綠色添加劑溶菌酶及其應用

文峰 · 發表于 2007-9-9 20:47:07

溶菌酶（lysozyme，ec3.2.1.17）又稱細胞壁質酶（muramidase）或n-乙酰胞壁質聚糖水解酶（n-acetylmuramideglycanohydralase）。1922年英國細菌學家a.fleming發現人的唾液、眼淚中存在有溶解細菌細胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名為溶菌酶。此后在人和動物的多種組織、分泌液及某些植物、微生物中也發現了溶菌酶的存在。隨著研究的不斷深入，發現不僅有溶解細菌細胞壁的溶菌酶，還有作用于真菌細胞壁的種類，同時對其作用機制也有了更進一步的了解。近幾年，人們根據溶菌酶的溶菌特性，將其應用于醫療、食品防腐、畜牧及生物工程中，具有一定的應用價值。
　　溶菌酶按其所作用的微生物不同分兩大類，即細菌細胞壁溶菌酶和真菌細胞壁溶菌酶。細菌細胞壁溶菌酶有兩種，一種是作用于β-1，4糖苷鍵的細胞壁溶解酶，另一種是作用于肽“尾”和酰胺部分的細胞壁溶解酶。真菌細胞壁溶菌酶包括酵母菌細胞壁溶解酶和霉菌細胞壁溶解酶。
　　溶菌酶廣泛地分布于自然界中，在人的組織及分泌物中可以找到，動物組織中也有，以雞蛋清中含量最多。其它植物組織及微生物細胞中也存在。根據來源不同，其性質及作用機制略有差異。
　　雞蛋清溶菌酶占蛋清總蛋白的3.4%～3.5%，作為溶菌酶類的典型代表，是目前重點研究的對象，也是了解最清楚的溶菌酶之一。它由18種129個氨基酸殘基組成，具有4個s-s鍵，分子量為14000，等電點為11.1，最適溫度為50℃，最適ph值為6～7，其化學性質非常穩定，在ph1.2~11.3范圍內劇烈變化時，結構仍穩定不變。遇熱也很穩定，在ph4～7、100℃處理1min不失活，是一種穩定的堿性蛋白質，但在堿性條件下對熱穩定性較差。
　　其它鳥類如鵪鶉、珍珠雞、火雞等的蛋清中也分離純化出溶菌酶，與雞蛋清溶菌酶活性非常相似，也由129個氨基酸組成，雖排列順序有所不同，但活性部位的氨基酸排列則大體相同。
　　人溶菌酶存在于眼淚、唾液、鼻粘液、乳汁等分泌液以及淋巴腺、白血球、肝、腎、淋巴組織中，1ml眼淚中含7mg溶菌酶，1ml乳汁中含0.1～0.5mg。人溶菌酶由130個氨基酸殘基組成，有4個s-s鍵，分子量為14600，其溶菌活性比雞蛋清溶菌酶高3倍。
　　對于哺乳動物溶菌酶，目前已從牛、豬、貓、兔、猴、馬、羊等動物的乳汁中分離出溶菌酶，其化學性質與人溶菌酶相似，但結構尚不清楚，其溶菌活性也遠低于人溶菌酶約3000倍。曾林（1999）采用瓊脂平板法測定家兔初乳溶菌酶含量。結果表明：初乳溶菌酶含量為（7.96±2.01）μg/ml，常乳溶菌酶含量（5.01±1.32）μg/ml。人及哺乳動物溶菌酶的作用機制與雞蛋清溶菌酶相同。
　　目前已從木瓜、無花果、蕪菁、大麥等植物中分離出溶菌酶，其分子量較大，約為24000~29100。植物溶菌酶對溶壁小球菌的溶菌活性不超過雞蛋清溶菌酶的1/3，但對膠體狀甲殼質的分解活性則是雞蛋清溶菌酶的10倍。周澤文（1994）從菜心分離溶菌酶表明，酶比活力達3414.6u/mg，純化倍數為197.4。菜心溶菌酶在較寬的溫度和ph植范圍內均有活性，最適溫度為60℃，最適ph值為5.8。高向陽（1997）研究了蘿卜溶菌酶對白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿3種革蘭氏陽性菌和變形菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌、多殺巴斯德氏桿菌、雛白痢沙門氏菌、產氣桿菌6種革蘭氏陰性菌及釀酒酵母、總狀毛霉、黑根霉、黑曲霉、青霉5種真菌的抑菌效果。同時還研究了蘿卜溶菌酶對白菜軟腐病菌、柑橘潰瘍病菌、番茄青枯病菌、水稻細條病菌、水稻白葉枯病菌及煙草青枯病菌6種植物病原細菌的抑菌效果。試驗證明：蘿卜溶菌酶對上述參試的菌種都有不同程度的抑菌作用。
