豬繁殖與呼吸綜合征病毒地方株的分離與鑒定

kinki0396

豬繁殖與呼吸綜合征 (Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的豬的一種繁殖障礙與呼吸困難的傳染病。其特征為發病母豬厭食、發熱，懷孕后期發生流產、死胎和木乃伊胎，幼齡仔豬發生呼吸道癥狀[1]。1987年在美國中西部首先發現該病，并分離到病毒，其后在北美、歐洲、亞洲等國家流行。目前該病已在全球范圍內傳播、蔓延[2 3]。我國郭寶清等[4]于1996年首次從暴發流產的胎兒中分離到PRRSV。國內諸多血清學檢測結果表明，該病在我國許多地方已有流行[5]。河南某豬場發生臨床癥狀疑似PRRS的傳染病，用間接ELISA法檢測，呈PRRS抗體陽性。從病豬肺、淋巴結病料中分離到1株疑似PRRSV，并對其進行了一系列的鑒定。
1　材料與方法
1.1　材料
1.1.1　病料　采自河南某豬場疑似 PRRS發病仔豬肺臟及淋巴結。
1.1.2　細胞及血清　細胞系Marc 145、Vero、PK 15均購自中國獸藥監察所；陽性血清購自中國獸藥監察所；陰性血清采自無 PRRS病史豬場的新生仔豬血清，經中和試驗證明為陰性。
1.1.3　主要試劑及試劑盒　RNasin、dNTP、反轉錄 Buffer、M MLV、rTaq酶均購自寶生物(大連)工程有限公司；瓊脂糖為 Sigma公司產品；其他常規試劑均為分析純；UNIQ 10柱式Trizol總RNA抽提純化試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司。
1.1.4　RT PCR引物設計　根據GenBank公布的 PRRSV美洲株 ORF5核苷酸序列，參照文獻[6]自行設計并由寶生物(大連)工程有限公司合成下述一對引物，引物擴增片段長度為 720 bp；上游引物 P1 5′ CTG GAG CCG TGC TAT CAT 3′；下游引物 P2 5′ TCC ATT TCA TGA CAC CTG 3′。
1.2　方法
1.2.1　細胞培養　生長液為含 100 mL/L新生牛血清(NCS)的 RPMI l640培養液；維持液為含 20 mL/L NCS的 RPMI l640培養液。Marc 145、Vero和PK 15細胞均在體積分數為5%的CO2培養箱中
于37 ℃培養至單層后傳代培養。
1.2.2　病料的處理　無菌采集發病仔豬的淋巴結、肺臟、脾臟等組織并剪碎，用 Hanks液研磨并制成 5倍～10倍的乳懸液，反復凍融 3次后，經5 000 r/min離心 30 min，上清懸液用 0.22 μm微孔濾膜過濾后，－20 ℃保存備用。
1.2.3　病毒的分離　將上述處理的病料懸液 1 mL分別接種于長成單層的 Marc 145細胞、Vero細胞和PK 15細胞，37 ℃吸附 1 h，補加維持液至 8 mL，繼續培養 3 d～5 d，反復凍融 3次，收獲培養上清液，同時設參考毒株、正常細胞作為對照。出現典型 PRRSV細胞病變時按上述方法繼續傳代，供進一步檢測備用，連傳5代未出現 CPE者判為陰性。
1.2.4　分離毒的毒價滴定(TCID50)　采用微量法按參照文獻[7]進行，測定其在Marc 145上的 TCID50，結果按 Reed Muench氏法計算。
1.2.5　病毒中和試驗　采用固定病毒
稀釋血清法，按參照文獻[7]進行，并按 Reed Muench氏法計算中和指數。
1.2.6　分離毒的動物回歸試驗　將 107.5TCID50/mL HN株病毒細胞培養液經口鼻途徑接種 30日齡健康豬 2頭，3.0 mL/頭，并設 1頭健康豬接種正常細胞培養物作為陰性對照，隔離飼養，每日測體溫，并觀察其采食、飲水、精神狀況及其他臨床表現，1周左右剖檢觀察其病變。然后分別采集接種豬和陰性豬的肺臟、淋巴結等組織，用作 PCR檢測。
1.2.7　RT PCR鑒定
1.2.7.1　病毒基因組總 RNA的提取　按總 RNA抽提純化試劑盒說明提取。
1.2.7.2　反轉錄(RT)　0.8 μL MgCl2(25 mmol/L)、4.0 μL 反轉錄buffer (5×)、2 μL：dNTP (10 mmol/L)、1.0 μL P1 (25 pmol/L)、1.0 μL P2
(2 5 pmol/L)、1.0 μL RNasin(40 U/μL)、9.2 μL 總 RNA，然后置于 PCR儀上 65 ℃ 15 min后，加入 M MLV(5 U/μL)
1.0 μL，最后
于42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min結束反應。
1.2.7.3 　PCR反應　 1.4 μL MgCl2(25 mmol/L)、4.0 μL buffer(10×)、0.6 μL rTaq酶(5 U/μL)、10 μL模板 cDNA，置于 PCR儀中擴增。反應參數為：95℃ 5 min； 94 ℃ 1 min，55 ℃
30 s，72 ℃ 1 min，共進行 35個循環；最后72 ℃ 10 min。結束后將 PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
2　結果
2.1　病毒分離
將過濾后的病料懸液接種于 Marc 145細胞，盲傳前 3代未出現CPE，至第 4代后開始出現規律性CPE，在 24 h～36 h出現約70%的CPE。病變特征為細胞折光性增強、變圓、膨大，部分細胞緊縮呈索狀隨后皺縮、脫落、形成大片空洞，與 PRRSV典型CPE相符。此毒株接種 Vero細胞和PK 15細胞不出現 CPE，判為陰性(圖1)。

