歐洲型PRRSV RT­PCR檢測方法的建立及ORF7基因序列比較____騰駿藥業

kinki0396

摘　要：根據PRRSV(LV株)ORF7基因設計一對引物，建立了歐洲型PRRSV的RT PCR檢測方法。通過對50份組織病料檢測及其ORF7基因序列分析，結果表明，有4份組織病料擴增出歐洲型PRRSV 576 bp特異性片段，陽性率為8%，其ORF7基因序列和氨基酸推導序列與歐洲型PRRSV弱毒疫苗株(AMERVAC PRRS)的同源性分別在99.0%～99.7%和98.5%～100%之間，而與標準毒株(LV)的同源性分別在95.9%～96.6%和96.9%～97.7%之間。表明該PT PCR體系適合組織病料中歐洲型PRRSV的直接檢測，同時也證實了歐洲型PRRSV在我國的存在，并且與疫苗株之間具有較高的同源性。
關鍵詞：歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征；逆轉錄
聚合酶鏈反應；ORF7基因  
PRRSV屬尼多病毒目(Nidovirales)動脈炎病毒科(Arteriviridae)成員，為一種有囊膜單股正鏈RNA病毒，是引起豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS)的主要病原。1991年荷蘭科學家從患有母豬繁殖障礙癥狀的病豬中分離到PRRSV[1]，郭寶清等也成功分離出PRRSV[2]。目前，根據PRRSV的不同來源地及其核苷酸序列的差異，將其分為美洲型與歐洲型[3]。已建立了美洲型PRRSV的RT PCR檢測方法[4 7]，但針對歐洲型PRRSV的檢測少見報道。
PRRSV基因組不分節段，大小為15 kb左右，含有8個開放閱讀框(ORFs)，ORF2 7編碼其結構蛋白，其中ORF7基因(大小為387 bp)編碼核衣殼蛋白(N)[3]，該蛋白具有強免疫原性，可作為PRRSV血清學診斷中首選的抗原蛋白[8]，在研究該病毒中具有重要的意義。本研究旨在建立組織病料中歐洲型PRRSV的RT PCR直接檢測方法，并通過歐洲型PRRSV弱毒疫苗株(AMERVAC PRRS)與臨床樣品中ORF7基因序列比較，進一步了解浙江省PRRSV流行情況。
1　材料與方法
1.1　PRRSV疫苗毒株
歐洲型PRRSV疫苗毒株AMERVAC PRRS(批號：2G0C 2)(簡稱PRRSV EU)，杭州市畜牧獸醫局惠贈，主要用于RT PCR體系的建立和陽性對照。
1.2　臨床組織病料的采集與保存
采集浙江省寧波地區養豬場不同疑似PMWS豬的肺、肝、脾、扁桃體和淋巴結等組織，共50份。置－20 ℃冷凍保存備用。
1.3　主要試劑
反轉錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、Taq DNA polymerase均購自北京鼎國生物技術中心；dNTP Mix購自上海申能博彩生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司。
1.4　引物設計與合成
根據GenBank中PRRSV標準毒株(LV)ORF7基因序列(參考序列為M96262)設計了一對引物，可擴增出約576 bp的基因片段，其中包括完整的ORF7基因。以上引物由上海英駿生物技術有限公司合成。引物序列為：上游N eu(20 bp) GAGCATACGCTGTGAGAAAG；下游N(21 bp)：TCGCCCTAATTGAATAGGTGA。
1.5　PRRSV EU以及組織病料中總RNA的提取
分別取勻漿組織病料2 g和PRRSV EU 1 mL，反復凍融3次。12 000 r/min離心16 min，取300 μL上清液，用Trizol RNA試劑盒提取總RNA，備用。
1.6　RT PCR
1.6.1　反轉錄(RT)　在1.5 mL離心管中分別加入9 μL總RNA,1 μL下游引物N和0.5 μL RNase抑制劑；65 ℃加熱10 min，
迅速置冰上10 min；按順序加入以下試劑：4 μL 5×RT 緩沖液，0.5
μL RNase抑制劑，2
μL DTT,2 μL dNTP,1 μL反轉錄酶；42 ℃孵育1 h；90 ℃作用5 min。
1.6.2　PCR　PCR反應總體積為30 μL，其中雙蒸水20.4 μL,10×buffer 3 μL，dNTP 0.6μL，上游引物N eu 1.6 μL，下游引物N 0.6 μL，cDNA模板3 μL，Taq DNA polymerase 0.8 μL。按下列程序進行PCR反應：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s,61 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,25個循環；72 ℃延伸7 min。PCR產物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。
1.7　ORF7測序及同源性比較
分別將PRRSV EU、組織病料的PCR擴增產物割膠回收，分別通過T A克隆、測序獲得ORF7基因序列。采用DNA Star軟件對ORF7序列進行比較。
2　結果
2.1　歐洲型PRRSV核酸的特異性RT PCR檢測
應用上述引物和反應體系，對PRRSV EU、美洲型PRRSV疫苗毒株、豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細小病毒和豬圓環病毒進行RT PCR或PCR擴增，結果僅歐洲型PRRSV疫苗毒株能擴增出約576 bp的特異性片段(圖1)，與預期結果相符。而其他病毒無任何擴增片段。
2.2　RT PCR檢測組織樣品
所建立的RT PCR體系用于50份組織樣品的檢測，其中4份可擴增出預期的576 bp的特異性片段(圖2)。檢測為陽性的組織樣品分別命名為N 34、N 42、N 45、N 57。

