簡單代替抗生素的作用，而只能部分接近其效能，因為任何技術措施和產品都有其獨特性。從實踐角度，許多技術措施和替代產品已經在嘗試或者應用，2019年《國際家禽》雜志對養禽業從業者進行了一個世界范圍的調查，受訪者包括養禽業主、飼料配方師、獸醫師等相關人員，結果顯示：“為替代和補充促生長類抗生素對家禽生產性能和健康的益處，有機酸、益生菌和酶制劑被列為最受歡迎的三種抗生素替代品，受歡迎程度分別是65%、61%和54%。有機酸、益生菌和酶制劑是最有效的飼料添加劑，其有效性分別是74%、70%和68%”。所以，在眾多潛在的抗生素替代產品中，最受歡迎的抗生素替代產品和最有效的飼料添加劑都是有機酸、益生菌和酶制劑。當然，這些調查統計只能作為一種參考，不能就此排除其他產品，因為飼料配方的多樣性和養殖條件的復雜性，決定了沒有一套簡單的技術措施和路徑。無論如何，從上面的調查顯示，飼料酶制劑具有替代抗生素的潛在價值。在筆者的兩部專著（馮定遠等，2011、2020）和試驗研究報告（馮定遠，2017）中，部分內容都涉及酶制劑在替代抗生素應用。

1、酶制劑替代飼用抗生素的目標

很難消化的日糧可以維持數量更多的腸道微生物，添加最有效的酶，可以最大程度地減小菌群數量。Bedford等（2004）討論到，飼喂家禽中等營養水平的小麥基礎日糧，使用以木聚糖酶為主的酶制劑，可使微生物數量降低60%。因為使用抗生素可以直接作用于目標細菌，所以與酶制劑相比，更能顯著地降低菌群的數量。盡管酶制劑和抗生素都使菌群數量減少，但二者的作用方式顯然有很大的差別。抗生素改善生產性能的機理很多，如降低小腸中營養物質的競爭；因為控制了病原菌而減少了局部炎癥的發生；因為改善了消化率和病原菌的定植而降低了腸道的厚度和長度（Thomke等，1998a、b）。后兩種作用機制導致更有效的消化，降低了維持的能量需要。而酶制劑的作用效果是使腸道的菌群數量和細菌種類的變化（Brenes等，1992、1993；Gollnisch等，1996；Hock等，1997；Simon，1998；Vahjen等，1998）。抗生素作為飼料添加劑的目的包括兩個方面，一是促生長作用，提高飼料報酬，改善動物的生產性能；二是抑菌抗病作用，改善健康狀況，提高動物成活率和整齊度，這兩方面又有關聯性。所以，針對這兩個目的，無抗日糧使用的代替抗生素產品也就分為兩個類型，即直接替代性產品（替代抗菌抑菌功能）和間接替代性產品（替代促生長功能）。酶制劑是其中的一類可以替代抗生素的產品，而且由于酶的種類和功能廣泛，同時具有抗生素的兩種功能，即促生長和抗菌功能，例如葡萄糖氧化酶、溶菌酶等可以殺菌抑菌；而外源消化酶（蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）、植酸酶、非淀粉多糖酶等可以提高動物的生產性能。這是酶制劑的多種功能的一部分，酶制劑在畜禽飼料中有七種功能，包括：①營養利用功能；②腸道健康功能；③生理調控功能；④免疫調控功能；⑤脫毒解毒功能；⑥抑菌殺菌功能；⑦抗氧化功能。其中一些功能與抗生素的作用接近或相同。酶制劑的多功能性既源于酶種類的多樣性，也與酶制劑在飼料養殖中應用技術的變化搭配有關，從使用技術角度，飼料酶有七種類型產品，單一的一種單酶（或者一類酶）無法簡單滿足抗生素功能的替代。但可以根據目的，使用復合酶、組合酶、配合酶、組合型復合酶或者組合型配合酶，當然，沒有技術性的混合酶是不能解決實際問題的。

