獸醫臨床中的藥敏試驗

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獸醫臨床中的藥敏試驗 目前由各種細菌所引起的疾病給畜禽養殖業帶來嚴重經濟損失，阻礙了養殖業的快速發展，所以使用抗菌藥預防和治療細菌性疾病成了畜禽養殖過程中的一項重要工作。但由于養殖過程中不科學的、盲目的濫用抗菌藥，細菌的耐藥性問題正變得越來越突出，不少耐藥菌株可耐受多種抗生素。由此而造成的危害十分嚴重，它不僅使抗菌藥的療效降低，療程延長，死亡率升高和治療費用增加。這不僅給養殖業帶來巨大的經濟損失，而且耐藥菌株可能會將耐藥性基因由動物轉移給人類，對人類健康也造成潛在威脅。因此，臨床上應合理應用抗菌藥，以避免或減少耐藥性的產生，而合理應用抗菌藥控制畜禽疾病的一項重要內容就是通過藥敏試驗指導臨床用藥，以充分發揮抗菌藥療效，并盡可能減少其不良影響。 一、什么是藥敏試驗？ 抗菌藥物敏感性試驗（antimicrobial susceptibility test，AST），簡稱藥敏試驗，是指對敏感性不能預測的分離菌株進行試驗，測試抗菌藥在體外對病原微生物有無抑制作用，以指導選擇治療藥物和了解區域內常見病原菌耐藥性變遷，有助于經驗性治療選藥。藥敏試驗是獸醫臨床工作中的一項基本技能，也是使用抗菌藥物治療前必不可少的一道環節。 二、藥敏試驗的意義 1、可以相對快速有效地檢測病原菌對各種抗菌藥的敏感性，指導臨床合理用藥。因為實驗是在體外對已經分離的細菌進行藥敏，不需要生物載體，不需要實驗動物，操作相對簡單，成本相對降低。是一種既經濟又有效的方法。 2、可以對流行病學調查進行監控，控制和預防耐藥菌株的流行。因為隨著新型致病菌的不斷出現，各種致病菌對不同的抗菌藥的敏感性不同，同一細菌的不同菌株對不同抗菌藥的敏感性也有差異。進行有效的藥敏試驗可以及時掌握各種新型菌種和菌株的耐藥性，對流行病學調查建立監控，同時采取相應的措施也就可以控制和預防耐藥菌株的流行。 3、為臨床用藥提供參考依據。因為一個正確的藥敏試驗結果，可作為臨床獸醫和畜禽養殖者選用有效抗菌藥的參考。長期以來，由于各種致病菌耐藥性的產生使各種常用抗菌藥藥效下降或消失。不能很好的掌握藥物對細菌的敏感程度，不但造成藥物浪費，而且還延誤病情，給養殖戶造成了很大的經濟損失。近十幾年，在肉雞生產中，為了控制大腸桿菌及某些細菌感染，一些抗菌藥物的盲目使用，導致耐藥菌株越來越多。根據已進行的大量藥敏試驗結果，大腸桿菌、沙門氏菌對曾經敏感的氨基糖苷類、氟喹諾酮類等，均產生了不同程度的耐藥性，經常發現對十幾種常用抗菌藥都不敏感的菌株。這是一個非常危險的信號。所以在臨床疾病防治工作中，要取得較好的治療效果，應擴大常規抗菌藥種類進行藥敏試驗，根據藥敏試驗結果，選擇敏感藥物，且應注意交替用藥，按療程投藥，這樣才能收到較好的治療效果。 三、常用的藥敏試驗方法 獸醫臨床常用的藥敏試驗方法主要有兩種，即擴散法和稀釋法。其中擴散法屬手工測試方法，通過測試藥物紙片或者牛津杯在固體培養基上的抑菌圈的大小，判斷細菌對該種藥物是否敏感。稀釋法包括試管稀釋法和微量稀釋法，通過測試細菌在含不同濃度藥物培養基內的生長情況，判斷其最低抑菌濃度（MIC）。 由于擴散法操作簡單，成本低，已經被大多數實驗室和基層單位所采用。