復方中藥制劑“球寧”對感染柔嫩艾美耳球蟲雛雞血漿

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復方中藥制劑“球寧”對感染柔嫩艾美耳球蟲雛雞血漿 SOD、MDA含量的影響 張 鐵1 王春光1 宮新城1 苑方重1 張國磊1 翟向和1 鐘秀會2*    (1. 河北農業大學中獸醫學院 河北定州 073000 2. 河北農業大學動物科技學院 河北保定 071000 *通訊作者）

摘要：用青蒿、常山等組成復方中藥制劑“球寧”，并對其進行超微粉碎加工成微粉制劑。按不同比例添加于飼料中，飼喂人工感染柔嫩艾美耳球蟲的雛雞，以磺胺喹啉鈉為對照，在感染后第8d剖殺，檢測血漿中SOD、MDA的含量，結果表明，用藥各組與陽性對照組相比均能增加雛雞血漿SOD含量；降低血漿丙二醛（MDA）含量。說明所試中藥可以增加機體清除自由基的能力，減少自由基對機體的損傷，從而保護機體。     關鍵詞：中藥；E.tenella；超微粉碎；SOD； MDA     雞球蟲病是由艾美耳屬球蟲寄生于雞腸道所引起的、最常見的一種原蟲病，呈世界性分布。據Bhoal[1]報道，全世界抗球蟲藥的年消費是33億美元。我國養雞數為30億～60億羽，按郁明發[2]報道的每羽肉仔雞平均耗用抗球蟲藥費為0.2～0.3元估算，我國每年用于雞的抗球蟲藥費用達6億～18億元人民幣。該病多發生于15～50日齡的雛雞，發病率和死亡率均較高。集約化養雞場則是球蟲病暴發的最適宜場所，其發病率為50%～70%，嚴重時高達80%，給養雞業帶來嚴重的經濟損失。     該病主要依靠化學藥物進行防治，但球蟲耐藥性問題給臨床防治帶來很大麻煩[3]。中藥具有毒副作用小和抑殺球蟲、增強雞體免疫功能及促生長等特點，尤其是雞球蟲對其不易產生耐藥性，因而有廣闊的發展前景。將中藥進行超微粉碎后，藥物的吸收率大大提高，減少劑量，可明顯提高制劑的藥效學活性[4]，節省原料，提高效率，降低成本。     近年來，自由基在生物體系中的作用已成為生命科學的研究熱點之一。體內產生的自由基以氧自由基（Oxygen Free Radicals, OFR）為主，約占95%，對機體危害亦最大。在正常的生理狀況下，生物體內的自由基不斷產生，也不斷被清除，維持在低水平的平衡濃度。少量的自由基對機體是有益的，但過量的自由基可對機體造成損傷，是構成很多疾病的病理學基礎。有資料證明，球蟲感染后，雞體內的氧自由基生成反應加劇，說明氧自由基參與了球蟲的致病過程[5，6，7]。     本試驗中用青蒿、常山等組成復方中藥制劑“球寧”，并對其進行超微粉碎加工成微粉制劑，按不同比例添加于飼料中，飼喂人工感染柔嫩艾美耳球蟲的雛雞，分別檢測血漿中MDA、SOD的含量。初步探討球蟲感染和抗球蟲中藥對機體氧自由基變化的關系，進一步闡明中藥抗球蟲機理和為新型抗球蟲藥物的研制提供依據。     1 材料與方法     1.1 試驗動物購自定州市二賢種雞場的1日齡海蘭灰蛋公雛。購進后于無球蟲的消毒鐵絲籠內隔離飼養至23日齡，經糞便檢查，確認無球蟲感染后作為試驗用雞。     1.2 球蟲卵囊     試驗用柔嫩艾美耳（E.tenella）卵囊由中國農業大學動物醫學院寄生蟲室惠贈。孢子化后，用15日齡小雛雞復壯，再經孢子化后，記數，備用。     1.3主要試劑與藥品     試驗所用中藥（青蒿、常山、鴉膽子、硫磺粉、地錦草、仙鶴草、金雞納、黨參、甘草）購于定州市時代藥房；丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物試劑公司，批號：20040227)，超氧化物歧化酶(SOD) 測定試劑盒(南京建成生物試劑公司，批號：20040227)。     1.4主要儀器設備     普通中藥粉碎機；倍力BMF-6型超微粉碎機（濟南倍力粉工程技術有限公司）；UV-9100分光光度計（上海第三分析儀器廠）。     1.5 試驗方法     1.5.1藥物的制備     將青蒿、常山、鴉膽子、硫磺粉、地錦草、仙鶴草、金雞納、甘草8味中藥按一定配比組成復方后，分別經普通粉碎機和超微粉碎機加工粉碎后備用。     普通粉（即粗粉）要求：全部藥物通過80目篩（篩孔直徑177微米）。超微粉碎（即微粉）要求：全部藥物通過625目篩（篩孔直徑20微米）。     