抗生素在促進動物生長的作用方式仍然未被完全理解，圍繞代替抗生素的作用，最基本的是從動物腸道微生物、微生態及其病變等腸道健康方面考慮。根據抗生素在飼料養殖中應用的目的及機理，在酶制劑中，有五個領域酶制劑具有間接或者直接替代抗生素的潛力，具體包括：①具有直接營養消化功能，促進動物生長的酶制劑，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等；②能夠降低日糧黏性，減少有害微生物繁殖的酶制劑，如木聚糖酶、葡聚糖酶、纖維素酶等非淀粉多糖酶；③通過降低日糧免疫原性造成的免疫應激，減少腸道病變壞死的酶制劑，如蛋白酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶等；④能夠直接殺滅細菌，抑制病原菌產生危害的酶制劑，如葡萄糖氧化酶、溶菌酶、過氧化氫酶等；⑤通過產生功能性寡糖和寡肽，控制有害微生物的酶制劑，如木聚糖酶、纖維素酶、蛋白酶等。酶制劑的這些替抗功能不能簡單的直接代替，它們是條件性的，而且有些可能發揮重要作用，一些是輔助性的、次要的，不能簡單夸大酶制劑在這方面的作用。在這些酶制劑中，選擇有針對性的酶制劑進行搭配組合，特別是在傳統的復合酶配制的基礎上，應用我們提出的組合酶和配合酶的理論（馮定遠等，2011、2020），可以代替過去使用的飼用抗生素在日糧中應用。

2、通過提高日糧消化，代替抗生素營養代謝功能的酶制劑

歐洲專家Sheppy早在2004就指出：歐盟最先頒布了飼料中禁止使用某些抗生素作為促生長劑這個決定，迫使飼料生產企業努力尋找替代品，酶制劑成為首選的措施。事實上，其本意是酶制劑的促進營養消化和利用，代替抗生素的促生產作用。同樣，Thorpe等（2004）也評論到：歐盟禁止了促生長的抗生素在動物日糧中的使用，這對動物生產性能以及健康狀況的影響仍需進一步研究和探討。禁用抗生素可能導致動物生產性能下降，外源酶制劑也許可以減輕其消極后果。也就是說酶制劑可以減少因限制使用促生長抗生素而帶來的損失。

酶制劑在飼料養殖中的應用最早的初衷是酶制劑能夠幫助動物提高日糧的消化利用，到目前為止，酶制劑的營養功能仍然是最重要的考慮。酶制劑改善營養消化利用的途徑大體有三個方面：①直接補充消化道營養水解所需的酶，消化蛋白質、碳水化合物和脂類的酶；②間接去除飼料中抗營養因子；③間接增加動物內源消化酶分泌。第一種途徑是一種酶制劑單一提高一類營養的消化利用，如蛋白酶只能提高蛋白質消化利用, 作用明確。第二、第三種途徑是一種酶制劑有可能同時提高幾類營養的消化利用，如木聚糖酶和植酸酶理論上可以提高所有營養的消化利用，作用綜合復雜。最早在畜禽飼料中使用第一代酶制劑的想法就是源于蛋白酶、淀粉酶或脂肪酶可以直接補充體內消化道相應消化酶不足的單一和對應原理。而另外某些酶制劑間接通過去除抗營養因子，提高營養成分的消化率。例如，木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶和植酸酶，最終提供更多可利用的營養。添加植酸酶能夠提高蛋白質和氨基酸的消化率，而不僅僅是植物磷的利用效率。還有某些酶制劑通過誘導動物內源消化酶分泌，提高營養的消化利用。添加淀粉酶和其他一些酶，可增加動物內源消化酶分泌，提高飼料轉化率和動物生長率（沈水寶，2002）。

我們前期研究了許多外源消化酶改善動物生產性能，通過補充內源酶不足，可以增加消化以減少未消化營養在后腸道過度代謝帶來對抗生素需求的增加。研究表明在肉雞日糧中添加α-淀粉酶可以顯著提高肉雞的平均日增重，降低料肉比。淀粉酶提高畜禽的生產性能的主要原因：改善腸道形態，增加絨毛長度，降低隱窩深度；提升內源酶活力，如脂肪酶，蛋白酶等；增加營養物質轉運載體的基因表達量，如SGLT1、GLUT2等（趙世元，2014）。日糧中添加外源蛋白酶可以改善畜禽的生產性能，提高營養物質的消化利用率。肉雞日糧中添加不同菌種來源的蛋白酶能顯著降低耗料增重比，同時顯著提高回腸末端氨基酸的表觀消化率（吳建東，2014）。在低蛋白日糧中添加蛋白酶能夠顯著改善斷奶仔豬的生產性能，提高飼料利用率，顯著提高斷奶仔豬總能、粗蛋白的表觀消化率（黃升科，2011）。同時蛋白酶可以不同程度改善斷奶仔豬腸道完整性，提高內源消化酶的活力以及營養物質轉運載體的基因表達（凌寶明，2011）。幼齡動物通常脂肪酶分泌不足，添加外源脂肪酶能夠緩解脂肪酶缺乏造成的負面影響。在低能量日糧中添加脂肪酶，能夠顯著改善黃羽肉雞的生產性能，達到正常能量日糧肉雞水平（雷建平，2012）。提高屠宰率和全凈膛率，改善雞肉品質（劉昌鎮，2012）。