擴散法又包括紙片法、牛津杯法和打孔法，目前牛津杯法和打孔法在獸醫臨床已較少應用。以下簡單介紹紙片法。 1、藥敏紙片的制作 紙片法中使用的藥敏紙片目前市場上已有較多廠家的產品銷售。但也可根據需要自制，具體自制的方法如下： 取質量較好的定性濾紙，用普通的打孔器打成直徑6mm的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔干燥的小瓶或小平皿中，以單層牛皮紙扎口或包扎。經15磅15-20分鐘高壓滅菌后，置于37℃溫箱或烘箱中數天，使完全干燥。按每張紙片飽和吸水量為0.01ml計，在上述含有50片紙片的小瓶內加入藥液0.5ml，不時翻動，使濾紙片將藥液均勻吸凈，一般浸泡30分鐘即可。同時在記錄藥物名稱，于37℃溫箱過夜。在溫箱或烘箱中的時間不宜過長，以免某些抗生素失效。青霉素、金霉素宜在低溫下真空干燥。干燥后即密封。切勿受潮，置陰暗干燥處或家用冰箱中保存，有效期4-6個月。 2、藥液的制備 自制藥敏紙片時還需自行配制抗菌藥液。抗菌藥的稀釋劑通常用蒸餾水。一般可按商品藥使用說明書上的配料或飲水濃度，按1g需加多少毫升水或配多少毫克飼料，就相當于配制藥液所加蒸餾水的毫升數。如10g藥物可配50kg飼料，其換算方法為：1g本品加5000ml蒸餾水。此溶液液即為用于做藥敏試驗的藥液。 3、試驗操作方法 在超凈工作臺中或酒精燈旁，用無菌棉簽或經酒精燈火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將菌液均勻涂布到平皿中的固體培養基表面。然后用無菌鑷子將紙片放于固體培養基表面并輕壓，使紙片與培養基表面完全接觸。為了能準確觀察結果，要求藥敏紙片均勻分布于培養基上，位置安排適中，防止出現抑制圈重疊。一般各紙片中心相距應大于24mm，可在平皿中央貼一片，外周等距離貼5－6片。記住每種藥敏紙片的名稱。貼完紙片的平皿15分鐘后再置于37℃溫箱中培養16－24小時，觀察記錄結果。以藥敏紙片周圍沒有肉眼可見生長物區域為抑菌圈，根據抑菌圈直徑大小判斷細菌對抗菌藥的敏感性。 藥敏試驗結果判定標準 抑菌圈直徑（毫米）敏感性 ＞20極敏感 15-20高敏感 10-14中敏感 ＜10低敏感 0不敏感 實踐證明，利用自制藥敏紙片進行藥敏試驗，可以靈活選藥，與某病菌相關的藥物均可隨時制作藥敏紙片用于治療。可在本場藥品范圍內或本地區容易買到的藥品中選出最敏感的藥物。還可在短時間內選擇最佳藥品和最佳劑量，既能縮短病程，又能避免盲目用藥，減少浪費。 四、根據藥敏試驗選藥原則 完成藥敏試驗后，應根據結果選擇敏感性較高，同時價廉、易得、安全的藥物進行治療，以減少耐藥菌株，同時還應注意以下原則： 1、在選擇高敏藥物時還應考慮藥物的吸收途徑。因為藥敏試驗是藥液直接和細菌接觸，而在給畜禽用藥時，必須通過機體的吸收才能使藥物發揮療效，所以在給畜禽用藥時，高敏藥物一定要配合適宜的給藥方法，并予以足夠劑量、足夠療程，才會取得好的治療效果。 2、藥敏試驗結果僅為臨床選擇高敏藥物的參考。因動物機體及環境等因素影響，藥物的藥敏試驗與臨床治療效果的符合率一般為70－80%，所以也不能過分地依賴藥敏試驗。如發現療效不顯著應及時換藥。 3、藥敏試驗確定的首選藥物不是一成不變。隨著藥物使用頻率的增加及新特藥的不斷出現，細菌對原先的高敏感藥物可能不再敏感。