1.5.2試驗設計     從經預備期飼養至23日齡的雛雞中選取健康雛雞115只，隨機分為7組，每組15只，稱量記錄體重。分別為不感染不給藥陰性對照組；感染不給藥陽性對照組；感染給西藥組（磺胺喹啉鈉，飲水濃度100ppm）；感染給中藥普通粉碎（2%添加）組；感染給中藥微粉（2%添加）組；感染給中藥微粉（1%添加）組；感染給中藥微粉（0.5%添加）組。并于分組后的次日每組分別經口感染柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊4.0×104個/只，常規飼養，當攻蟲組出現第一堆血便時，開始添加藥物。     1.5.3 盲腸組織病理學檢查     盲腸組織經波恩液（25%的福爾馬林+75%飽和苦味酸飽和溶液）固定48h→70%酒精（2h）→80%酒精（2h）→85%酒精(2h)→90%酒精(2h)→95%酒精(2h)→100%酒精Ⅰ(1h)→100%酒精Ⅱ(1h)→(二甲苯與乙醇的等比溶液)30min→二甲苯20min→二甲苯20min→石蠟Ⅰ30min→石蠟Ⅱ30min→石蠟Ⅲ20min→連續切片4μm，隔3取1，進行HE染色，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察病理組織變化。     1.5.4 血漿超氧化物歧化酶SOD、丙二醛MDA含量的測定     1.5.4.1 超氧化物歧化酶（SOD）的測定     采用黃嘌呤氧化酶法，通過黃嘌呤氧化酶反應系統產生超氧陰離子自由基（O2—），后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現紫紅色，用可見分光光度計測定其吸光度。當被測樣品中含SOD時，則對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，通過計算可求出被測樣品中的SOD含量。     各組分別于感染后第8d，采血分離血漿，然后按試劑盒所示步驟進行。     1.5.4.2 丙二醛（MDA）的測定     硫代巴比妥酸（TBA）法，過氧化脂質降解產物中的丙二醛（MDA）可與硫代巴比妥酸（TBA）縮合，形成紅色產物，在532nm處有最大吸收峰。用可見分光光度計測定其吸光度。通過計算MDA含量。     各組分別于感染后第8d，采血分離血漿，然后按試劑盒所示步驟進行操作。     1.5.5 抗球蟲指數（ACI）的測定[8]     分別計算用藥各組的增重率、存活率、病變值和卵囊值。     抗球蟲指數（ACI）=（增重率+存活率）—（病變值+卵囊值）     2 結果     2.1盲腸組織病理學變化     感染后4～7d，是病變最嚴重的階段。主要表現為：中、后段盲腸粘膜深層嚴重出血，大量粘膜上皮脫落，嚴重者可見整個粘膜幾乎完全脫落，腸腺破壞，其表面被覆大量脫落的變性、壞死的上皮細胞和紅細胞，以及許多大型第2代裂殖體。粘膜下層顯著充血、水腫及淋巴細胞與嗜酸粒細胞浸潤，小血管壁發生纖維素樣變，肌層亦有少量淋巴細胞和嗜酸粒細胞浸潤，漿膜下小血管充血或出血。未脫落粘膜的固有膜中，聚集有許多大型第2代裂殖體，含有許多香蕉形裂殖子，蟲體周圍有淋巴細胞、嗜酸粒細胞浸潤。     感染后6d，可見腸腺上皮中寄生有配子體，成熟大、小配子體寄生于絨毛上皮和腸腺上皮中，有時可見腸腺完全為配子體占據。     用藥組中以微粉組（2%）、粗粉組（2%）、微粉組（1%）病變最為輕微，微粉組（0.5%）、西藥組較為嚴重。     2.2 各組藥物的抗球蟲指數（ACI）     通過公式計算用藥各組的ACI，以微粉組（2%）最高為193.73，粗粉組（2%）和微粉組（1%）接近分別為181.64和182.78，微粉組（0.5%）為152.35，西藥組最低為128.92。     2.3各組藥物對感染E.tenella球蟲雛雞血漿超氧化物歧化酶（SOD）含量的影響     感染球蟲的各組在感染的第8d時，用藥各組與陽性對照組相比均能增加雛雞血漿SOD含量，其中微粉組（1%）、粗粉組（2%）、微粉組（2%）三組與陽性對照組差異極顯著（p<0.01）；與陰性對照組差異顯著（p<0.05）；微粉組（1%）與粗粉組（2%）兩組之間差異不顯著；微粉組（0.5%）、西藥組兩組與陽性對照組差異顯著（p<0.05）；兩組之間差異不顯著。結果見表1。 