  

M.DNA標準DL 2 000；1.PRRSV EU；2.美洲型PRRSV疫苗毒株；3.豬瘟病毒；4.豬偽狂犬病病毒；5.豬細小病毒；6.豬圓環病毒；7.陰性對照
M.DNA Marker DL2 000；1.PRRSV EU；2.PRRSV American type vaccine strain；3.CSFV；4.PRV；5.PPV；6.PCV；7.Negative control

圖1　歐洲型PRRSV核酸的特異性RT PCR檢測

Fig.1　Specificity of RT PCR detection of European type PRRSV nucleotide

  

  

M.DNA標準DL 2 000；1～4.PRRSV歐洲型陽性(4/50)； 5.陰性對照
M.DNA Marker DL2 000；1 4.Positive European type PRRSV
(4/50)；5.Negative control

圖2　RT PCR檢測組織樣品

Fig.2　Detection of tissue samples by RT PCR

2.3　ORF7基因同源性比較
基因序列和氨基酸推導序列比較(表1)，結果表明，4份陽性組織病料與PRRSV EU的ORF7基因序列及推導的氨基酸同源性分別在99.0%～99.7%和98.5%～100%之間，而與LV參考毒株(M96262)的ORF7基因序列及推導的氨基酸同源性分別在95.9%～96.6%和96.9%～97.7%之間。由此推知，4份陽性組織病料中歐洲型PRRSV與PRRSV EU親緣關系較近，而與LV參考毒株(M96262)親緣關系較遠。測序結果表明(圖3)，

  

表1　PRRSV歐洲型部分核苷酸序列(上側)及推導氨基酸序列(下側)同源性比較

Table 1　Percentage of
European type PRRSV
nucleotide sequence homology(upper diagonal) and percentage of European type PRRSV amino acid sequence homology(lower diagonal)

Nucleotide amino	PRRSV EU	N 34	N 42	N 45	N 57	M96262
PRRSV EU		99.7	99.7	99.5	99.0	96.4
N 34	100.0		100.0	99.7	99.2	96.6
N 42	100.0	100.0		99.7	99.2	96.6
N 45	99.2	99.2	99.2		99.5	96.4
N 57	98.5	98.5	98.5	99.2		95.9
M96262	97.7	97.7	97.7	96.9	96.2

圖3　ORF7基因的序列比較

Fig.3　Sequencing and analysis of the ORF 7 gene  

N 34、N 42與PRRSV EU相比較，對應的堿基突變位點為第255位；N 45與PRRSV EU相比較，對應的堿基突變位點為第113位和第255位；N 57與PRRSV EU相比較，對應的堿基突變位點為第19位、第113位、第189位和第255位。
3　討論
自1996年以來，我國規模化養豬場大多經歷了由PRRSV引起的“流產風暴”，表現為妊娠母豬的晚期流產、產弱仔、產死胎和木乃伊胎，哺乳仔豬和保育仔豬的死亡率高，造成了極大的經濟損失[9]。之后，我國有很多豬場開始使用PRRSV弱毒活疫苗，目前僅有勃林格生產的美洲型PRRSV毒株弱毒活疫苗在我國農業部正式注冊使用，但Hipra Laboratories生產歐洲型PRRSV毒株弱毒活疫苗也在我國部分豬場使用。PRRSV弱毒疫苗的安全性還存在爭議。研究表明，在選擇性壓力的作用下，弱毒疫苗毒株會發生返祖現象，變為強毒株，從而造成PRRS的暴發[10]。1996年，丹麥經PRRS弱毒疫苗免疫的豬群暴發PRRS證實了這一點[10]。用RT PCR方法對丹麥某豬場的組織病料進行檢測，通過對病毒核苷酸序列ORF2 ORF7的分析發現，其序列與VR2332序列的同源性在99.2%～99.5%之間，而VR 2332株為丹麥所使用的弱毒苗的祖代毒株[11]。因此，流行于丹麥的美洲型PRRSV可能與美洲型弱毒疫苗株的散播和毒力返祖有關。盡管我國還未見歐洲型PRRSV分離株的報道，但從本研究檢測的結果分析，在我國一些地區的豬場可能已存在歐洲型PRRSV，但關于它的來源及其擴散和感染性有待進一步深入研究。
本研究在建立歐洲型PRRSV的RT PCR檢測方法的基礎上，測序分析歐洲型PRRSV浙江毒株ORF7基因，分析結果表明，組織病料中4份歐洲型PRRSV毒株與歐洲型PRRSV疫苗株(AMERVAC PRRS)的核酸序列具有高度同源性(99.0%～99.7%)，推測病料中檢測出的歐洲型PRRSV可能來源于歐洲型PRRSV疫苗株。但從組織病料中檢測出的歐洲型PRRSV毒株是否為強毒株？目前浙江省內有無該歐洲型PRRSV強毒株流行？都有待于進一步的研究。