準確測定和表征β-葡聚糖酶活的方法與比較

jancie_wuhan

準確測定和表征β-葡聚糖酶活的方法與比較
1. β-葡聚糖酶的應用及作用機理
β-葡聚糖作為植物細胞壁的結構性非淀粉多糖，廣泛存在于燕麥、大麥、黑麥、小麥等麥類作物中。如圖1 所示，常見麥類作物中，燕麥和大麥β-葡聚糖含量較高，其中燕麥含量最高(Choct M andAnnison G.,1990)。在飼料、啤酒等行業中，由于β-葡聚糖是限制麥類有效利用的主要因素，常使用β-葡聚糖酶來有效分解麥類植物胚乳細胞壁中的β－葡聚糖，以降低飼料中非淀粉多糖（Non-Starch Polysaccharide,NSP）及其抗營養因子的含量；降低啤酒釀造中麥汁黏度，提高麥芽溶出率，穩定啤酒質量。

圖1 常見麥類作物中β-葡聚糖含量
   
β-葡聚糖酶是具有β-(1→3)、(1→4)糖苷酶活性的專一性內切酶。圖2示出β-葡聚糖的基本結構以及酶切作用的機理。其中，每個實心圓表示一個葡萄糖分子，實心圓之間連線表示糖苷鍵，箭頭所示為酶切位點。從圖中可以看到，葡萄糖分子之間通過β-(1→4)糖苷鍵形成結構單體(monomer)：包括纖維三糖(cello-trisaccharide)、纖維四糖(cello-tetrasaccharide)和極少量的低聚糖(cello-oligosaccharide)，同時結構單體之間通過β-(1→3)糖苷鍵連接從而形成β-葡聚糖線性結構。當β-葡聚糖酶作用于β-葡聚糖的β-(1→3)、β- (1→4)糖苷鍵時，可使糖苷鍵斷裂，將其降解成寡糖和單糖。

圖2 β-葡聚糖分子結構圖和酶切位點示意圖

2. 測定β-葡聚糖酶活性的標準方法
  β－葡聚糖酶活的測定方法主要有3種，即還原糖測定法（分光光度法）、粘度測定法和底物染色法。其中還原糖測定法（分光光度法）簡便實用，比較準確，而且測定的結果重復性好，對于β－葡聚糖酶活的測定，一般認為是其3種方法中的首選方法；粘度測定法雖然更接近酶和底物在動物體內的作用方式，但這種方法目前僅能進行半定量描述，而且測定時比較繁瑣費時；底物染色法是一種新型的方法，它是通過對底物的人工著色，然后測定顏色的變化來計算酶活，但這種方法難以操作，目前還沒有得到廣泛應用（王在貴等，2002）。
   目前國內外采用較多的還是還原糖測定法（分光光度法），其原理是：β-葡聚糖酶能將β-葡聚糖降解成寡糖和單糖，具有還原性末端的寡糖和有還原基團的單糖在沸水浴條件下可以與DNS試劑發生顯色反應。由于反應液顏色的強度與酶解產生的還原糖量成正比,而還原糖的生成量又與反應液中β－葡聚糖酶的活力成正比，因此，可以通過分光比色測定反應液顏色的強度，從而計算反應液中β－葡聚糖酶的活力（農業部標準，NY/T 911-2004）。
3. β-葡聚糖底物的選擇對β-葡聚糖酶活測定的影響
雖然各類作物中β－葡聚糖的含量不同，但分子結構都是相似的，即葡萄糖以β-(1→3)和β-(1→4)鍵相連的線性聚合物，不同點僅僅在于主要結構單體的纖維三糖和纖維四糖的比例不同，即β-(1→3)和β-(1→4)兩種糖苷鍵的比例不同 (Susan M et al.,2004)。那么，選用不同作物來源的β-葡聚糖作底物對酶活測定有沒有影響呢？
從酶的作用機理來看，β-葡聚糖酶的酶切作用只對糖苷鍵的鍵型有選擇性，即專一性針對β-(1→3)和β-(1→4)鍵，而對糖苷鍵的比例沒有選擇性。
另外，根據β－葡聚糖酶活單位的國際定義：在pH5.0、40℃條件下，每分鐘從β－葡聚糖底物溶液中降解釋放1μmol還原糖（表示為還原糖當量）所需要的酶量為一個酶活單位，簡稱為U，我們可以看到，國際定義中是通過測定由酶分解底物產生小分子還原糖的量還原糖當量來計算樣品酶活的。因此，不管這種β-葡聚糖來源于哪一種麥類作物，只要底物越純、低聚合度小分子糖類含量越少，即能準確的表征β-葡聚糖酶活（王在貴等，2002）。
4. 百特純（Putus Macromolecular Sci & Tech Ltd.）生產的β-葡聚糖的特點以及在酶活測定的應用。
有些科研單位和生產企業為了節省經費，采用自制的β－Glucan（大麥提取）作底物，雖然效果也還好，但不宜作為最終產品的驗證試劑。目前國內外能提供β-葡聚糖純品的公司較少，僅有的幾種產品售價偏高，例如Sigma、Merck公司的大麥β-葡聚糖平均售價在3500-4000元/g左右，無疑增加了β-葡聚糖酶產品成本，限制了其廣泛應用。
百特純大分子科技有限公司（Putus Macromolecular Sci.&Tech..Ltd）是主要從事碳水化合物大分子領域新品研發及應用的國際公司，制造并提供高質量、高純度、高均一性的具有特定分子量和支化度的碳水化合物大分子標準品及其相關產品。公司采用β-葡聚糖含量最高的燕麥作為原料，提供的燕麥β-葡聚糖純品（PS-OBG）純度高達97%以上，并且擁有高、中、低三種不同規格分子量，不含淀粉、蛋白質等雜質，水溶性好，穩定性高，是作為β-葡聚糖酶活測定的良好底物，而且價格在市場上具有較強的競爭優勢。
百特純大分子（武漢）科技有限公司
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參考文獻：
1、Choct M., Annison G. Anti-nutritive activity of wheat pentosans inbroiler diets [J]. British Poultry Science, 1990, 31:811-822.
2、SusanM., Yolanda B., Peter J., Wang Q., John W. Evaluation of Structure inthe formation of gels by structurally diverse (1→3)(1→4)-β-D-glucansfrom four cereal and one lichen species[J]. Carbohydrate Polymers,2004, 57:249-259
3、王在貴,何瑞國,張宏福.飼用β－葡聚糖酶活力測定需注意的幾個問題[J].飼料廣角, 2002,(08)
4、農業部標準：農業部2006105172955906, «飼料添加劑», β一葡聚糖酶活力的測定, 分光光度法, Determinationof β-glucanase activity in feed additives —Spetrothoetric method,2005-01-04 發布, 2005-02-01 實施

[ 本帖最后由 jancie_wuhan 于 2007-10-30 17:00 編輯 ]

southmigrant

Sigma不是有一種Dextran的葡聚糖嗎？也還比較便宜，能作為底物嗎？

jancie_wuhan

你說的Dextran跟β－葡聚糖的結構是不同的，它是一種葡萄糖以α（1-6）為主鏈，α（1-3）或α（1-4）、α（1-2）為支鏈相連接的多聚糖，而β－葡聚糖是葡萄糖以β-(1→3)和β-(1→4)鍵相連的線性聚合物。由于β－葡聚糖酶是具有β-(1→3)、(1→4)糖苷酶活性的專一性內切酶，所以在測定酶活時，底物應該選擇相應的β－葡聚糖。