苦參抗SLT-Ⅱe致RIMMVECs損傷機理及有效成分研究

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苦參抗SLT-Ⅱe致RIMMVECs損傷機理及有效成分研究

周傳鐸　吳軍　劉鐘杰　索占偉　穆祥　李禹濤　段惠琴 （1　中國農業大學動物醫學院，北京　100094；2　北京農學院動物科技系，北京 102206） 　　志賀樣毒素Ⅱ型變異體(Shiga like toxin，SLT-Ⅱe）主要由出血性大腸桿菌(EHEC)產生，為豬水腫病的主要毒力因子。試驗研究表明，SLT-Ⅱe能抑制大鼠腸黏膜微血管內皮細胞（rat intestinal mucosa microvascular endothelial cells, RIMMVECs）的增殖，并可對其造成一定損傷。而適宜苦參水煎液不但可以促進RIMMVECs增殖，更可以減弱SLT-Ⅱe對RIMMVECs的損傷。本試驗通過對苦參水煎液及其主要成分與SLT-Ⅱe共同作用于RIMMVECs后，不同時間段細胞上清夜中NO、ET-1分泌量的檢測，旨在從細胞水平探尋苦參抗SLT-Ⅱe致RIMMVECs的損傷機理，并對其有效成分進行研究，為中藥對抗細菌毒素及防治細菌病的研究提供理論基礎。 　　1　材料與方法 　　1.1　材料 　　DMEM（Gibico）；標準胎牛血清（Gibico）；SLT-Ⅱe液（揚州大學微生物實驗室惠贈）；大鼠腸粘膜微血管內皮細胞（北京農學院中獸醫實驗室提供）；NO試劑盒（深圳晶美）；ET-1（內皮素-1）試劑盒（北京尚柏生物公司）；噻唑藍（MTT，Amresco）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma）；所有試劑均經過0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌。 　　1.2　儀器 　　培養板（Costar）；96孔酶標板（Costar）；CO2培養箱（Sanyo)；熒光倒置數碼顯微鏡（麥克奧迪實業集團有限公司）；酶聯免疫檢測儀（BioRad）；分光光度計(UNICO) 　　1.3　方法 　　1.3.1　細胞傳代接種：選取第10代的細胞進行消化，所得細胞液用完全培養基稀釋，將細胞密度調整到5×104 ?個/mL，充分混勻后接種至96孔細胞培養板中，每個孔接種200 μl，然后置入CO2 培養箱中靜止培養48 h。 　　1.3.2　分組方案：共分5組，每組5個重復（其中12 h 各細胞組在一塊細胞培養板上）。分組及各組毒素與中藥液終濃度如下。空白組：維持培養基；毒素組：維持培養基中含SLT-Ⅱe 含量為10.0 μg/m；毒素+苦參水煎液組：維持培養基中含SLT-Ⅱe 10.0 μg/mL，苦參200.0 μg/mL；毒素+苦參堿組：維持培養基中含SLT-Ⅱe 10.0 μg/mL，苦參堿200.0 μg/mL；毒素+氧化苦參堿組：維持培養基中含SLT-Ⅱe 10.0 μg/mL，氧化苦參堿200.0 μg/mL 　　1.3.3　NO、ET-1的測定：將96孔細胞培養板置入CO2培養箱中，37 ℃靜置培養24 h，待細胞生長到80%鋪滿培養孔底壁。如分組劑量更換培養液后，繼續培養。在細胞培養的3、6、9、12 h，從各大組中選取一個小組的5個孔，吸出全部細胞培養液250 μl，3000 rpm離心10 min后，將上清液移入新的小離心管中，封口，-20 ℃冰箱保存備用。依試劑盒說明書完成細胞上清液中NO、ET-1的測定，其中ET-1每組3個重復。 　　1.3.4　12h增值率的測定：在12 h后，將12 h組的各孔細胞上清夜吸凈后，加入5 mg/mL的MTT 30 ml及150 ml的DMEM維持培養基，繼續培養4 h后，輕輕吸棄孔內液體，每孔加入150 μl DMSO，37 ℃孵育30 min 以上，使細胞內結晶充分溶解，于酶標儀570 nm波長測定細胞增殖率（OD值）。 　　