黃連解毒散超微細粉中黃芩苷在家兔體內的藥代動力學研究

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超微粉碎是近年來國際上發展非常迅速的一項新技術，應用這種技術可將固體物料粉碎成直徑小于10μm的粉體。粉碎是中藥生產和制備各種劑型的基本操作，而超微粉碎的細胞破壁率特別高，大于95%，所以將它應用于中藥制劑的制備中，可大幅度地提高藥材中有效成分的釋放和在體內的吸收，提高中藥制劑的生物有效性[1,2]。故此，不少業內專家認為，超微粉碎技術在中藥加工上的應用研究，將帶來中藥行業的新一輪的技術革命。

　　黃連解毒湯出自王燾《外臺秘要》，本方由黃連、黃柏、黃芩、梔子組成。具有清熱瀉火解毒之功效，主治一切實熱火毒、三焦熱盛之證。無論內服、外用具有良好的治療作用[3-5]。《中華人民共和國獸藥典》（2000年版）中的黃連解毒散即源于本方。據研究，本方具有一定的抗菌、解毒、耐缺氧、抗自由基等作用。在獸醫臨床上，本方廣泛應用于敗血癥、膿毒血癥、痢疾等各種急性炎癥[6]。

　　黃一帆等 [7]已對中藥方劑黃連解毒散進行普通粉碎和超微粉碎后的粉末形態學進行了比較觀察，利用掃描電鏡、生物顯微鏡、激光粒度測定儀對普通粉和超微細粉進行了表征，發現藥材經超微粉碎后，粉末顆粒細微均勻，顆粒的球性度提高，復方均質度明顯改善，絕大多數細胞破壁。黃芩苷是黃連解毒散黃芩中主要的有效成分，與黃芩的清熱解毒，燥濕等功效有十分密切的關系。藥理研究表明黃芩苷具有抗菌、抗病毒、降壓、保肝、解毒、免疫調節等藥理作用[8]，體外溶出度試驗[9]表明超微粉碎可提高黃連解毒湯中黃芩苷溶出量。對該方進行超微粉碎后有效成分黃芩苷在體內的藥代動力學研究，國內未見報道。本文在此基礎上，采用高效液相色譜法測定家兔體內黃芩苷的血藥濃度，比較黃連解毒散超微細粉、細粉中黃芩苷在家兔體內的藥代動力學參數，以期揭示黃連解毒散經超微粉碎后主要成分在體內的變化規律及其生物利用度，為黃連解毒散超微粉在臨床應用提供科學依據。

　　1．材料和方法

　　1．1試驗動物

　　10只健康家兔（購自福建醫科大學實驗動物中心），公母各半，體重2.5～3.0kg。單籠飼養，自由飲水。

　　1．2 主要試驗儀器

　　美國Agilent公司1100型高效液相色譜儀；HSC-24A型氮氣吹干儀（北京八方世紀科技有限公司）；BMF-6型倍力超微粉碎機（濟南倍力粉技術工程有限公司）；FZ-102型植物試樣粉粹機（河北黃驊市家務科學儀器廠）；Statorius BS210S型電子天平（北京塞多利斯天平有限公司）；AL104型電子天平（西德）；TGL-16G型離心機（上海安亭科學儀器廠）。

　　1．3藥材與試劑

　　黃連解毒散由黃連、黃柏、黃芩和梔子(購于福州市藥材采購供應站)按規定比例混合而成。黃連解毒散細粉由植物試樣粉碎機粉碎，過65目篩。黃連解毒散超微細粉由濟南倍力粉技術工程有限公司采用超微粉碎技術制成。試驗前40℃減壓干燥至恒重，給藥前用蒸餾水配成懸浮液。

　　黃芩苷標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號10715-200212）；甲醇為色譜純（江蘇漢邦科技有限公司 ）；磷酸為分析純（廣東光華化學廠有限公司）；肝素鈉（上海惠興生化試劑有限公司）。

　　1．4 給藥與血樣采集

　　10只家兔試驗前根據性別、體重隨機分為2組，即黃連解毒散細粉組和黃連解毒散超微細粉組，按4g·kg-1劑量灌胃給藥，給藥前禁食12h，于給藥后0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6、8、12、24h頸靜脈采血2.5mL, 肝素鈉抗凝。3000r/min，離心15min，分離血漿，分裝于eppendorf管中，-20℃保存待測。

