內切木聚糖酶的檢測方法

玫香 · 發表于 2007-7-13 14:36:58

最近,看了一些木聚糖酶的資料,關于內切和外切不同的廠家說法不一,附件中為一家公司化驗方法,可能由于來源\底物和化驗方法的不同,檢測結果差異很大,困惑中.......

fjcwr · 發表于 2007-7-14 23:29:29

木聚糖酶的測定方法
1 原理
內切-(1,4)-b-D-木聚糖酶將藍銅礦膠連染色的小麥阿拉伯木聚糖底物分解，產生水溶性染色片斷。這些片斷的釋放速率（590nm條件下的吸光度值的增加）可以直接反應木聚糖酶的活性。
2 試劑
2.1 Xylazyme AX藥片（Megazyme，澳大利亞）
2.2 飼料標準木聚糖酶
通過FFI DNS方法進行測定的標準木聚糖酶儲備液
2.3 0.2mol/l的醋酸緩沖液，pH 4.2
將12g的冰醋酸加到900ml的蒸餾水中，用氫氧化鈉調節pH值至4.2，用蒸餾水定容至1L。
2.4 2%的Trizma溶液（2％）
將20g的Trizma（Sigma，T-1503）溶解至900ml的蒸餾水中，然后用蒸餾水定容至1L，此溶液不需要調整pH值。
2.5 標準木聚糖酶工作液
將標準木聚糖酶儲備液（2.2）加入蒸餾水稀釋，直至最后溶液中木聚糖酶的活性大約在50U/ml。這種溶液不很穩定，因此需要在分析前進行配制。
3 分析方法
3.1 酶的提取
已知添加量的方法
3.1.1 取5只試管，其中4只試管中添加1g左右的飼料樣品（樣品的粉碎粒度應小于1mm），另外一只試管中加入已知活性的酶樣品溶液。另外要進行重復實驗。
3.1.2 按照以下濃度的標準木聚糖酶工作液（2.5）加入到飼料樣品中：
a) 空白（沒有添加）
b) 1U/g
c) 2U/g
d) 3U/g
3.1.3 將一定數量的醋酸緩沖液（2.3）加入到飼料樣品中，使其總體積達到10ml，在室溫的條件下搖動試管10min。
3.1.4 在3500 rpm條件下離心10min。
標準曲線方法
在這種方法中，標準曲線在1周之內可以使用。但是如果樣品中含有干擾成分，則測定的方法受到影響。
3.1.1b 建立標準曲線，通過在1g不含有酶制劑的“控制日糧”中添加已知濃度的標準木聚糖酶工作液。這種方法應該采用不同的日糧進行重復。
3.1.2b 稱取1g飼料和1g參照飼料到離心管中，樣品的粉碎粒度應小于1mm。另外要進行重復實驗。
3.1.3b將10ml的醋酸緩沖液（2.3）加入到飼料樣品中，在室溫的條件下搖動試管10min。
3.1.4 在3500 rpm條件下離心10min。
3.2 分析方法
3.2.1 吸取0.1ml的上清液加入到試管中，試管中含有0.4ml的醋酸緩沖液（2.3），混勻。另外一個試管中加入0.5ml的醋酸緩沖液作為對照組。
3.2.2 在每個試管中加入一個Xylazyme AX藥片（2.1），在50℃條件下反應1h，反應期間不需要攪動。
3.2.3 加入5ml的Trizma溶液（2.4）停止反應，在渦旋振蕩器上振蕩。
3.2.4在室溫下放置5min，然后振蕩一次。
3.2.5 在4500的條件下離心5min。
3.2.6用空白溶液作為空白，在590nm的條件下測定溶液的吸光度值。
4 結果計算
4.1a 已知添加量方法
計算所有重復的平均吸光度值。每個飼料樣品可以根據4個吸光度值計算出一個回歸曲線，Y軸為溶液的吸光度值，X軸為酶的活性，直線的斜率“S”和在Y軸上的截距“I”也可以計算求出。
飼料樣品中的木聚糖酶的活性可以根據以下的公式計算出來：
木聚糖酶的活性（U/kg）＝I/S×1000
4.1b 標準曲線方法
計算所有重復的平均吸光度值。每個飼料樣品可以根據4個吸光度值計算出一個回歸曲線，X軸為吸光度值，Y軸為溶液中酶的活性。
直線的斜率“S”和在Y軸上的截距“I”也可以計算求出。
計算樣品的平均吸光度值，木聚糖酶的活性按照以下的公式計算：
木聚糖酶活性（U/kg）＝（A×S＋I）/W×1000
A：樣品的平均吸光度值
S：標準曲線的斜率
I：標準曲線的截距
W：樣品的重量