表1 血漿SOD含量檢測結果（NU/ml） 試驗組 各組平均數 差異顯著（p<0.05） 差異極顯著（p<0.01） 陽性對照組 155.8±4.6 a A 微粉組（0.5%） 158.3±5.1 b A 西藥組 158.6±5.6 b A 粗粉組（2%） 165.8±8.3 c B 微粉組（1%） 167.5±6.9 cd B 微粉組（2%） 169.4±6.6 d BC 陰性對照組 172.5±9.3 e C        注：含有不同小寫字母者差異顯著（p<0.05），含有不同大寫字母者，差異極顯著（p<0.01）。下同     2.4 各組藥物對感染E.tenella球蟲雛雞血漿丙二醛（MDA）含量的影響     感染球蟲的各組在感染的第8d時，用藥各組血漿丙二醛（MDA）含量與陽性對照組相比均有所降低，其中粗粉組（2%）、微粉組（2%）兩組與陽性對照組差異極顯著（p<0.01）；微粉組（2%）與陰性對照組差異不顯著；微粉組（1%）與粗粉組（2%）兩組之間差異不顯著。西藥組與陽性對照組差異不顯著。結果見表2。 表2 血漿MDA含量檢測結果（umol/ml） 試驗組 各組平均數 差異顯著（p<0.05） 差異極顯著（p<0.01） 陰性對照組 2.73±0.18 a A 微粉組（2%） 2.89±0.19 ab A 粗粉組（2%） 3.07±0.25 b A 微粉組（1%） 3.19±0.28 bc AB 微粉組（0.5%） 4.04±0.29 c B 西藥組 4.12±0.42 cd B 陽性對照組 4.74±0.43 d B     3 討論     在生理情況下，體內氧自由基（Oxygen Free Radicals, OFR）濃度極低并處于平衡狀態，不僅對機體無害，還有獨特的生理作用，如有助于吞噬細胞殺滅有害的微生物等[9,10]。在疾病的情況下，機體體內氧自由基產生過多或機體清除OFR能力減弱，則可產生丙二醛（MDA）等，對機體有較強的毒性作用，致使組織損傷而發生疾病[11,12] 。另外，OFR通過引發脂質過氧化、損傷蛋白質、核酸等生物大分子物質以及其它方式，造成組織細胞損傷，影響機體內環境的相對穩定，從而促進疾病的發生與發展[13,14]。     大量資料表明，生物體內OFR雖然不斷地產生，但也不斷地被清除。氧自由基的清除涉及的酶有超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-PX）、過氧化氫酶（CAT）等[15，16，17]。     因此SOD含量的高低間接反映機體清除自由基的能力，MDA含量的高低間接反映機體受氧自由基攻擊的嚴重程度。     試驗中陽性對照組與陰性對照組比較，血漿SOD含量和血漿MDA含量均為差異極顯著（p<0.01），說明雞在感染E.tenella過程中機體通過酶系統與非酶系統產生氧自由基，后者攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化作用，并因此形成脂質過氧化物，如MDA等以及新的氧自由基，引起細胞損傷。結果與鄭明學[6]，聶奎[7]報道的結果一致。     本試驗中感染球蟲的各組在感染的第8d時，用藥各組與陽性對照組相比均能增加雛雞血漿SOD含量，降低血漿丙二醛（MDA）含量。具體的作用機理可能是方中含有抗球蟲的中藥常山、青蒿等，藥物通過抑制球蟲在雞體內的增殖，從而保護機體清除自由基的能力，減少自由基對機體的損傷，降低球蟲感染過程對機體的致病作用，進而保護機體；另外試驗方劑中含有地錦草，據曹瑞珍[18]報道，地錦草提取物可明顯提高小鼠血液SOD活性，降低MDA含量。     通過盲腸組織病理切片和各組藥物的抗球蟲指數分析，用藥組中以微粉組（2%）盲腸病變最為輕微，抗球蟲指數（193.73）最高，雛雞血漿SOD含量最高，而血漿丙二醛（MDA）含量最低；西藥組盲腸病變最為嚴重，抗球蟲指數（128.92）最低，雛雞血漿SOD含量最低，血漿丙二醛（MDA）含量最高。因此可見盲腸病變與血漿SOD含量呈負相關，與血漿丙二醛（MDA）含量成正相關。     綜合分析試驗各組的盲腸病變、抗球蟲指數、雛雞血漿SOD、MDA含量等指標，粗粉組（2%）和微粉組（1%）差異均不顯著。所以從添加劑量考慮，以微粉組（1%）為最經濟、最合理的添加劑量，證明中藥超微粉碎可以減少添加量，只為粗粉用藥量的1/2。