1.4　數據統計 試驗結果采用平均值±標準誤表示，試驗組間差異采用t檢驗法。 　　2．結果 　　2.1　苦參水煎液及其成份抗SLT-Ⅱe對RIMMVECs增殖作用 由表1可以看出，當SLT-Ⅱe濃度為10 μg/mL時，毒素作用RIMMVECs 12 h后，MTT法測細胞增殖率OD值與空白對照組比較明顯降低，且差異極顯著。而毒素+苦參水煎液組、毒素+苦參堿組、毒素+氧化苦參堿組在12 h時的OD值均顯著高于毒素組，其中毒素+苦參水煎液組、毒素+苦參堿組與空白組比較無顯著差異，而毒素+氧化苦參堿組與空白組比較差異極顯著，與毒素+苦參水煎液組、毒素+苦參堿組與空白組比較差異亦極顯著。 　　表1　苦參水煎液及其成份抗SLT-Ⅱe對RIMMVECs增殖作用( n = 5 ) 組別 X ± S 增殖率% 統計結果 空白組 2.88±0.12 — A?? a 毒素組 2.32±0.07 -19.53 C?? c 毒素+苦參水煎液組 2.79±0.06 -2.95 A?? a 毒素+苦參堿組 2.80±0.07 -2.61 A?? a 毒素+氧化苦參堿組 2.56±0.04 -10.91 B?? b 　　注：各組間不含有相同大寫字母表明差異極顯著p＜0.01，各組間不含有相同小寫字母表明差異顯著p＜0.05 　　2.2　苦參水煎液及其成份對SLT-Ⅱe引起RIMMVECs分泌NO的影響 　　由表2可以看出，空白組NO分泌量隨著時間的增加而增加，呈逐漸上升的趨勢，且上升趨勢平緩。而毒素組，除在3h時，NO分泌量與空白組沒有明顯差異，在6h、9h、12 h時均較空白對照組明顯升高，且差異極顯著。而在各個時間點，三個中藥組毒素+苦參水煎液組、毒素+苦參堿組、毒素+氧化苦參堿組的NO分泌量均落在毒素組與空白組之間。3 h時，各個組NO分泌量間沒有明顯差異。在6 h時，三個中藥組NO分泌量與毒素組比較，差異極顯著；其中，毒素+苦參堿組與空白組比較差異顯著。在9 h時，三個中藥組NO分泌量與毒素組比較，差異極顯著；其中毒素+氧化苦參堿組與空白組比較差異極顯著。12 h時，三個組與毒素組比較，差異極顯著，其中毒素+氧化苦參堿組與空白組差異極顯著。三者間比較，除在12 h時，毒素+苦參堿組與毒素+氧化苦參堿組間差異顯著外，其他均無顯著差異。 表3-12　苦參水煎液及其成份SLT-Ⅱe引起RIMMVECs分泌NO的影響（X±S μmol/L，n = 5） 組別 3 h 6 h 9 h 12h 空白組 9.45±1.54 A a 11.71±0.72 B c 13.10±1.63 Cc 15.11±1.67 C d 毒素組 10.08±1.61 A a 17.13±1.75 A a 18.14±1.21 A a 23.05±2.30 A a 毒素+苦參水煎液組 9.70±1.00 A a 12.59±1.26 Bbc 14.61±1.29 BCbc 17.88±1.70 BCbc 毒素+苦參堿組 9.95±1.13 A a 13.60±1.14 B b 14.11±0.84 BCbc 16.75±1.70 BCcd 毒素+氧化苦參堿組 9.82±1.31 A a 12.97±1.38 Bbc 15.87±1.50 AB b 19.40±0.93 B b 　　注：相同時間的組間不含有相同大寫字母表明差異極顯著p＜0.01，各組間不含有相同小寫字母表明差異顯著p＜0.05 　　2.3　苦參水煎液及其成份對SLT-Ⅱe引起RIMMVECs分泌ET-1的影響 　　由表3可以看出，而對于ET- 1的分泌量，空白組隨著時間的增加而沒有明顯變化。毒素組，在3h時，ET-1分泌量與空白組比較明顯降低，且差異極顯著。而在6h、9h、12h時，毒素組ET-1又明顯上升，與空白對照組比較差異極顯著。對于中藥組，在3 h時，毒素+苦參水煎液組、毒素+苦參堿組、毒素+氧化苦參堿組的ET-1分泌量均高于毒素組，且差異極顯著；其中毒素+苦參水煎液組、毒素+苦參堿組與空白組比較差異極顯著。