小檗堿、黃芩苷對小鼠2-細胞胚胎體外培養效果的初步研究

貔貅

摘要：試驗以添加抗菌素的mCZB液為對照組，分別篩選比較了小檗堿、黃芩苷二種中藥成分對小鼠2-細胞胚胎體外培養效果的影響。結果表明：小檗堿和黃芩苷(berberine and baicalin) 最佳濃度分別為0.10μg/ml和4μg/ml，其120h孵化胚胎發育率分別為89.9%和64.1%，與對照組比較差異極顯著(50.7%) (P < 0.01)和顯著(47.8%) (P < 0.05)。說明小檗堿、黃芩苷能有效促進2-細胞胚胎體外生長發育。
關鍵詞：小檗堿，黃芩苷，2-細胞胚胎，體外培養，小鼠
中圖分類號：S814.8文章標識碼：A

Initial Study on Effect of Berberine and Baicalin on 2-cell

Embryos in vitroCulture in Mice
Abstract In this experiment，mCZB medium added in penicillin and dihydrostreptomycin was used as control group, the effect of the Chinese medicines component Berberine and Baicalin on 2-cell embryos in vitro culture from the mice were compared respectively. The results showed that the optimal level of Berberine and Baicalin were 0.10μg/ml and 4μg/ml, the development ratio of hatched blastocyst were 89.9% and 64.1% respectively at 120h, there weresignificantly difference (50.7%) (P < 0.01) and differently (47.8%) (P < 0.05) compared with control group.The results indicated that Berberine and Baicalin could accelerated development of 2-cell embryos in vitro.
Key words：berberine, baicalin , 2-cell embryos , in vitro culture , mice

    體外受精、胚胎分割、動物克隆、胚胎嵌合、胚胎干細胞、轉基因動物等胚胎生物技術的應用，都需借助于胚胎體外培養系統。適宜的體外培養系統是獲得優質胚胎的基礎條件和有效工具。目前，體外培養的胚胎囊胚發育率較低，有相當比例的胚胎在培養過程中凋亡，嚴重影響了胚胎產業化進程，因此，探討改進胚胎體外培養體系十分必要。
    體外培養的基本條件之一是無菌操作，為了防止因操作不嚴格而造成的污染，培養液內一般常常加入一定的抗菌素，最常用的是青霉素和鏈霉素，而抗菌素對體外胚胎的生長發育是否有不良影響，還有待探討；體外培養條件下的胚胎，其代謝會產生一定的自由基，高氧濃度的自由基對胚胎產生毒性[1]，如過氧化氫、過氧化物陰離子、氫氧根離子等影響胚胎的正常卵裂和進一步發育。目前的研究表明，中草藥中的某些有效成份對細胞的增殖有促進作用[2]，而且具有一定的抗氧化作用[3]和激素作用[4]等，而將中藥成分添加到培養基中對胚胎進行體外培養國內外報道甚少。鑒于中藥有效成分多靶點、全方位的藥理作用特點，基于邸冉，高建明（2004)[5]將中藥成分添加到培養基中對小鼠胚胎體外培養的初步研究結果，本試驗以小鼠2-細胞胚胎為材料，在培養液中直接添加小檗堿、黃芩苷中藥成分，比較其對胚胎體外發育的影響，并篩選其最佳濃度，旨在初步建立適宜胚胎體外發育的添加中藥成份的培養體系，從而期望提高胚胎體外發育率和胚胎質量，為今后進一步克服胚胎體外培養系統存在的缺陷開辟一條新的途徑。
材料與方法
1.1 試驗動物
    試驗小鼠為8～10周齡ICR系SPF性成熟小鼠(購自北京試驗動物中心)。雌鼠體重29～32g，雄鼠體重33～35g，雌雄分籠飼養在室溫、自然光照、自由飲水的條件下，采用全價繁殖顆粒飼料飼養。經一周的適應性飼養后，按常規方法對雌鼠進行超數排卵處理。
1.22-細胞胚胎獲取
    根據小鼠陰部變化選擇動情間期和動情前期雌性小鼠[6]于19:00腹腔注射PMSG（批號：20040403，天津試驗動物中心）10IU/只，48h后腹腔注射hCG（批號：20031012，寧波市激素制藥廠）10IU/只，注射hCG后即與公鼠按1:1合籠。次日8:00檢查陰道栓，見陰栓者于注射hCG 47h后以頸部脫臼法處死雌鼠，取出輸卵管和卵巢，置于37 oC mPBS沖卵液中，在體視顯微鏡下分離脂肪和系膜，用4號針頭連接2 ml注射器撕開輸卵管壺腹部獲得2-細胞胚胎。選擇形態正常、卵裂球均一、透明帶完整的胚胎轉入mCZB基礎培養液洗滌3次，然后均勻分布到各試驗組培養液中洗滌2次后入微滴進行培養。
1.3試驗設計
    以mCZB為基礎培養液。初步選出黃連有效成分小檗堿(Berberine，BR；天津藥物研究院)、黃芩有效成分黃芩苷(Baicalin，Bai；天津藥物研究院))作為添加的中藥成分來篩選其對早期胚胎體外發育的影響。共設計2個試驗，分別篩選其適宜濃度（表1）。