3、通過降低日糧黏性，代替抗生素減少有害微生物繁殖的酶制劑

黏性日糧的可溶性、大分子量的非淀粉多糖一方面能干擾營養物質的消化和吸收，另一方面導致腸道微生物大量繁殖，消耗營養（Bedford等，1998）。抗生素促生長劑在日糧中的使用，腸道黏度是主要考慮因素（Choct，2004）。酶制劑促進腸道健康的功能：一是與酶制劑功能的物理作用相關，通過降低黏性；二是與生化代謝作用相關，酶制劑產生的寡糖可促進腸道正常蠕動，促進有益菌的增殖,抑制有害菌的定植。酶制劑可以調節腸道健康，最典型的具有促進腸道健康功能的酶制劑是非淀粉多糖酶(包括木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶等)。

抗生素可以顯著改善飼喂高非淀粉多糖（NSP）日糧的家禽的生產性能（Mac Auliffe等，1971；Misir等，1978a、b）。無論哪一種原因，家禽小腸中過量的發酵可能不利于小腸的消化和吸收，日糧中添加非淀粉多糖酶制劑可能會緩解這種狀況。或許是通過降低小腸中食糜黏度，加速了食糜的通過和營養物質的消化率（通過除去黏性膠質的抑制擴散作用），因此微生物發酵的底物和發酵時間均減少，使得其繁殖減慢。這可恢復正常和有效的小腸中淀粉和蛋白質的消化（酶解作用）（Choct，2004）。

外源性酶制劑的添加降低了小麥和黑麥基礎日糧的黏度，結果是減少了小腸菌群的數量（Choct等，1996；Hock等，1997）。酶制劑的添加增加了小腸中淀粉和蛋白質的排空速度，減少了微生物發酵所需要的底物。Choct等（1996）認為酶制劑與腸道健康是動物營養學的下一個挑戰，NSP酶作為抗生素替代物，在家禽業中對影響經濟效益的腸道壞死病(necrotic enteritis NE)的作用明顯，酶制劑對黏性日糧造成的腸道壞死病有預防作用，特別是產氣莢膜梭菌（C. perfringens）等有害微生物造成的腸道炎癥。

豬方面的研究也有類似的結果，非淀粉多糖分解后可能產生寡糖抑制后腸道有害細菌生長，減少腸道傳染病和降低腹瀉率。黏性日糧與大腸炎綜合癥，可溶性纖維是影響非特異大腸炎綜合癥的關鍵因素，尤其是對于采食黏性的小麥基礎日糧（顆粒飼料）的生長豬，添加木聚糖酶可以改善這種情況。酶制劑的使用可降低因日糧而導致的腹瀉，尤其是斷奶仔豬更明顯（Inborr等，1988；Florou-Paneri等，1998；Kantas等，1998）。不少研究者特別強調，這些作用以及酶與治療或亞治療劑量的抗生素所具有的協同作用（Florou-Paneri等，1998；Kantas等，1998；Gollnisch等，1996），為未來的生產方式（不單純依賴抗生素的生產方式）提供了可能性（Partridge，2004）。

