PXF與黃芩白術(shù)對(duì)LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)小鼠的保胎作用

貔貅

PXF與黃芩白術(shù)對(duì)LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)小鼠的保胎作用 及子宮內(nèi)IL-10含量的變化研究 鐘秀會(huì)，史萬(wàn)玉，宮新城，翟向和，張鐵，李紹華，褚素敏 （河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定 071001）

摘要：本試驗(yàn)用細(xì)菌脂多糖（LPS）尾靜脈注射（每鼠0.1μg），誘導(dǎo)昆明小鼠流產(chǎn)，ELISA（酶聯(lián)免疫）方法測(cè)定子宮勻漿中IL-10（白細(xì)胞介素-10）的含量。發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)小鼠子宮內(nèi)IL-10含量降低。PXF或黃芩白術(shù)顯著抑制LPS的作用，使母鼠胚胎吸收率降低，子宮中IL-10含量回升。試驗(yàn)結(jié)果表明，PXF或黃芩白術(shù)的保胎作用與上調(diào)子宮胎兒界面Th2細(xì)胞因子IL-10的含量有關(guān)。 關(guān)鍵詞：細(xì)菌脂多糖；PXF； IL-10；中藥；流產(chǎn) 機(jī)體免疫系統(tǒng)能夠成功地排斥異體組織移植物、并有效地清除侵入體內(nèi)的各種病原。那么，胚胎在發(fā)育過程中，由于帶有來(lái)自父體的基因，會(huì)表達(dá)父體抗原。這種帶有一半同種異體抗原的胎兒理應(yīng)受到母體免疫系統(tǒng)的排斥。然而，事實(shí)上正常妊娠的母體對(duì)胎兒并不表現(xiàn)排斥反應(yīng)。這不僅是由于胎盤屏障的保護(hù)作用，更重要的是，在母體胎兒界面產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)因子有保護(hù)胎兒的作用［1］。 盡管如此，妊娠并不象人們所期望的那樣一帆風(fēng)順。哺乳動(dòng)物已著床的胚胎至發(fā)育到正常分娩期間，約有40～60%會(huì)發(fā)生胚胎丟失，其中2/3(約67%)發(fā)生在妊娠早期，這在人和家畜均如此［2］。生殖免疫學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為，這些胚胎丟失或流產(chǎn)與妊娠母體Th1細(xì)胞因子反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)[3]。Th1細(xì)胞因子反應(yīng)以細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)，產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、γ-干擾素（IFN-γ）等細(xì)胞因子為特征，對(duì)妊娠有負(fù)面影響［4］。IL-2，TNF-α，IFN-γ增多，均可導(dǎo)致孕鼠流產(chǎn)［5］。白細(xì)胞介素-10（IL-10）屬Th2細(xì)胞因子，有保護(hù)胎兒、促進(jìn)胎盤生長(zhǎng)等作用［4］。 試驗(yàn)證明，細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)靜脈注射可誘導(dǎo)多種品系的孕鼠流產(chǎn)［6］。并發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)與子宮內(nèi)產(chǎn)生TNF-α有關(guān)［5、6］。LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)(或胚胎吸收)與子宮內(nèi)IL—10含量有何關(guān)系?值得研究。 中藥黃芩白術(shù)配伍，被歷史上金元時(shí)期的名醫(yī)朱丹溪譽(yù)為“安胎圣藥”。許多安胎方劑中均伍用黃芩白術(shù)。其安胎效果已被千百年來(lái)的醫(yī)療實(shí)踐所證明。但從生殖免疫學(xué)角度分析，黃芩白術(shù)在母體子宮與胎兒界面發(fā)揮怎樣的調(diào)節(jié)作用?鮮見前人研究報(bào)道。 本試驗(yàn)用LPS誘發(fā)母鼠流產(chǎn)，ELISA方法測(cè)定子宮勻漿Th2細(xì)胞因子IL~10的含量，從分子免疫學(xué)角度分析了LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)的機(jī)理，以及TNF-α阻斷劑PXF和黃芩白術(shù)的保胎效果。? 