表1 試驗組別設計

試驗 設計	對照組		試驗1組	試驗2組	試驗3組	試驗4組	試驗5組
	基礎液	添加雙抗
試驗1	mCZB	青霉素(0.06mg/ml)+鏈霉素(0.07mg/ml)	mCZB +BR (0.08μg/ml)	mCZB +BR (0.09μg/ml)	mCZB +BR (0.10μg/ml)	mCZB +BR (0.11μg/ml)	mCZB +BR (0.12μg/ml)
試驗2	mCZB	青霉素(0.06mg/ml)+鏈霉素(0.07mg/ml)	mCZB +Bai (2μg/ml)	mCZB +Bai (3μg/ml)	mCZB +Bai (4μg/ml)	mCZB +Bai (5μg/ml)	mCZB +Bai (6μg/ml)

1.4 胚胎培養
    在培養皿中按不同試驗組別制備50ml的培養液小滴，覆以礦物油，置入5%CO2、95%空氣、37℃、飽和濕度的CO2培養箱中平衡2h以上。然后將已洗滌好的胚胎，用移卵管吸入到平衡好的培養小滴中，置入培養箱中培養。每個微滴中移入10枚左右的胚胎。入胚后15-h換加葡萄糖mCZB培養液，以后每間隔48h換液一次，分別于入培后48h、72h、96h、120h檢查胚胎發育狀況。

1.5小鼠胚胎發育時期判定
    本試驗不同培養時間胚胎發育形態見表2。

表2胚胎形態學判定[7]

發育時期	形態特征
桑椹胚(M)	卵裂球隱約可見，細胞團的的體積幾乎占滿卵周隙.
致密桑椹(CM)	卵裂球在桑椹的基礎上進一步分裂變小，看不清楚卵裂球的界線，細胞團收縮至卵周間隙的60%～70%。
早期囊胚(EB)	出現透明的囊胚腔，但難以區分清內細胞團和滋養層，細胞團占卵周間隙的70%～80%。
囊胚(B)	囊胚腔增大明顯，內細胞團和滋養層細胞界線清晰，細胞充滿了卵周間隙。
擴張囊胚(XB)	囊胚腔充分擴張，體積增至原來的1.2～1.5倍，透明帶變薄，相當于厚度的1/3。
孵化囊胚(HB)	透明帶破裂，內細胞團脫出透明帶。

1.6 數據處理
    采用DPS專業版統計軟件對數據進行卡方獨立性檢驗。

2 結 果
2.1小檗堿對小鼠2-細胞胚胎體外培養效果的影響
    經8個批次，538枚胚胎的體外培養后，初步篩選出小檗堿5個濃度組，再進一步篩選其最佳濃度。觀察對照組與試驗組對胚胎體外生長發育的影響（見表3）。