　　1．5 血漿中黃芩苷濃度的測定

　　1．5．1樣品處理

　　精密吸取各時間點的含藥血漿0.2mL于離心管中，加1.4mL甲醇超聲振蕩15min，旋渦振蕩1min，12000r/min離心15min，取上清液到另一干凈的離心管，40℃水浴氮氣流揮干，殘渣加0.25mL流動相溶解，并旋渦振蕩2min，超聲5min，0.45μm濾膜過濾，最后取20μL進樣。

　　1．5．2標準曲線

　　精密稱取黃芩苷標準品，加流動相配成10μg·mL-1的標準品溶液。精密吸取黃芩苷標準品溶液1mL置10mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，配制成1μg·mL-1標準品儲備溶液精密吸取6、12、24、36、50、100μL黃芩苷標準品溶液（1μg/mL）于離心管中，40℃水浴氮氣流揮干，分別加入空白血漿0.2 mL，得不同濃度的血漿標準液（濃度分別為0.03 μg/mL、0.06 μg/mL、0.12μg/mL、0.18μg/mL、0.25 μg/mL、0.5 μg/mL），按“樣品處理”項下方法處理并進樣。得到回歸方程為：y=39.849x+0.467（r=0.9994）；在0.03～0.5μg/mL之間線性關系良好。以信噪比 S/N 為3 計，該方法的檢測限為0.02μg·mL-1。

　　1．5．3回收率的測定

　　用空白血漿和黃芩苷標準品溶液配制0.03μg/mL、0.18 μg/mL、0.5μg/mL黃芩苷血漿樣品，每種濃度樣品數n=5，按“樣品處理”項下方法處理進樣分析，測得高 、中、 低 3 個濃度水平血漿中黃芩苷的回收率和 RSD分別為75.96％、78.07％、78.85％和4.29％、4.57％、4.38％。

　　1．5．4精密度的測定

　　用空白血漿和黃芩苷標準品溶液配制0.025μg/mL、0.15μg/mL、0.4μg/mL黃芩苷血漿樣品，每種濃度5份，按“樣品處理”項下方法處理，測得高、 中、 低 3 個濃度水平血漿中黃芩苷的日內 RSD 分別為4.66 %、3.16%、 4.22% ，日間 RSD 分別為 4.71% 、3.90% 、4.68%。

　　1．5．5色譜條件? 色譜柱為Hanbon 1C18254F（4.6mm×250mm） ；流動相為甲醇-水-0.2%磷酸(55：45：0.2)；流速1m1／min；檢測波長280nm。 黃芩苷的保留時間為8.4～8.7 min。黃芩苷標準品、空白血漿、空白血漿加黃芩苷標準品、家兔灌藥血漿樣品的色譜圖如圖1-5。

圖1　黃芩苷標準品色譜圖

圖2　空白血漿色譜圖

圖3　血漿中黃芩苷標準品的色譜圖

圖4　家兔灌胃HLJDS 細粉血漿黃芩苷色譜圖

圖5　家兔灌胃HLJDS超微細粉血漿黃芩苷色譜圖

　　2．結果

　　2．1家兔口服黃連解毒散后的黃芩苷血藥濃度結果見表1，圖6。

　　表1　家兔黃芩苷血藥濃度（n=5，μg /mL）

采血時間(h) Time/h	黃連解毒散細粉 Common powder	黃連解毒散超微細粉? Ultra micro-powder???????????????????
0.25	0.06250±0.00872	0.0936±0.01530
0.5	0.07326±0.00888	0.113335±0.01310
0.75	0.094397±0.01040	0.133667±0.01340
1	0.107155±0.00688	0.157588±0.00708
1.5	0.152605±0.01050	0.274003±0.00611
2	0.201642±0.01600	0.321246±0.01560
2.5	0.218985±0.01750	0.319054±0.01630
3	0.217789±0.01750	0.315465±0.02250
4	0.211809±0.01790	0.274202±0.01870
6	0.179914±0.02100	0.254069±0.01600
8	0.167156±0.02360	0.175379±0.01600
12	0.073865±0.00551	0.078849±0.00610
24	0.038383±0.00552	0.035791±0.00998

　　

圖6　黃芩苷超微細粉和細粉藥時曲線圖

　　2．2家兔內服黃連解毒散的藥帶代動力學參數

　　將兩組給藥后不同時間點采血測得的血藥濃度時間數據的均值，采用藥代動力學軟件PKS(Pharmaceutical Kinetics Software)處理藥時數據，主要藥代動力學參數見表2。