1材料和方法? 1.1 試驗(yàn)動(dòng)物? 8周齡~10周齡未經(jīng)產(chǎn)昆明小鼠，常規(guī)飼養(yǎng)，每日光照12h，自由采食和飲水。經(jīng)適應(yīng)環(huán)境1周后，陰道涂片法進(jìn)行發(fā)情鑒定。發(fā)情母鼠與公鼠1：1合籠過夜，次日清晨檢出陰栓者，定為孕0d。 1.2藥物及試劑? LPS，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品(由大腸桿菌制備)。用pH7.4、0.01M的PBS稀釋成0.5μg/ml(PBS經(jīng)細(xì)菌濾器過濾)，置4℃冰箱中備用。 黃芩白術(shù)湯，市售中藥飲片黃芩白術(shù)，按1：1混合，切碎，加自來(lái)水浸泡1h。水煎2次，合并濾汁，濃縮至每ml含生藥1g。? 小鼠IL-10 ELISA測(cè)試盒，美國(guó)Endogen公司產(chǎn)品。? Pentoxifylline(PXF)，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，溶于過濾的PBS（5.75mg/ml）中。? 1.3動(dòng)物分組及處理? 試驗(yàn)分5組（每組動(dòng)物數(shù)見表1）。A、B、C、D組母鼠于孕7d時(shí)尾靜脈注入LPS 0.1μg(0.2ml)，E組注入PBS 0.2ml。B組小鼠于孕5、6、7d各腹腔注射PXF，每鼠每天1.15mg。C組小鼠于孕5、6、7d各灌服黃芩白術(shù)湯1ml。D組小鼠各灌服PBS 1ml(見表1)。所有試驗(yàn)鼠均于孕9d剖殺。 1.4胚胎吸收率(死亡率)和流產(chǎn)率計(jì)算? 發(fā)生吸收或死亡的胚胎體積變小，顏色紫黑，出血壞死，甚者溶化成血團(tuán)塊。尸體解剖鏡下觀察模糊一片，沒有胎膜結(jié)構(gòu)。正常胚胎個(gè)體較大，粉紅色。鏡下觀察胎膜及胎兒輪廊清晰，透光度好、無(wú)出血、瘀血現(xiàn)象。? 胚胎吸收率按下述方法計(jì)算［7］。即：? R/(V+R)×100%? R為被吸收的胚胎數(shù)，V為活的(Viable)胚胎數(shù)。? 流產(chǎn)率=發(fā)生流產(chǎn)的母鼠數(shù)/試驗(yàn)組母鼠總數(shù)×100%? 1.5子宮IL-10的ELISA測(cè)定?孕鼠均于孕9d時(shí)頸椎脫臼致死。每鼠取左側(cè)子宮角的1/2，作為免疫組織化學(xué)染色用（結(jié)果另報(bào)）。取右側(cè)子宮角和左側(cè)子宮角剩余的1/2勻漿。剪除子宮系膜及脂肪，縱向切開子宮角，剝?nèi)ヌ骸＜羲樽訉m角，加入含PMSF(蛋白酶抑制劑)0.75μg/ml的PBS(pH7.6)適量，冰水中勻漿，20000g 4℃離心15min，移取上清液分裝備用。IL-10含量的ELISA測(cè)定按試劑盒說(shuō)明書操作。 各樣品中IL-10的含量以每mg蛋白中所含IL-10的pg數(shù)來(lái)表示。蛋白含量系用UV-754型紫外可見分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)測(cè)定280nm、260nm的OD值，依下列公式計(jì)算而得： 蛋白濃度(mg/ml)=1.45×OD280nm—0.74×OD260nm? 1．6統(tǒng)計(jì)分析? 用t測(cè)驗(yàn)計(jì)算各組間細(xì)胞因子含量的差異顯著性。胚胎吸收率和流產(chǎn)率用X2檢驗(yàn)。? 2結(jié)果? 2.1LPS誘導(dǎo)孕鼠流產(chǎn)的效果? 試驗(yàn)A組，5只孕鼠有1只死胎已全部排出(注射LPS第2d便看到由陰道口排出死胎)，其余4只母鼠子宮內(nèi)胎兒已全部死亡，并開始溶化，呈紫黑色，不易分辨?zhèn)€數(shù)。胚胎吸收率100%。B組小鼠注入PXF，5只孕鼠無(wú)一流產(chǎn)。多數(shù)胚胎存活，僅有少量死胎。胚胎吸收率為15%。C組小鼠灌服中藥，再尾靜脈注射LPS，6只孕鼠有2只發(fā)生流產(chǎn)。其中1只母鼠子宮內(nèi)已無(wú)胎兒。其它母鼠子宮內(nèi)偶見瘀血的死胎。胚胎吸收率35%。與B組相比，差異不顯著。D組用PBS做對(duì)照，5只母鼠有4只流產(chǎn)。胚胎吸收率89%。E組于孕7d尾靜脈注射PBS，5只母鼠均未流產(chǎn)。詳見表1。 2.2IL-10的含量變化? 注射PBS的對(duì)照小鼠，子宮IL-10含量相對(duì)比較恒定，個(gè)體間差異不大。