2.2　PRRSV分離株TCID50測定結果
按Reed Muench法計算距離比得出 TCID50結果為10 6.50/0.1 mL，即 PRRSV分離株在 Marc 145細胞上的增殖毒價為 107.5TCID50/mL。
2.3　中和試驗結果
按 Reed Muench法計算可知，PRRSV標準陽性血清對分離病毒株的中和效價為 1∶24，即 1∶24稀釋的陽性血清可保護 50% Marc 145細胞不產生CPE。中和試驗結果表明，PRRSV標準陽性血清能抑制該分離毒在 Marc 145細胞上增殖，此分離病毒是 PRRSV。
2.4　動物回歸試驗結果
將病毒細胞培養液經口鼻接種 30日齡健康仔豬后 2 d左右，仔豬開始出現體溫升高，并出現輕度的呼吸困難、四肢末梢供氧不足、耳尖發紫等癥狀。1周左右將接種豬剖檢未見明顯的病理變化，僅見肺部邊緣有少量的出血點，有時可觀察到間質性肺炎。而對照豬則無異常變化。
2.5　RT PCR擴增和鑒定結果
從分離的PRRSV分離株細胞培養物以及攻毒仔豬后所采取的肺臟、淋巴結等組織進行總RNA的提取，并用設計的針對 PRRSV美洲株 ORF5所設計的引物進行 RT PCR反應，產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明，前兩種材料均可擴增出 720 bp大小的條帶，與預期結果相符(圖2)。
1.DNA 標準 DL 2 000；2.病料上清懸液 RT PCR 產物；3.接種豬組織懸液 RT PCR 產物；4.對照豬組織懸液 RT PCR 產物(陰性對照)
3　討論
PRRS是 1987年發現的一種新的豬病毒病。臨床上病豬表現精神沉郁、發熱、厭食及呼吸困難。母豬流產、死胎、不孕、假孕及產出弱仔，公豬性功能下降[1]。目前 PRRS已呈世界性分布，在我國也廣泛存在。從 1996年初，我國郭寶清等首次從國內疑似PRRSV感染豬群檢出 PRRSV抗體并分離出 PRRSV起，PRRS在我國的流行范圍越來越廣，血清陽性率也呈上升趨勢，在我國的許多省、市(地區)已經分離到很多地方株[4]。
PRRSV為動脈炎病毒科病毒，其有著嚴格的宿主范圍，在常見的原代和傳代細胞中不能生長，在體外培養中，能在豬原代肺泡巨噬細胞、CL2621、MA104系的克隆株 Marc 145生長增殖[8]。本試驗將處理后的病料懸液接種在 Marc 145上連續傳代后即出現明顯的細胞病變，而將其接種在Vero、PK 15細胞則連續傳 5代都不出現CPE，與有關文獻[9]報道相一致。
目前，PCR方法已被廣泛應用于PRRS臨床樣品的檢測，檢測的目標通常是針對PRRSV基因組ORF7、ORF6或ORF1b[10]。已報道這種方法可以直接檢測 PRRSV感染的病豬血清、精子、流產胎兒的病理組織及感染的肺泡巨噬細胞等。本試驗根據PRRSV美洲株ORF5基因設計的一段引物，通過RT PCR反應能特異性擴增出 PRRSV HN株的ORF5基因片段，且證明建立的RT PCR方法完全可以檢測病料中的 PRRSV。
　　本試驗從河南某豬場疑似 PRRS發病仔豬的肺臟及淋巴結組織中分離到1株病毒，并進行了分離和鑒定。根據分離病毒株致 Marc 145的特征性病變、動物回歸試驗、毒價滴定、中和試驗以及 RT PCR反應，初步判斷所分離的病毒為 PRRSV。但有關該毒株的其他一些生物學特性尚待進一步鑒定。




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syz

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流星宇

太專業啦，沒有幾個能看懂的啦