三者間比較，毒素+氧化苦參堿組與其他兩組比較差異極顯著。從6 h后，三個中藥苦參組ET-1的分泌量即落在毒素組與空白組之間。在6 h時，三個組ET-1分泌量與毒素組和空白組比較，差異均極顯著。三者間比較差異都極顯著。在9 h時，三個中藥組ET-1分泌量與毒素組和空白組比較，差異均極顯著。三者間比較，毒素+氧化苦參堿組與其他兩組比較差異極顯著。12 h時，三個中藥組ET-1分泌量與空白組比較，差異極顯著；其中毒素+苦參水煎液組、毒素+苦參堿組ET-1分泌量與毒素組比較，差異極顯著。三者間比較差異都極顯著。 表3-13　苦參水煎液及其成份對SLT-Ⅱe引起RIMMVECs分泌ET-1的影響（X±S pg/mL，n = 3） 組別 3 h 6 h 9 h 12 h 空白組 1.73±0.12 B b 1.99±0.11 E e 2.06±0.15 D d 2.01±0.14 D a 毒素組 0.90±0.11 C c 6.62±0.14 A a 7.10±0.16 A a 6.62±0.21 A a 毒素+苦參水煎液組 2.09±0.14 A a 5.18±0.20 C c 5.18±0.15 C c 5.13±0.21 B b 毒素+苦參堿組 2.16±0.14 A a 4.69±0.11 D d 4.97±0.23 C c 3.88±0.11 C c 毒素+氧化苦參堿組 1.71±0.11 B b 5.77±0.07 B b 5.99±0.14 B b 6.36±0.11 A d 　　注：相同時間的組間不含有相同大寫字母表明差異極顯著p＜0.01，各組間不含有相同小寫字母表明差異顯著p＜0.05 　　3　分析與討論 　　本實驗用MTT法觀察SLT-Ⅱe對RIMVECs增殖的影響。從細胞增值率的角度出發，毒素＋中藥組中，在毒素+苦參水煎液組、毒素+苦參堿組、毒素+氧化苦參堿組在12 h時的OD值均顯著高于毒素組。表明在12 h時，200 μg/mL的苦參水煎液、苦參堿、氧化苦參堿對SLT-Ⅱe引起的內皮細胞損傷均起到了保護作用，降低由毒素引起的增殖抑制。 　　NO是血管內皮細胞所產生的內皮衍生性舒張因子，具有很強的舒血管功能[1]。ET-1是迄今為止已知最強的血管收縮性物質[2]。二者相互作用，維持血管的舒縮及通透性。試驗結果表明，10 μg/mL的SLT-Ⅱe在作用于RIMMVECs后，首先表現出在3 h時ET-1分泌量顯著下降，NO無明顯變化。而在6 h后，NO與ET-1較空白組均顯著升高。其原因可能是由于毒素作用細胞后，首先引起ET-1的迅速降低，從而導致NO、ET-1比例失衡，血管迅速擴張，致使內皮細胞發生損傷，而后NO持續生成，并轉化為具有更強細胞毒性的ONOO－，從而加劇了細胞的損傷與死亡[3]。而200 μg/mL的苦參水煎液可在3 h時明顯抑制因毒素作用所致的細胞上清液中ET-1的降低，并在3 h、6 h、9 h、12 h時不同程度的降低了毒素作用后細胞上清液中NO的分泌量，維持了NO與ET-1在細胞外環境的平衡，從而減輕了毒素對細胞的損傷作用。苦參兩種主要成分苦參堿和氧化苦參堿對NO、ET-1的作用趨勢與苦參水煎液基本相同。在12 h時苦參堿對RIMMVECs的增殖效果來看略高于苦參水煎液組，但極顯著高于氧化苦參堿組。而其在對ET-1及NO的調控作用也好于氧化苦參堿組，故在200 μg/mL濃度條件下，苦參堿在苦參對抗SLT-Ⅱe保護RIMMVECs的功效中發揮主要作用。 　　綜上所述， SLT-Ⅱe作用細胞后可在短時間內引起ET-1的迅速降低，從而導致NO、ET-1比例失衡，血管迅速擴張，致使內皮細胞發生損傷，NO分泌量開始逐漸增加。而隨著NO量的增加，進一步加劇了細胞的損傷。而苦參則在SLT-Ⅱe作用最初階段抑制ET-1的降低、維持NO、ET-1比例平衡，在后期降低NO的分泌量，起到保護內皮細胞的作用。其中苦參堿較之氧化苦參堿保護效果更為突出。