因此，定期進行藥敏試驗了解本場細菌對抗菌藥的敏感性情況是很有必要的。 4、窄譜抗生素能解決的問題不選廣譜抗生素，一種抗生素可達到治療作用時，不要用兩種藥物聯合應用。必須應用兩種抗生素時，應選擇聯合應用具有協同作用的藥物。 5、避開已經使用過的藥物或其同類藥物，發病期間已用過的藥物或同類藥物一般不用。 四、影響藥敏試驗結果的因素 在以紙片法進行藥敏試驗時，以下幾方面因素可影響試驗的結果： 1、培養基：首先應根據試驗菌的營養需要選擇適宜的培養基。培養基的成分的不同，不僅影響敏感菌株的生長繁殖并可影響到抑制圈的直徑。一般細菌，如大腸桿菌及葡萄球菌可使用普通營養瓊脂；做磺胺類藥物敏感試驗時應選用無蛋白胨平板；鏈球菌和巴氏桿菌可用綿羊血瓊脂平板。其次，傾注平板時，厚度應合適（約5-6mm），不可太薄，一般90mm直徑的培養皿，傾注培養基18-20ml為宜。培養基內應盡量避免有抗菌藥物的拮抗物質，如鈣、鎂離子能減低氨基糖苷類的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和對氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺藥和TMP的活性。 2、細菌接種量：細菌接種量應恒定，如太多，抑菌圈變小，能產酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性。 3、藥物濃度：藥物的濃度和總量直接影響抑菌試驗的結果，需精確配制。商品藥應嚴格按照其推薦治療量配制。 4、培養時間：一般細菌培養溫度和時間為37℃ 12-24小時，有些抗菌藥擴散慢如多粘菌素，可將已放好藥敏紙片的培養基先置4℃冰箱內2-4小時，使抗菌藥預擴散，然后再放37℃溫箱中培養，可以推遲細菌的生長，而得到較明顯的抑菌圈。 五、藥敏試驗存在的問題 當前進行藥敏試驗仍然存在一些問題，主要包括以下幾方面： 1、方法學不統一，沒有標準化。 2、市場提供的藥敏試驗的培養基、藥敏紙片等缺乏嚴格質控，質量難以保證。所以還是建議按要求自制藥敏紙片。 3、因需要先進行細菌的分離培養，所以藥敏試驗報告出結果時間長，檢驗與臨床缺乏溝通，對于基層獸醫站或養殖場，藥敏結果不能滿足臨床治療要求，容易延誤治療時機。但根據有關報道，也可進行簡易的藥敏試驗，方法如下：無菌取病死畜禽的部分肝、脾等組織，按1：5加生理鹽水研磨制成懸液，靜置5分鐘，用無菌吸管吸懸液，加兩滴于營養瓊脂板上，涂布均勻，5分鐘后貼上藥敏試紙，培養、觀察抑菌圈大小。 4、對于部分營養需求較高的細菌或微生物，如鏈球菌和支原體，臨床上較難培養，限制了藥敏試驗的應用。 5、部分養殖場或基層獸醫站缺乏做細菌分離培養和藥敏試驗的意識。絕大多數養殖者或技術人員是在沒有明確微生物學診斷的情況下使用抗菌藥物，養殖場規模越小，細菌培養和藥敏試驗做的越少，有的養殖場輪翻使用多種抗菌藥物而不做細菌培養和藥敏試驗，致使療效不佳，治療時機延誤和藥品的浪費。一些病例用藥前不做藥敏試驗，而是在大量使用多種抗菌藥物療效不明顯時才想起做細菌培養和藥敏試驗，而此時細菌已對多種抗菌藥產生耐藥性。

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