控制酶添加效應的許多因子與影響抗菌素添加效應的因素一樣（Bedford等，2004）。抗生素的添加效應與動物的生長環境有關，普通動物比無菌動物對抗生素的添加效應更明顯。飼喂家禽營養合理的小麥基礎日糧，使用以木聚糖酶為主的酶制劑，可使微生物數量降低60%。抗菌素的使用因直接作用于目標細菌，而顯著降低細菌數量的程度比酶制劑更迅速。這兩種降低細菌數量的方式是不一樣的。本課題組前期多項研究表明，小麥代替玉米的肉雞日糧中，添加木聚糖酶可以顯著提高肉雞的生產性能，提高日增重，降低料肉比（于旭華，2004；徐昌領，2011；李秧發，2010；廖細古，2006）。β-甘露聚糖酶在玉米-豆粕型基礎及低能量日糧中，對肉雞飼料轉化率均有顯著提高（閆曉陽，2013）。非淀粉多糖造成的食糜黏性增加，不僅阻礙內源消化酶活力，也抑制內源消化酶的分泌。添加非淀粉多糖酶對內源消化酶的活力及分泌具有顯著改善。木聚糖酶能提高小腸食糜中蛋白酶、脂肪酶及淀粉酶的活力，增加小腸黏膜中麥芽糖酶和蔗糖酶的分泌（李忠良，2011）。纖維素酶對雛鵝十二指腸內容物胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶活性具有顯著提高作用（楊彬，2004）。腸道微生物過度增殖是非淀粉多糖影響畜禽健康的重要因素，而非淀粉多糖酶的添加對腸道微生物有著顯著的影響。木聚糖酶能夠顯著增加肉雞后腸中乳酸桿菌的豐度，減少大腸桿菌的豐度（辛錦蘭，2011）。纖維素酶在肉鵝高纖維日糧中顯著降低了盲腸內容物大腸桿菌的數量（黃燕華，2004）。非淀粉多糖酶對梭狀芽孢桿菌等有害菌的增殖有抑制作用（Jackson等，2003）。非淀粉多糖造成的食糜黏性使得腸黏膜層變厚，腸壁厚度增加，降低了營養物質的吸收，而非淀粉多糖酶能有效地改善畜禽腸道形態，增加絨毛長度，降低隱窩深度，提高腸道緊密連接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1基因表達量，從而提高營養物質的表觀消化率和能量真消化率（李忠良，2011；雷釗，2013）。

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通過直接殺滅細菌，

代替抗生素抑制病原菌危害的酶制劑

最典型的具有病原菌殺菌抑菌功能的酶制劑是葡萄糖氧化酶和溶菌酶，飼料中添加葡萄糖氧化酶是替抗、減抗的有效手段。馮定遠（2016）討論綜合了葡萄糖氧化酶在日糧中替代抗生素的機理和應用價值。葡萄糖氧化酶的作用是催化葡萄糖氧化分解，造成兩個結果：一是消耗環境中氧，造成厭氧環境；二是產生葡萄糖酸，維持酸性環境，這兩個方面都對微生物特別是病原性細菌是不利的。而另一種酶過氧化氫酶能夠將過氧化氫分解生成水和氧，而后水又與葡萄糖酸內酯結合產生葡萄糖酸。

葡萄糖氧化酶主要是通過非營養、非消化方式改善消化道的內環境和微生態，通過三個途徑對病原菌殺菌、抑菌，其一通過氧化葡萄糖，生成葡萄糖酸，降低胃腸道內酸性，酸性環境有利于抑制病原菌；其二通過氧化反應消耗胃腸道內氧含量，營造厭氧環境，厭氧環境有利于抑制病原菌；其三反應產生一定量過氧化氫，過氧化氫的氧化能力是廣譜殺菌，大部分腸道病原菌都是耗氧菌，大部分有益微生物都是厭氧菌或兼性厭氧菌，消耗氧氣有助于增殖有益菌。對大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、葡萄球菌、弧菌等有害菌進行抑制，達到維持腸道菌群平衡，保證動物健康。作用機理有別于抗生素，不會產生抗藥性或藥物殘留，為綠色生態養殖提供了另一條通途。

葡萄糖氧化酶替抗作用及其機理主要是由于葡萄糖氧化酶作用于病原菌的物理生存環境，能專一分解β-D-葡萄糖成為葡萄糖酸和過氧化氫，同時消耗大量的氧氣。葡萄糖氧化酶作為一種新型的飼料添加劑具有部分的抗生素效果，例如提高動物生產性能，保護腸道健康和增強動物免疫力（Tang等，2016）。葡萄糖氧化酶的生理功能主要表現在兩個方面：①制造厭氧環境，增加腸道酸性，消除腸道病菌生存環境，抑制病原菌的生長。葡萄糖氧化酶進入腸道，以葡萄糖作為底物，生成葡萄糖酸和過氧化氫。過氧化氫具有廣譜殺菌作用，可以起到抑制大腸桿菌、沙門氏菌等致病微生物生長繁殖的作用（楊久仙等，2011）；葡萄糖氧化酶消耗氧氣形成的厭氧環境，抑制有害菌的生長，促進有益菌，形成優勢菌群，改善腸道菌群，保護腸道健康；生成的葡萄糖酸具有酸化劑的功效，促進胃腸道食糜產生更多的短鏈脂肪酸，改善腸道微生態（Tsukahara等，2002）。②保護腸道上皮細胞完整，處于應激或病理狀態的動物會產生大量自由基，當自由基超過機體自身的清除能力時就會破壞腸道上皮細胞；添加葡萄糖氧化酶可以清除這些自由基，能保護腸道上皮細胞的完整性，阻止大量病原菌的入侵，提高免疫力，促進動物健康快速生長（呂進宏等，2004）。目前研究葡萄糖氧化酶對畜禽腸道微生物的影響主要通過體外抑菌試驗和針對特異菌種的檢測，然而探索葡萄糖氧化酶對如何改善畜禽整體的微生物區系，將會為其應用提供更加充分的理論基礎。