表3小檗堿對小鼠2-細胞胚胎發育的影響

試驗1	批次	入培胚胎數量/枚	48h	72h	96h	120h
			(M/入培數) M%	(B/入培數) B%	(XB/入培數)數)XB%	(HB/入培數) HB%
對照組	9	73	(73/73) 100a	(64/73) 87.6a	(53/73) 72.6a	(37/73) 50.7Aa
試驗 1組	8	74	(72/74) 97.3a	(71/74) 95.9a	(67/74) 90.1b	(58/74) 78.3Bb
試驗 2組	8	105	(104/105) 99.0a	(102/105) 97.1a	(99/105) 94.2b	(93/105) 88.6Bc
試驗 3組	8	99	(97/99) 98.0a	(96/99) 97.0a	(96/99) 97.0b	(93/99) 89.9Bc
試驗 4組	9	97	(95/97) 97.9a	(89/97) 91.8a	(85/97) 87.6b	(81/97) 83.5Bc
試驗 5組	8	72	(67/72) 93.1a	(65/72) 90.2a	(62/72) 86.1b	(51/72) 70.8Bb

注：同一豎欄肩注不同大寫字母之間表示差異極顯著（P < 0.01），不同小寫字母之間表示差異顯著（P < 0.05），相同字母之間表示差異不顯著（P > 0.05）。
    由表3可見，體外培養48h、72h，2-細胞胚胎發育至桑椹胚和囊胚發育率，對照組和試驗各組間及試驗組之間均無顯著差異(P > 0.05)。體外培養96h，試驗各組擴張囊胚發育率均顯著好于對照組(72.6%) (P < 0.05)，各試驗組間無顯著差異(P > 0.05)，其中以試驗3組發育率最高(97.0%)；試驗各組120h孵化胚胎發育率極顯著高于對照組（50.7%）(P < 0.01)，試驗組間以試驗2、3、4組孵化胚胎發育率顯著高于試驗1、5組(P < 0.05)，其中以試驗3組發育率最好(89.9%)。

2.2黃芩苷對小鼠2-細胞胚胎體外培養效果的影響
    經5個批次，221枚胚胎的體外培養初步篩選后，選出黃芩苷5個濃度組再進一步篩選其最佳濃度。觀察對照組與試驗組對胚胎體外生長發育的影響（見表4）。

試驗2	批次	入培胚胎數量/枚	48h	72h	96h	120h
			(M/入培數) M%	(B/入培數) B%	(XB/入培數) XB%	(HB/入培數) HB%
對照組	8	90	(85/90) 94.4a	(72/90) 80.0b	(64/90) 71.1b	(43/90) 47.8a
試驗 1組	8	90	(81/90) 90.0a	(71/90) 78.9b	(55/90) 61.1b	(43/90) 47.8a
試驗 2組	8	84	(71/84) 84.5a	(72/84) 85.7b	(55/84) 65.5b	(48/84) 57.1b
試驗 3組	7	78	(72/78) 92.3a	(66/78) 84.6b	(62/78) 79.5b	(50/78) 64.1b
試驗 4組	8	89	(88/89) 98.9a	(77/89) 86.5b	(67/89) 75.3b	(51/89) 57.3b
試驗 5組	6	70	(61/70) 87.1a	(57/70) 81.4b	(49/70) 70.0b	(32/70) 45.7a

表4黃芩苷對小鼠2-細胞胚胎發育的影響

注：同一豎欄肩注不同大寫字母之間表示差異極顯著（P < 0.01），不同小寫字母之間表示差異顯著（P < 0.05），相同字母之間表示差異不顯著（P > 0.05）。

    由表4可見，體外培養2-細胞胚胎48h、72h、96h，對照組和各試驗組及試驗組間胚胎發育率均無顯著差異(P > 0.05)；體外培養120h，試驗2組(57.1%)、試驗3組(64.1%)、試驗4組(57.3%)孵化胚胎發育率顯著高于對照組(47.8%)(P < 0.05)，試驗組間以試驗2、3、4組孵化胚胎發育率顯著高于試驗1、5組(P < 0.05)，其中試驗3組孵化胚胎發育率最高(64.1%)。