平均值為32.253±8.773pg/mg蛋白。靜注LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)小鼠(A組)，IL-10含量降至很低，為10.959±5.324pg/mg，約為正常值的1/3。B組小鼠事先注入PXF，再注射LPS，IL-10含量接近正常水平。說(shuō)明用PXF阻斷TNF-α的產(chǎn)生，能夠阻止LPS的作用。C組小鼠預(yù)先灌服中藥，IL-10含量水平與PXF處理組相接近。見表2。 ??表1 各處理組小鼠的胚胎吸收率及流產(chǎn)率 妊娠天數(shù) 組別中藥或PXFLPS 靜注流產(chǎn)率（%）胚胎吸收率（%） A（n=5）LPS (7)100(5/5)100(47/47) B (n=5)PXF(5,6,7)LPS (7)0(0/5) *15(11/72)a,b C (n=6)中藥(5,6,7)LPS(7)33(2/6)35(28/79)a,b D (n=5)PBS(5,6,7)LPS(7)80(4/5)89(59/66) E (n=5)PBS (7)0(0/5) *3(2/63)a 注：1胚胎吸收率比較：a;與A組相比P＜0.01；b;與D組比，P＜0.01. 其余組間差異不顯著。?2. 流產(chǎn)率比較?*與A組相比P＜0.05，其余組間差異不顯著。? 表2LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)小鼠子宮IL-10含量 組別12345X+SD A7.6386.9935.54818.91115.70310.959+5.324 B23.09126.94755.77534.37413.23730.685+14.277** C40.71421.08322.92123.83728.67827.447+7.093** D3.64911.80516.30916.3695.15810.664+5.383 E22.72029.96036.40547.09225.08932.253+8.773** 注：IL-10含量為每mg蛋白中的pg數(shù)。**，和A,D組比較, P<0.01 3討論? Gendron等研究發(fā)現(xiàn)，妊娠早期鼠胚對(duì)LPS非常敏感。LPS對(duì)早期孕鼠似乎有部位特異性， LPS處理的小鼠，其它組織不表現(xiàn)任何病變［8］。LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)機(jī)制是通過巨噬細(xì)胞（Mφ）釋放TNF-α，TNF-α直接作用于胎盤血管，導(dǎo)致出血壞死。如TNF-α促使肉瘤組織出血壞死、萎縮消失便是通過這種類似機(jī)制［9］。在早產(chǎn)婦女的羊水中檢出了LPS和TNF-α［10］。用人工重組TNF—α處理大鼠導(dǎo)致胎盤壞死［11］。Tangri等將胎盤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與正常胎盤細(xì)胞相比，即將流產(chǎn)小鼠的胎盤能刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生更多的TNF-α［12］。這些研究資料都表明，TNF-α可導(dǎo)致流產(chǎn)。LPS誘導(dǎo)小鼠胚胎吸收，子宮勻漿中TNF-α含量升高[13]。 用PXF預(yù)先給小鼠腹腔注射，阻止了LPS誘導(dǎo)的胚胎吸收，Th2細(xì)胞因子IL-10上升(表2)。PXF是一種TNF-α合成抑制劑，能夠抑制預(yù)致敏的巨噬細(xì)胞中TNF-α mRNA的表達(dá)和TNF-α的合成[14]，降低LPS和TNF-α以及其它細(xì)胞因子對(duì)中性白細(xì)胞的活化作用［15］。Gendron等用PXF預(yù)先注射母鼠，再用LPS誘發(fā)流產(chǎn)，結(jié)果PXF阻止了子宮中TNF-α的升高(阻斷90%)和胚胎吸收的發(fā)生［8］。Chaouat等也獲得類似結(jié)果，并證明TNF-α和IFN-γ在誘導(dǎo)胎吸收方面有協(xié)同作用［16］。本試驗(yàn)中PXF阻斷了LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)的效果，說(shuō)明LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)與TNF-α有密切關(guān)系。? IL-10屬有益胚胎發(fā)育的細(xì)胞因子，在保護(hù)胎兒免受攻擊方面起著至關(guān)重要的作用［1］。妊娠期間，IL-10進(jìn)行性地下調(diào)IFN-γ。