同時，葡萄糖氧化酶還具有抗氧化作用，能有效清除自由基，保護腸道上皮細胞的完整性，使球蟲侵入腸道上皮寄生部位的機會大大降低，從而達到防御球蟲的目的。添加葡萄糖氧化酶仔豬的血清SOD和GSH-Px含量水平，跟無抗生素組相比，都有顯著性升高（P<0.05）。和無抗生素組相比，肝臟中的GSH-Px含量水平有顯著性的提高（P<0.05）。由此說明葡萄糖氧化酶可增強斷奶仔豬的抗氧化能力，從而降低斷奶仔豬的腸道炎癥反應，維持腸道健康和穩態，減少腹瀉（陳嘉銘，2019）。

在我們的研究中，玉米豆粕型肉雞日糧中添加葡萄糖氧化酶與空白組和抗生素組相比，葡萄糖氧化酶組平均日增重分別提高5.08%和2.09%，平均日采食量分別提高1.83%和0.01%，料肉比分別降低3.11%和1.97%；葡萄糖氧化酶對腸道形態亦有改善作用，增加絨毛高度，提高腸道物理屏障相關基因表達，如ZO-1、Occludin等。此外葡萄糖氧化酶減輕了腸道免疫反應，降低相關炎癥基因的表達，如IL-1β、IL-4及IL-8等。盲腸內容物16S rDNA分析發現添加葡萄糖氧化酶相比于對照組和抗生素組可以顯著提高肉雞盲腸食糜中的OTU值，表明葡萄糖氧化酶促進腸道菌群的多樣性，也證實抗生素對腸道菌群整體的破壞。葡萄糖氧化酶可以降低擬桿菌門的相對豐度，提高放線菌門的相對豐度以及厚壁菌門與擬桿菌門的比值，對擬桿菌門的擬桿菌科和紫單胞菌科，厚壁菌門中的瘤胃菌科和毛螺旋菌科的相對豐度都有顯著的影響。抗生素對腸道菌群的影響較為劇烈，對有益菌和有害菌的無差別的殺滅作用，長期使用抗生素能夠造成腸道菌群動態的失衡。而葡萄糖氧化酶對腸道微生物的作用與抗生素相似，但相對溫和，特別是對有益菌的抑制作用。因此，葡萄糖氧化酶對腸道菌群結構有一定的改善作用（黃婧溪，2018）。

過氧化氫酶是基于消減自由基維護機體氧化還原平衡、控制氧化損傷來降低對抗生素需求。正常生理活動下，體內氧自由基的產生與清除處于動態平衡狀態。當畜禽周圍環境驟變或者處于特殊的生理狀況，會導致自由基大量產生，超過機體的清除速度，自由基就會在體內過量累積，就會出現氧化應激。而過量的自由基破壞腸道組織中DNA、脂質、蛋白質等生物大分子，造成腸道氧化應激損傷，導致動物腹瀉、腸炎、菌群紊亂等，影響營養物質的消化吸收，從而損害動物的生長發育（李維等，2016）。過氧化氫酶是動物植物體內廣泛存在的末端氧化酶，又稱為“觸酶”，是參與活性氧代謝的重要因子之一，與超氧化物歧化酶、過氧化物酶等共同組成了生物體內活性氧防御系統，在清除氧自由基方面發揮重要作用。過氧化氫酶的主要作用就是通過催化電子對的轉移將H2O2轉化為對機體無害的水和氧氣，從而清除體內堆積的超氧陰離子和減少生成羥自由基等強活性的自由基，同時有效降低自由基對腸上皮細胞的損傷，從而維護仔豬腸道結構的完整性。

