注射用雙連翹對培養細胞的生長和抵抗病毒感染的影響

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注射用雙連翹對培養細胞的生長和抵抗病毒感染的影響 張國紅　杜國清　汪勇　熊劍 （四川華西動物藥品研究所，綿陽高新區，621000） 何曉媛　　蘇志華　　王蓉 （四川華西動物藥業有限公司，綿陽梓潼，622150）

摘要：將5種濃度的注射用雙連翹分別加入到12h前接種新城疫病毒的雞胚成纖維（CEF）細胞單層中，于病毒接種后72h用中性紅染料吸收法測定CEF細胞的活性，以評價不同濃度注射用雙連翹對培養細胞的生長和抗病毒感染的影響。結果表明，注射用雙連翹有較強的抑制病毒感染作用和微弱的促細胞生長作用，基本與濃度呈正相關。 關鍵詞：注射用雙連翹；雞胚成纖維細胞；新城疫病毒。     注射用雙連翹是由板藍根、金銀花、連翹等三味中藥按一定比例經系統工藝制備而成的獸用粉針劑。本研究觀察了注射用雙連翹對CEF細胞生長及其抗新城疫病毒感染的影響，旨在探討注射用雙連翹的藥理作用，為臨床應用提供理論依據。 1、材料與方法 1·1試驗藥品     注射用雙連翹，主要成分為板藍根、金銀花、連翹等按一定比例經系統工藝配制而成，由四川華西動物藥業有限公司提供。根據對CEF細胞安全濃度的測定結果[1]，用細胞維持液分別稀釋成高、次高、中、次低、低5種濃度（見結果中各表，均以凈含量表示），常規消毒后備用。 1·2病毒     新城疫IV系疫苗病毒（NDV，LaSota），四川綿陽寶萊生物藥業有限公司提供。經9日齡SPF雞胚傳代2次，按Reed-Muench法測定CEF細胞半數組織培養感染劑量（TCID50），用細胞維持液配成100 TCID50濃度備用。 1·3主要試劑     MEM培養基，Gibco公司產品。按說明書配制，加入犢牛血清，5%為細胞生長液、2%為細胞維持液，再常規量加入谷酰胺和雙抗。胰蛋白酶，用PBS溶液配制成0.25%的濃度，調節PH值至7.4，0.22um混合纖維素酯微孔濾膜過濾除菌，分裝后-20℃保存備用。中性紅，上海試劑三廠生產，用153mmol/L的NaCL溶液配制成含中性紅0.5mg/ml的溶液。 1·4試驗方法     按文獻[2]方法制備CEF細胞，將細胞數調整至5×105個/ml，后加入到96孔細胞培養板中，每孔100ul；37℃、5%CO2條件下培養36h、CEF細胞已長成致密單層后，倒掉孔內液體，用維持液洗3次，最后倒掉維持液，開始分組和處理。 一塊細胞板，設立病毒-注射用雙連翹組和注射用雙連翹組各20孔（5種濃度×4孔/濃度），另設病毒對照組、細胞對照組各4孔和無細胞孔1孔（只加營養液，作為測定時空白調零孔）。首先在病毒-注射用雙連翹組和病毒對照組每孔加入100TCID50病毒液100ul，其它組加入100ul細胞維持液，培養12小時后倒掉孔內液體。病毒-注射用雙連翹組和注射用雙連翹組每孔加入100ul細胞維持液，繼續培養。于病毒接種72h后測定CEF細胞活性。 1.5CEF細胞活性測定     采用中性紅染料吸收法[3]。測定前2h每孔加入50uL中性紅活染液；測定時倒掉孔內液體，用PBS沖洗細胞3次，每孔加入200uL脫色液，置微孔板振蕩器振蕩10min；然后在酶聯免疫檢測儀上測定570nm下的吸光（OD）值，作為細胞活性的指標。 分別統計比較病毒－注射用雙連翹組與病毒對照組和同濃度注射用雙連翹組、注射用雙連翹組和細胞對照組OD值的差異性，以評價注射用雙連翹對病毒感染細胞能力和CEF細胞生長的影響。 2  結果與分析     注射用雙連翹的測定結果見下表。病毒－注射用雙連翹組OD值均大于、中濃度組顯著大于、高、次高和次低濃度組極顯著大于病毒對照組（P﹤0.01），除次高濃度組外其他各組與同濃度中藥組差異均不顯著；注射用雙連翹組除低濃度組外均大于細胞對照組。說明注射用雙連翹有較強的抑制病毒感染作用和微弱的促細胞生長作用，基本與濃度呈正相關。 注射用雙連翹的測定結果 濃度/ug.mL-1 病毒－注射用雙連翹組 注射用雙連翹組 300 0.383±0.006a 0.383±0.061a 150 0.390±0.028a* 0.378±0.029a 120 0.350±0.046a 0.375±0.037a 80 0.378±0.079a 0.365±0.029a 40 0.335±0.060ba 0.343±0.019a 病毒對照 0.276±0.054b 細胞對照 0.363±0.027a 注：同列數據標不同字母者表示差異顯著或極顯著（P<0.05或P<0.01）；*表示注射用雙連翹-病毒組與相應注射用雙連翹組相比差異顯著（P<0.05）。 3  小結與討論 3.1 注射用雙連翹對單層CEF生長有不同的影響     中性紅染料吸收法的原理是活細胞能夠吸收中性紅。中性紅是一種弱陽離子染料，能與活細胞漿中的陰離子結合而濃縮于活細胞中，并不被細胞洗滌液洗脫，滲入活細胞的中性紅量與活細胞數量成正比。因此OD值直接反映活細胞的數量，與細胞增殖的程度成正比[3]。試驗結果顯示，注射用雙連翹組的OD值有的稍大于、有的稍小于細胞對照組，表明注射用雙連翹對單層CEF生長無顯著影響。 3.2 注射用雙連翹顯著抑制病毒感染     OD值與細胞的病變程度成反比，間接地反映病毒感染細胞的程度。當細胞被病毒感染破壞或被干擾了功能以后，可降低對中性紅的吸收能力，隨著病毒愛細胞內不斷生長，細胞受到損壞，病變程度逐漸加重，受損細胞數量逐漸增多，OD值降低[4]。結果顯示，注射用雙連翹5個濃度病毒－注射用雙連翹組的OD值顯著大于病毒對照組。表明注射用雙連翹有較強的抑制病毒感染作用。     中藥成分既可通過直接殺滅病毒來保護細胞，也可通過促進細胞生長來抑制病毒的感染。注射用雙連翹主要表現抑制病毒感染作用，對細胞生長無明顯影響。 在量效方面，注射用雙連翹的作用與劑量呈正相關，濃度越高抑制病毒感染作用越強。這些說明注射用雙連翹必須有合適的劑量才能發揮最佳效應。