表2 家兔內服黃連解毒散（4g/kg）后血漿黃芩苷藥代動力學參數

參數 Parameter	單位 Unit	黃連解毒散細粉 Common powder	黃連解毒散超微細粉 Ultra micro-powder
A	μg /mL	0.414	0.990
α	1/h	0.252	0.271
B	μg /mL	0.323	0.171
β	1/h	0.119	0.0819
Ka	1/h	0.419	0.497
t1/2α	h	2.74	2.556
t1/2β	h	5.83	8.46
Vd	L·kg-1	12.890	6.752
AUC	（μg /ml).h	2.611	3.401
K10	1/h	0.152	0.174
K21	1/h	0.197	0.128
K12	1/h	0.0222	0.0514
Tpeak	h	3.645	3.005
Cmax	μg /mL	0.215	0.311

　　3．分析與討論
　　由于黃芩苷的結構為5，6二羥基黃酮-7-0葡萄糖醛酸苷，易氧化，須在低溫下進行，所以，在用氮氣吹干時，采用了較低的水浴溫度40℃，而不是常用的50-60℃。黃芩苷極性較大，且有一定的酸性，為了防止其拖尾，加入磷酸抑制其解離，起到改善峰形的作用。何心等[10]用高效液相色譜電化學法測定雙黃連中黃芩苷的血藥濃度，直接用乙腈沉淀蛋白，在本次試驗中，我們發現甲醇超聲提取法的回收率比乙腈超聲提取法高一倍，說明了用甲醇提取比用乙腈好，這可能是因為中藥有效成分的血藥濃度都很低，在ng和μg級，因而對提取方法敏感，而甲醇沉淀蛋白是成絮狀的、乙腈沉淀蛋白是成小塊狀的，絮狀的更有利于藥物的溶出，因此，用甲醇更有利于低血藥濃度藥物的提取。本試驗在此色譜條件下測得的黃芩苷精密度好，回收率高，血藥有效成分峰和雜質峰分離清楚,靈敏度高，說明該方法穩定，快速準確，簡便可行，可以作為本試驗血藥濃度監測的手段。
　　本試驗所得血藥濃度-時間數據經藥代動力學軟件PKS(Pharmaceutical Kinetics Software)處理藥時數據，根據F檢驗和AIC值選擇房室數，2組家兔口服黃連解毒散超微細粉、細粉后，其有效成分黃芩苷在其體內的代謝過程符合一級吸收二室開放模型。說明黃連解毒散超微細粉和細粉的有效成分黃芩苷在家兔體內的代謝方式基本相似。有文獻報道[11]家兔口服銀黃沖劑，銀黃沖劑中的代表成分黃芩苷在家兔體內的藥時過程也符合一級吸收二室開放模型，但其消除非常緩慢，消除半衰期達到341.5 h，與本試驗的5.83-8.46 h相比，差異很大，這可能與試驗方劑的不同有關，黃連解毒散中含有利膽作用較強的梔子，這種成分可能對黃芩苷的排泄產生某些顯著影響，因為黃芩苷是含羥基的黃酮類化合物，極性較強，有利于血中的快速消除，而且黃酮類化合物的膽汁排泄是其排泄的主要途徑[12]。
　　黃連解毒散超微細粉組和細粉組比較，Tpeak縮短了0.640h； Cmax提高了43.98%；AUC反映藥物的生物利用度，其中超微細粉、細粉AUC分別是3.401 (μg·h /mL) 和 2.611(μg·h /mL)，與細粉比較，黃連解毒散超微細粉中黃芩苷的相對生物利用度提高了30.26%，表明超微細粉比細粉生物利用度大。一般對固體藥物來說，溶出是吸收的前提，藥物粉體粒徑越小，比表面積越大，溶出越快，吸收越好[13]。在理論上，散劑的粒子越細，比表面積愈大，進入體內的粒子與體液較大的接觸面積，可使藥物較快的溶解和吸收。中藥經過超微粉碎后，使細胞破壁率達95%以上，顆粒細、混合均勻，其有效成份充分暴露出來，在胃液作用下即被溶解，進入小腸后一開始即被同步吸收，起效迅速；另外，中藥超微細粉因其超微粉粒子吸附力的作用，使藥物在消化道內的作用時間較長，提高了藥物吸收率，同時藥物有效成份由細胞內向外遷移所需時間短，吸收明顯加快且吸收量增大、吸收更完全[14-16]。藥物的生物利用度與藥物成分的溶出量和溶出速率在一定程度上具有相關性，因此通過降低藥物粉體的粒徑可改善藥物的溶出速度，提高生物利用度。本實驗研究表明中藥經超微粉碎后其有效成分可更快、更多的吸收，對提高中藥有效成分的生物利用度具有積極的意義。

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中藥的預防作用是毋庸置疑的