白頭翁不同提取物及復(fù)方的體外抑菌試驗(yàn)研究

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	白頭翁不同提取物及復(fù)方的體外抑菌試驗(yàn)研究 時(shí)維靜  路振香  李立順 （安徽科技學(xué)院　安徽 鳳陽(yáng)　233100）
	摘要：目的：探討白頭翁湯的體外抑菌作用，旨在為臨床用藥提供依據(jù)。方法：用蒸餾法從白頭翁根中得到原白頭翁素，用乙醇提取純化法得到白頭翁總皂苷，用煎煮法得到白頭翁浸膏，分提白頭翁湯各組成藥物，合煎白頭翁湯。將它們配制成1:1、1:2、1:4梯度濃度的溶液。用K-B紙片擴(kuò)散法對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、副傷寒桿菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。結(jié)果：白頭翁不同提取物、白頭翁湯的組成藥物對(duì)以上細(xì)菌均有抑菌作用。結(jié)論：白頭翁的原白頭翁素抑菌效果最好。復(fù)方抑菌作用不是各組成藥物作用的相加。 關(guān)鍵詞：白頭翁湯；原白頭翁素；白頭翁總皂苷；白頭翁浸膏；體外抑菌     白頭翁湯源自《傷寒論》，由白頭翁15g、黃柏12g、黃連6g、秦皮12g組成[1]。具有清熱解毒、涼血止痢的功效，為中醫(yī)臨床治療熱痢下重的主要方藥。     白頭翁湯的君藥白頭翁為毛茛科多年生白頭翁屬植物白頭翁的根莖。白頭翁的化學(xué)成分主要為皂苷和內(nèi)酯等成分。其中包括白頭翁皂苷A、B、C、D (pulchinenoside A、B、C、D),皂苷1(saponin1)、皂苷2(saponin 2),白樺酯酸(betulinic acid),白樺脂酸-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(betulinic acid 3-O-α-L-arabinopyranoside),3-氧代白樺脂酸(3-oxobetulinic acid),胡蘿卜苷(daucosterol),原白頭翁素(protoanemonin),白頭翁素(anemonin),白頭翁靈(okinalin,C32H64O2),白頭翁英(okinalin,C4H6O2)等[2]。白頭翁藥材的多成分決定了其治療作用的多靶點(diǎn)與多層次。本文將白頭翁根的三種不同的提取物：原白頭翁素、白頭翁總皂苷、白頭翁浸膏，進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，旨在揭示白頭翁湯中君藥的抗菌作用的有效部位。為臨床用藥提供依據(jù)，以便更針對(duì)性的選擇提取方法。     白頭翁湯中的黃連、黃柏含巴馬丁(Palmatine)小檗堿(berbenine) 藥根堿(jatrorrhizine)，秦皮含七葉內(nèi)酯(esculetin)秦皮甙(fraxin)七葉甙(escnlin)等。為白頭翁湯發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。由于湯劑化學(xué)成分的復(fù)雜性和不穩(wěn)定性，對(duì)復(fù)方藥效的研究也是多方面的。本項(xiàng)試驗(yàn)采用分提白頭翁湯各組成藥物與合煎白頭翁湯，制成不同梯度的藥液進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，旨在為臨床應(yīng)用白頭翁湯提供理論依據(jù)。 1材料與方法 1.1材料 1.1.1藥材與試劑     藥材白頭翁、黃連、黃柏、秦皮均購(gòu)自亳州滬樵中藥飲片廠。品種經(jīng)安徽技術(shù)師范學(xué)院中藥實(shí)驗(yàn)室鑒定，白頭翁為毛莨科植物白頭翁Pulsatilla chinensis(Bunge)Regel.的根;黃連為毛莨科植物黃連Coptis chinensis Franch.的根莖飲片;黃柏為蕓香科植物黃蘗Phellodeneron amurense Rupr.去栓皮的樹(shù)皮;秦皮為木犀科植物白蠟樹(shù)Fraxinus chinensis Roxb.的枝皮。營(yíng)養(yǎng)瓊脂(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司)。所用試劑均為分析純。 1.1.2菌株金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、副傷寒桿菌均由安徽技術(shù)師范學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。采用普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。 1.1.3 儀器     循環(huán)真空水泵，SHZ-3型，上海華光儀器表廠；真空干燥箱，ZK-82B型，上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠；電子控溫電熱器，蚌埠市恒信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)研究所；高壓蒸汽滅菌鍋，上海醫(yī)用核子儀器廠；電子分析天平，F(xiàn)A1004型，上海精科天平儀器廠；粉碎機(jī)，JFSD-100型，嘉定糧油檢測(cè)儀器廠；游標(biāo)卡尺，規(guī)格（0～150）㎜×0.02㎜,安徽桐城量具廠生產(chǎn)。索氏提取器、回流冷凝裝置、蒸餾裝置等，滁州千秋玻璃廠。 