本課題組研究表明日糧添加過氧化氫酶能有效替代氧化鋅在斷奶仔豬中的應用。24日齡斷奶仔豬基礎日糧中分別添加氧化鋅和過氧化氫酶，飼養14 d，結果表明，添加過氧化氫酶顯著降低料肉比和腹瀉率；改善腸道形態，顯著提高絨毛高度，降低隱窩深度；減輕仔豬的氧化應激，提高抗氧化能力，顯著降低血清中丙二醛的含量，提高血清中谷胱甘肽的含量和超氧陰離子的抑制能力。細胞實驗表明過氧化氫酶能顯著降低過氧化氫對腸道上皮細胞的損傷，增加細胞活力（方銳，2017）。過氧化氫酶能改善母豬的繁殖性能和抗氧化能力。母豬妊娠后期添加過氧化氫酶能一定程度提高總產仔數；血液和初乳中的總抗氧化能力和谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶的活力均有顯著地提高；對仔豬的腹瀉率也有顯著的降低（張志東，2017）。研究證明，外源添加過氧化氫酶能有效地幫助動物清除氧自由基，提高機體的抗氧化能力，緩解氧自由基造成的損傷，改善動物生產性能，達到減抗替抗的效果。

另外一類殺菌的酶制劑是通過對細菌細胞壁水解，這些酶包括溶菌酶、β-甘露聚糖酶、殼聚糖酶和β-葡聚糖酶等。溶菌酶是一種作用于β-1，4糖苷鍵的細胞壁溶解酶；也有作用于肽“尾”和酰胺部分的細胞壁溶解酶。目前微生物溶菌酶分5種：①內N-乙酰己糖胺酶，此酶同于雞蛋清溶菌酶，破壞細菌細胞壁肽聚糖中的β-1，4糖苷鍵；②酰胺酶，切斷細菌細胞壁肽聚糖中NAM與肽“尾”之間的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸鍵；③內肽酶，使肽“尾”及肽“橋”內的肽鍵斷裂；④β-1，3、β-1，6葡聚糖酶和甘露聚糖酶，此酶分解酵母細胞的細胞壁；⑤殼聚糖酶，這是分解霉菌細胞壁的一種溶菌酶。

除了溶菌酶和葡萄糖氧化酶直接殺菌抑菌外，還有一個特別的酶制劑代替抗生素抑菌例子，例如脂肪酶。某些脂肪酶它不是通過營養作用，而是直接抑制病原微生物。Dierick等（2002、2004）利用含有中鏈脂肪酸的油脂和脂肪酶的協同作用，在模擬胃環境 （37 ℃、pH值3~6、3 h）下的組合水解試驗表明，適量添加脂肪酶能部分釋放中短鏈脂肪酸，特別是月桂酸、丁酸一類產物。試驗表明這些中鏈脂肪酸能夠調節和穩定胃腸道微生物群系，對有害微生物的生長具有顯著的抑制作用，起到類似抗生素的作用。由此推測，脂肪酸和脂肪酶的合理組合可能起到降低仔豬飼料中抗生素使用量的作用。

除了對細菌有殺滅作用外，某些特別的酶制劑也顯示對病毒有抑制作用。我們正在進行的試驗也顯示果膠酶能夠產生一些產物，具有抑菌的潛能（張源，2020）。

所以，根據作用機理，有抑菌作用的酶大體有四類：葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶等通過厭氧條件、溶菌酶和殼聚糖酶等作用細胞壁、脂肪酶產生的特別是中短鏈脂肪酸、果膠酶等系列產物，這需要進一步總結。

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通過降低日糧免疫原性，

代替抗生素減少腸道病變壞死的酶制劑

某些特別的非淀粉多糖能刺激動物固有免疫系統，刺激機體產生多余的免疫反應，消耗能量，影響生產性能。通過添加抗生素能夠降低日糧中非淀粉多糖對畜禽造成的消極影響（Teirlynck等，2009），而針對性的非淀粉多糖酶也有類似效果。非淀粉多糖的種類很多，只有少數才具有免疫原性。其中具有復雜側鏈異多糖的β-甘露聚糖，特別是β-半乳甘露聚糖具有免疫原性，它產生的免疫應激與抗原蛋白不同。由于與病原（致病菌）相關分子模式（Pathogen Associated Molecular Pattern, PAMP）相似，動物腸道上存在相應的抗原的模式識別受體（PRR），它能夠與β-半乳甘露聚糖結合引起免疫應激，造成腸道潰瘍等炎癥，同時造成營養特別是能量的消耗。Hsiao等（2006）認為：β-半乳甘露聚糖由于與組成多種病原體（致病菌）的表面成分（Surface Components of Multiple Pathogens，SCMP）相似，能夠刺激特有的免疫系統，導致無目的性的能量損耗的免疫反應。腸道上的受體（PRR）與β-半乳甘露聚糖的PAMP結合引起免疫應激，可通過測定血清中α-1-酸性糖蛋白(AGP)作為免疫反應指標。最近進行的瓜爾豆來源的β-半乳甘露聚糖也顯示其對腸道免疫功能的影響（付饒，2020）。