3 討 論
    本試驗結果表明小檗堿和黃芩苷二種中藥成分，以小檗堿對胚胎體外培養發育的效果最好。其體外培養的最佳濃度組和孵化胚胎發育率，小檗堿最佳濃度為0.10μg/ml，孵化胚胎發育率89.9%；黃芩苷最佳濃度為4μg/ml，孵化胚胎發育率64.1%。而二個試驗中對照組孵化胚胎的發育率分別為50.7%、47.8%。對比試驗結果可見，中藥成分小檗堿和黃芩苷對胚胎體外生長發育發育起到了積極的促進作用。白照岱等(2004)[8-9]在CZB中添加不同濃度的胰島素和葡萄糖，以及添加不同濃度的表皮生長因子對小鼠2-細胞胚胎體外培養孵化囊胚發育率分別為25.3%和21.2%。可見，本試驗中藥成分對胚胎發育的促進作用非常顯著。
    小檗堿是黃連中的主要有效成分，是一種苯并異喹啉類季銨型生物堿。長期以來對其生化、藥理、臨床的研究，證明它是一種沒有細胞毒和致突變作用、具有廣泛用途的藥物[10]。大量研究表明小檗堿具有廣譜的體外抗菌效果，其低濃度可以抑菌，高濃度可以殺菌，另報道小檗堿抗痢疾桿菌作用強度與磺胺相近，但其作用不受血清的影響，另一方面小檗堿的抗藥菌株產生較多，且無交叉感染[11]。黃芩苷的抗微生物的作用已早為醫學界所認識，其清熱解毒作用的實質就是對細菌和病毒等致病原的抑制或殺滅作用。本試驗中，二種中藥成分各試驗組中均未添加抗菌素，可能與其抑菌作用有一定關系。
    CAMP和cGMP與細胞的增殖、分化和代謝密切相關。cAMP有促進細胞分化的作用，cGMP則具有促進細胞分裂的作用。Manejwala等(1986)[12]研究證明用cAMP類似物培養早期胚胎,能促進囊胚腔的擴張。Hui等(1991)[13]在人血小板體外試驗證明小檗堿可使cAMP升高，亦可抑制其升高，視不同條件而定。推測小檗堿可能對胚胎cAMP和cGMP有積極的作用。生理水平的NO作為信號分子可以對早期胚胎發育產生調節作用也需要通過cGMP實現[14-15]，而NO是一種自由基性質的氣體，分子量小，化學結構簡單，由于其含有一個未成對電子，故有很大的生物活性，它可以自由穿過生物膜，作用于細胞內的靶分子，作為第二信使而發揮信息傳遞的功能，并以相對特異的方式控制多種細胞的功能或生理作用，在受到各種刺激因素，如外來抗原、細菌內毒素、或細胞因子等誘導活化時，誘導NOS（iNOS）可生成大量的有持續活性的NO，參與免疫系統的非特異性防御功能。NO在免疫與炎癥反應中的細胞毒作用也可損傷正常的組織，導致NO的保護與損傷雙重作用[16-17]。NO生成過多且時間過長，可能導致多種病理改變，反之，若NO合成不足又會使NO的生理功能得不到正常的發揮，所以說NO具有兩面性，是“雙刃刀”。Ko等(2000)[18]通過離體大鼠腸系膜動脈研究報道，小檗堿是通過作用于血管內皮和平滑肌細胞兩種途徑而產生血管松馳作用的。血管內皮釋放NO是小檗堿產生血管松弛作用的內皮依賴性機制，說明小檗堿與細胞分泌NO的作用相關。本試驗中，小檗堿極顯著的促進了胚胎的生長發育，是否與直接或間接對胚胎發育的微環境起到調節作用還有待進一步研究。
    胚胎代謝所產生的自由基，如過氧化氫、過氧化物陰離子及氫氧根離子等影響胚胎的正常卵裂。囊胚對過氧化脂質導致的損傷十分敏感[19]。正常小鼠卵母細胞中的H2O2水平較低，1-至8-細胞期的H2O2水平略高于以后各期胚胎的水平。但當在體外培養1-細胞或2-細胞胚胎時，到2-細胞中期時的H2O2水平已經很高，而且一直到整個4-細胞期均居高不下[20]，這種水平的H2O2水平恰好發生在胚胎基因的激活時期。而黃芩苷在清除自由基作用效果明顯。有研究表明黃芩苷對羥自由基、超氧陰離子自由基、烷過氧自由基等有較強的清除作用；對過氧化脂質生成的抑制作用也很明顯[21-23]。這可能是本試驗中添加黃芩苷最佳濃度組結果優于對照組的原因。
    小檗堿、黃芩苷對2-胚胎細胞發育的促進作用通過本試驗可以明顯看出是客觀存在的，其作用機理還有待今后進一步的研究探討。