　　目前微生物產生的溶菌酶分為7類：①內n-乙酰已糖胺酶，此酶同于雞蛋清溶菌酶，破壞細菌細胞壁肽聚糖中的β-1，4糖苷鍵；②酰胺酶，切斷細菌細胞壁肽聚糖中nam與肽“尾”之間的n-乙酰胞壁酸-l-丙氨酸鍵；③內肽酶，使肽“尾”及肽“橋”內的肽鍵斷裂；④β-1，3、β-1，6葡聚糖酶和甘露聚糖酶，此酶分解酵母細胞的細胞壁；⑤殼多糖酶，與葡聚糖酶共同作用，可分解霉菌和酵母；⑥磷酸甘露糖酶，與葡甘露糖酶共同作用，可分解原生質；⑦脫乙酰殼多糖酶，主要分解毛霉和根霉。
　　該酶是一種特異性的酶，由噬菌體感染、誘導產生，但未被感染的宿主細胞上不存在該酶。
　　溶菌酶是一種能水解粘多糖的堿性水解酶，此類粘多糖是細菌細胞壁的主要成分之一，該酶能催化水解細胞壁中的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1，4糖苷鍵，使細胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，細菌內容物逸出而使細胞壁溶解。溶菌酶能直接水解革蘭氏陽性菌，在分泌型免疫球蛋白a、補體的參與下，還能水解革蘭氏陰性菌如大腸桿菌等。此外，它還可與各種誘發炎癥的酸性物質結合，使其失活，并能增強抗生素和其它藥物的療效，改善組織基質的粘多糖代謝，從而達到消炎、修復組織的目的。
　　梁愛華（2001）考察在不同溫度下雞蛋清溶菌酶與β-內酰胺類抗生素聯合應用對大腸埃希氏菌的生長及內毒素釋放的影響。結果：在不同的培養溫度下，氨芐西林或頭孢噻肟50μg/ml均可導致細菌溶解，并誘導escherichiacoli釋放大量的內毒素到培養上清液中，這些培養上清液在體外培養的巨噬細胞上可誘導大量的腫瘤壞死因子（tnfα）和白細胞介素6（il-6）產生。而雞蛋清溶菌酶與β-內酰胺類抗生素聯合使用能阻止細菌溶解，降低細菌內毒素的釋放，并減少巨噬細胞tnf-和il-6的產生。
　　溶菌酶能與帶負電荷的病毒蛋白直接作用，與dna、rna、脫輔基蛋白形成復鹽，使病毒失活。該酶也可以預防和治療病毒性肝炎，尤其對輸血后肝炎及急性肝炎的效果較為顯著。在機體內它還有抗流感病毒的活性，其與膽酸鹽的復合物能強烈抑制流感病毒和腺病毒的生長，并能防止皰疹性病毒感染。
　　溶菌酶作為機體非特異免疫因子之一，參與機體多種免疫反應，在機體正常防御功能和非特異免疫中，具有保持機體生理平衡的重要作用。可改善和增強巨嗜細胞吞噬和消化功能，激活白細胞吞噬功能，并能改善細胞抑制劑所導致的白細胞減少，從而增強機體的抵抗力。
　　溶菌酶還具有激活血小板的功能，可以改善組織局部血液循環障礙，分泌膿液，增強局部防衛功能，從而體現其止血、消腫等作用。它還可以作為一種宿主抵抗因子，對組織局部起保護作用。
　　溶菌酶在嬰兒體內可以直接或間接促進嬰兒腸道細菌雙歧乳酸桿菌的增殖，促進嬰兒消化吸收，可以促進人工喂養嬰兒腸道細菌的正常化；能夠加強血清滅菌蛋白（properdin），γ-球蛋白（γ-globulin）等體內防御因子對感染的抵抗力，特別對早產嬰兒有防御體重減輕、預防消化器官疾病、增進體重等功效。
　　細菌的細胞壁由胞壁質組成，胞壁質是由n-乙酰氨基葡萄糖（n-acetylglucosamine）及n-乙酰胞壁酸（n-acetylmuramicacid）交替組成的多聚物，胞壁酸殘基上可以連接多肽，稱為肽聚糖（peptidoglycan）。肽聚糖是細菌細胞壁的主要成分，它是由nam、nag和肽“尾”（一般是4個氨基酸）組成，nam與nag通過β-1，4糖苷鍵相連，肽“尾”則是通過d-乳酰羧基連在nam的第3位碳原子上，肽尾之間通過肽“橋”（肽鍵或少數幾個氨基酸）連接，nam、nag、肽“尾”與肽“橋”共同組成了肽聚糖的多層網狀結構，作為細胞壁的骨架，上述結構中的任何化學鍵斷裂，皆能導致細菌細胞壁的損傷。溶菌酶能有效地水解細菌細胞壁的肽聚糖，其水解位點是n-乙酰胞壁酸（nam）的1位碳原子和n-乙酰葡萄糖胺（nag）的4位碳原子間的β-1，4糖苷鍵，結果使細菌細胞壁變得松弛，失去對細胞的保護作用，最后細胞溶解死亡。
　　對于g+細菌與g-細菌，其細胞壁中肽聚糖含量不同，g+細菌細胞壁幾乎全部由肽聚糖組成，而g-細菌只有內壁層為肽聚糖，因此，溶菌酶只能破壞g+細菌的細胞壁，而對g-細菌作用不大。