這種免疫反應導致慢性炎癥，β-甘露聚糖酶可以減少由于免疫反應造成的肉雞壞死腸炎損害，與艾美球蟲和產氣莢膜梭菌（C. Perfringens）的侵襲模式相同。飼料源性免疫反應（feed induced immune response, FIIR）導致的長時間持續免疫應激，所造成的能量等營養消耗的累積是明顯的，將影響動物生產性能。特異性β-甘露聚酶可消除β-半乳甘露聚糖的免疫原性。

Arsenault等（2017）通過對相關蛋白磷酸化信號的數據分析表明：在含有瓜爾豆粕日糧中添加β-甘露聚糖酶可以消除β-半乳甘露聚糖造成的飼料源性免疫反應（FIIR），降低免疫信號。β-甘露聚糖酶也可以降低免疫球蛋白IgG的產生（Li等，2010）、降低粒性白細胞（Mehri等，2010）、降低免疫器官法氏囊和脾臟的相對重量（Ferreira等，2016）。所以，特殊的非淀粉多糖（例如β-甘露聚糖）不僅能造成食糜黏性，降低動物生產性能，同時能造成動物機體產生免疫反應，導致能量流失，降低生產性能（Hsiao等，2006）。

Teirlynck等（2009）研究發現高非淀粉多糖的小麥日糧能誘導腸壁中的淋巴細胞浸潤并誘導上皮細胞的凋亡，遠遠超過具有低水平可溶性NSP的谷物如玉米。Ferreira等（2016）添加β-甘露聚糖酶能減少脾臟和法氏囊的相對重量，同時降低血液中IgA，IgG和IgM的含量，減少免疫反應耗用營養物質，改善生產性能。Arsenault等（2017）通過激酶組學分析發現在肉雞日糧中額外添加β-甘露聚糖能激活多個免疫相關的信號通路，而β-甘露聚糖酶能消除對應的免疫信號。表明非淀粉多糖酶能夠減輕飼料源性造成腸道免疫反應，類似抗生素的作用效果。Partridge（2004）認為酶制劑是防止豬的非特異大腸炎綜合癥的關鍵因素，為未來的生產方式，特別是不單純依賴抗生素的生產方式，提供了可能性。

除了特異性的β-半乳甘露聚糖具有免疫原性，長時間造成的免疫反應而導致動物腸道的壞死性腸炎外，大分子的蛋白，特別是豆科的大豆蛋白引起幼年哺乳動物的腸道免疫反應也是人們關注的一個課題。大豆蛋白的免疫原性引起的腸道損害與β-半乳甘露聚糖的性質是不一樣的，但都會引起腸道的病變，只能通過抗生素來加以克服，斷奶仔豬日糧離不開抗生素的原因也在這里。抗原蛋白的問題一般是通過膨化或者發酵處理加以克服，而蛋白酶，特別是應用多種性質不同的蛋白酶組成的組合酶，理論上是可以解決其免疫原性問題，在仔豬無抗日糧的配制中，高效、有針對性的蛋白酶也是應該考慮的一個措施，但專門關注研究的并不多。

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通過產生功能性寡糖和寡肽，

代替抗生素控制有害微生物的酶制劑

抗生素在飼料養殖中應用的功能是綜合性的，替代抗生素的技術措施也是多樣性的，這也是為什么到目前為止，替抗技術與產品五花八門，良莠不齊。既有技術和產品本身的因素，也有認識和技術水平的因素。由于酶制劑種類繁多，功能復雜。酶制劑除了上面四個具有比較明確的替抗領域外，還有比較間接的應用領域，即酶制劑水解產物，部分酶解產生的功能性寡糖和寡肽具有調節腸道健康的作用，在替抗方面起到輔助的作用，作為益生元的功能性寡糖（低聚糖）尤為明顯。根據腸道微生態平衡和微生物菌群調節的特點，利用酶制劑的干預機制，我們提出了益生型飼料酶制劑的理論（馮定遠等，2020）。