在母體蛻膜組織和/或胎盤中可合成IL-10［1,12］。Chaouat等的試驗(yàn)說(shuō)明了Th2細(xì)胞因子IL—10對(duì)維持正常妊娠的保護(hù)作用：流產(chǎn)小鼠胎盤中IL-10含量低，IFN-γ、TNF-α含量高；非特異性免疫提高了小鼠胎盤IL-10含量和胚胎成活率；人工重組IL-10注射使母鼠胚胎吸收率顯著降低，抗IL-10抗體提高了胚胎吸收率；給小鼠注入羊滋養(yǎng)層蛋白o(hù)TP，減少了胚胎吸收率，同時(shí)小鼠胎盤中IL-10水平上升［16］。Rivera等最近研究發(fā)現(xiàn)，低劑量LPS注射誘導(dǎo)鼠發(fā)生胚胎吸收，而注射外源性IL-10則顯著降低了注射LPS所引起的胚胎吸收率［17］。在人類，用男性白細(xì)胞免疫復(fù)發(fā)性流產(chǎn)婦女，9人中有7人受孕，并正常分娩。測(cè)得IL-2和IFN-γ產(chǎn)生量降低，IL-10分泌量增多，同時(shí)NK、LAK細(xì)胞毒性明顯下降［18］。婦女正常妊娠IL-10水平上升，IL-2和IFN-γ下降。病理妊娠時(shí)IL-10水平低下，而IL-2、IFN-γ水平較高［19］。這些研究資料都說(shuō)明IL-10與正常妊娠的正相關(guān)關(guān)系。IL-10抑制Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF、IFN-γ，IL-1等［12］，可能是維持Th2反應(yīng)和母體妊娠正常的重要途徑。曾有報(bào)道認(rèn)為，LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)與IL-1有一定關(guān)系。用LPS注射使100%小鼠發(fā)生流產(chǎn)，事先注入IL-1受體抗體，則使胎兒死亡率由100%降至30%［20］。本試驗(yàn)中，LPS誘導(dǎo)小鼠胚胎吸收，子宮IL-10水平低于正常，用PXF或中藥保胎，則使IL-10水平回升。說(shuō)明了IL-10在維持正常妊娠中有重要作用。本研究直接測(cè)定了LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)小鼠子宮胎盤組織中IL-10的含量，這一點(diǎn)未見前人報(bào)道。? 黃芩白術(shù)的安胎作用似乎適合于妊娠早期。《本草疏證》這樣論述黃芩白術(shù)的安胎作用，“初妊之時(shí)，胎元未旺，吸血不多，則下焦血旺，氣反上逆，是為惡阻。惡阻則中焦之氣不變赤而為水，是白術(shù)在所必需矣。血盛能致氣盛，氣盛能生火，黃芩泄氣分之火而不傷血者也。”此處“初妊之時(shí)”似指妊娠早期，而“血旺”“血盛”以致于“氣盛生火”，可否理解成胚胎著床期的炎性反應(yīng)階段?黃芩白術(shù)配伍，寒溫并用，補(bǔ)瀉兼顧，似能調(diào)整妊娠初期的炎性反應(yīng)。現(xiàn)代研究認(rèn)為，黃芩傷害肥大細(xì)胞的酶激活系統(tǒng)，抑制過敏性介質(zhì)的釋放，抑制炎性反應(yīng)和毛細(xì)血管通透性［21］。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，子宮肥大細(xì)胞數(shù)量增多與胚胎丟失有密切關(guān)系。本試驗(yàn)結(jié)果觀察到，流產(chǎn)的胎兒有出血瘀血現(xiàn)象，說(shuō)明胎盤組織毛細(xì)血管通透性增大。使用黃芩白術(shù)預(yù)防組(C組)則胎兒生長(zhǎng)正常，顏色粉紅，沒有瘀血現(xiàn)象。白術(shù)作為健脾補(bǔ)氣藥，可增加抗體生成，還可用于治療風(fēng)濕癥。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎屬于細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病。妊娠時(shí)母體免疫系統(tǒng)以Th2反應(yīng)(抗體介導(dǎo)的免疫)為主，細(xì)胞免疫功能受抑制，因而類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀減輕［4］。白術(shù)能夠治療風(fēng)濕癥說(shuō)明可能對(duì)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫有某種抑制作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，PXF和黃芩白術(shù)能夠阻抑LPS誘發(fā)的流產(chǎn)，使子宮內(nèi)IL-10水平上升，從而有利于正常妊娠。?