產生寡糖等功能性酶解產物實現減抗替抗作用，低聚糖被認為以益生元的形式發揮作用。低聚糖一般經過胃和小腸而不被消化吸收，直接到達動物后腸段，被有益菌利用，生成乙酸、丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸，不僅能為腸黏膜細胞提供能量，促進細胞的生長代謝，還可以降低結腸內pH值環境，抑制有害菌的生長。高度難消化日糧維持更大數量的腸道微生物，酶的添加使得菌群數量最大程度地減小，木聚糖酶可使微生物數量降低60%。肉仔雞小麥日糧中添加木聚糖酶，導致利用淀粉和蛋白的細菌數量減少（Vahjen等，1998），利用木糖的微生物數量增加，酶處理組的細菌總數僅有對照組的40%。高纖維日糧中添加纖維素酶可顯著減少盲腸內容物大腸桿菌數，同時顯著增加了有益的乳酸桿菌數。在我們的研究中，肉雞日糧中添加低聚木糖和乳酸桿菌配伍能提高肉雞的飼料轉化率，改善血清中IGF-1的含量；能夠改善肉雞腸道形態，提高腸道緊密連接蛋白ZO-1、Occludin和F11的基因表達量，抑制有害菌的增殖，增加有益菌豐度（Yusuf，2014）。以小麥作為酶解底物，添加不同類型的木聚糖酶，進行體外酶解。采用高效液相色譜測定木聚糖水解產物的組成，結果表明酶解產物85%以上集中在木二糖及木三糖。利用酶解產物培養細菌發現，其對乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌有顯著的增殖作用；此外發現，木聚糖水解產物能夠顯著降低大腸桿菌對腸道上皮細胞的黏附率，減少細胞LDH的釋放量，降低大腸桿菌對細胞的損傷作用（雷釗，2013）。馬巖（2015）研究發現木二糖和木三糖均能促進乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌的增殖，并且減少大腸桿菌和沙門氏菌對雞腸道上皮細胞的黏附，緩解對細胞造成的損傷。雛雞盲腸微生物檢測得到相似的結果。為了進一步了解低聚木糖對細菌的影響，本課題組通過分別添加5 mg/ml的木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖及木六糖于鼠傷寒沙門氏菌培養基中連續體外培養36 h，分點測定吸光值，發現木糖、木五糖及木六糖均能顯著抑制沙門氏菌的增殖；經5 mg/ml的木糖及低聚木糖培養4 h后的鼠傷寒沙門氏菌均顯著降低對IPEC-J2的黏附率，其中以木糖效果最好，黏附率降低49.3%，其余組分降低的比例分別為27.13%、37.04%、17.48%、21.91%、41.20%。通過測定細胞培養基中LDH的含量發現，木糖及低聚木糖均能不同程度緩解鼠傷寒沙門氏菌對細胞的損傷。經轉錄組學分析，木糖及低聚木糖影響沙門氏菌活動的各個方面，而可能通過改變其生長、黏附相關基因galk、speA、smpB的表達來實現頡頏作用（歐陽海燕，2017）。低聚糖可能通過直接黏附在細菌表面，以及通過影響黏附相關基因的表達，改變腸道中存在的有害菌的黏附潛力（Ebersbach等，2012）。揭示了低聚糖在抑菌方面代替促生長抗生素的潛力，所以，木聚糖酶的添加，可以產生功能性寡糖，起到協同替代抗生素的作用，當然，這種功能可能是潛在的、輔助的和累積的，未必能夠達到顯著的性能改善水平。

總而言之，酶制劑代替抗生素在飼料養殖中的應用包括五類酶具有間接或者直接替代抗生素的潛力，具有直接營養消化功能，促進動物生長的酶制劑；能夠降低日糧黏性，減少有害微生物繁殖的酶制劑；通過降低日糧免疫原性，減少腸道病變壞死的酶制劑；能夠直接殺滅細菌，抑制病原菌產生危害的酶制劑；通過產生功能性寡糖和寡肽，控制有害微生物的酶制劑。它們的作用機理是通過影響腸道的物理性狀、生化條件、微生態平衡和組織結構的完整性等幾方面實現。酶制劑的替抗功能具有條件性、輔助性和累積性的特點，只有在復合酶的基礎上，應用組合酶和配合酶及益生型酶制劑的理論才能配制高效的飼料酶制劑添加劑，達到代替過去使用的飼用抗生素在日糧中應用的目的。

參考文獻及更多內容詳見：飼料工業，2020，41（12）：1-10

作者簡介

馮定遠，華南農業大學教授、博士生導師。農業農村部飼料評審委員會委員、全國飼料標準化委員會委員。中國動物營養學會常務理事、飼料安全與飼料生物技術專業委員會主任。中國飼料工業協會常務理事、廣東省飼料行業協會名譽會長。華南農業大學畢業后留校任教，從事動物營養與飼料科學的科研與教學工作，重點研究領域在飼料生物技術和飼料營養價值評定。

來源：飼料工業

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