1.2方法 1.2.1白頭翁三種提取物的提取方法 原白頭翁素的提取     將100克白頭翁生藥根，粉碎成粗粉,加水500ml于水浴上蒸餾，至無(wú)濃的刺激味.餾液放冷，加入約5%的食鹽，用100ml氯仿分次提取，合并提取液。在水浴上回收氯仿100ml，得黃色油狀物約5ml(加入0.1ml冰醋酸作穩(wěn)定劑)，即為原白頭翁素。 白頭翁總皂苷的提取     取白頭翁100g，粉碎成粗粉，分次于索式提取器中，以乙醚回流脫脂，脫脂后的藥粉，晾干，用95%的乙醇600ml，回流6小時(shí)，趁熱過(guò)濾，藥渣用200ml 95%的乙醇洗滌兩次，合并濾液。減壓濃縮至30ml，加入80ml丙酮，即析出白色粉質(zhì)。再使其溶于熱醇60ml，過(guò)濾，將濾液滴入到丙酮-乙醚（1:1）的混合溶劑中，有白色粉質(zhì)沉淀析出（反復(fù)處理兩次）。濾集白色粉質(zhì)，于80℃真空干燥干燥，得白頭翁總皂苷約9g，備用。 白頭翁浸膏的提取     取白頭翁粗粉100g，加水600ml，煎煮提取，第一煎1h，第二煎45min，第三煎30min，趁熱過(guò)濾。合并濾液，減壓濃縮至稠膏狀，于80℃真空干燥，即得浸膏約27.2g。 1.2.2白頭翁三種提取物不同濃度溶液制備：     由于抑菌實(shí)驗(yàn)選用的是不同提取物，因此須計(jì)算為同一當(dāng)量進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)比較,既配制成相當(dāng)于1克生藥溶于1ml水中的1:1濃度溶液。 原白頭翁素液的配制：     100g白頭翁生藥制得原白頭翁素約5ml，即0.05毫升相當(dāng)于1g生藥。取0.5ml原白頭翁素粗品（相當(dāng)于10g藥材）溶于10ml水中，即得1:1濃度的原白頭翁素液。 白頭翁總皂苷液的配制：     100g白頭翁粗粉制得白頭翁總皂苷9g，0.09g白頭翁總皂苷相當(dāng)于1g原藥材。取0.9g白頭翁總皂苷（相當(dāng)于10g原藥材）溶于10ml水中，即得1:1濃度的白頭翁總皂苷液。 白頭翁浸膏液的配制：     100g白頭翁粗粉制得27.2g浸膏，0.272g浸膏相當(dāng)于1g原藥材。取2.72g白頭翁浸膏（相當(dāng)于10g原藥材）溶于10ml水中，即得1:1濃度的白頭翁浸膏液。     從上述三者的1:1濃度的溶液中各取5.0ml于小玻璃瓶中，用梯度濃度配比法配成濃度分別為1:2、1:4的各提取物的水溶液。具體步驟為：取1:1濃度2.5ml加入第二個(gè)小瓶中，再放入2.5ml蒸餾水，充分混勻，即為1:2濃度；再?gòu)?:2濃度的瓶中取出2.5ml溶液加入第三個(gè)小瓶中，再加入2.5ml蒸餾水，充分混勻，即為1:4濃度溶液。 1.2.3白頭翁湯分提與合煎溶液的制備     取白頭翁、黃柏、黃連、秦皮各20g，加水120 ml分別單獨(dú)浸泡30min，回流提取二次，每次30min,合并兩次濾液，均濃縮至20 ml（1:1）備用。     取白頭翁15g、黃柏12g、黃連6g、秦皮12g（共45g）加水270ml 。浸泡30min，回流提取二次，每次30min，合并兩次濾液，濃縮至45 ml（1:1）備用。     取上述白頭翁、黃柏、黃連、秦皮、白頭翁湯1:1濃度提取液，按上述梯度濃度配比法配成濃度分別為1:1、1:2、1:4的各提取物的水溶液。 1.2.4抑菌試驗(yàn) 藥敏紙片的制備：     將普通定性濾紙用打孔機(jī)打成若干圓形紙片，直徑為6.0mm，置于干燥潔凈的試管內(nèi)，放入高壓滅菌鍋中經(jīng)121.3℃、15-20min高壓滅菌后，取出放入恒溫干燥箱內(nèi)進(jìn)行干燥。取經(jīng)干燥后的紙片一定數(shù)量，放入白頭翁根的三種提取物不同濃度溶液中和白頭翁、黃柏、黃連、秦皮、白頭翁湯不同濃度溶液中，浸潤(rùn)后備用[3]。 培養(yǎng)基的制備：     在容量為1000ml的三角燒瓶中加入蒸餾水1000ml，放在電爐上加熱。用天平準(zhǔn)確稱取35.0g營(yíng)養(yǎng)瓊脂，放入三角燒瓶中并不斷攪拌使瓊脂完全溶解，然后放入高壓滅菌鍋中經(jīng)121.3℃、15-20min高壓滅菌，取出趁熱倒入經(jīng)過(guò)高壓滅菌的培養(yǎng)皿中，厚度約3～5mm，冷卻凝固后備用。 參照菌株的培養(yǎng)：     在無(wú)菌操作條件下，用接種環(huán)取大腸桿菌菌株一環(huán)，用劃線法接種在制作好的培養(yǎng)基中，然后用不同接種環(huán)分別以同樣方法對(duì)金黃葡萄球菌，綠膿桿菌，副傷寒桿菌進(jìn)行接種。把各菌種置37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)24h，24h后取出放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br /> 體外抑菌試驗(yàn)：     分別取上述菌株的新鮮培養(yǎng)物，在無(wú)菌操作條件下，用不同涂布棒均勻涂抹在接種過(guò)不同菌種的瓊脂培養(yǎng)基上，再用無(wú)菌鑷子，將在各不同濃度的藥液中浸潤(rùn)的紙片均勻間隔貼于各瓊脂培養(yǎng)基表面，輕壓紙片使接觸良好，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，24h后取出，觀察抑菌圈，測(cè)量并記錄結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑小于9㎜為低度敏感；9.1～11㎜為中度敏感；11.1～15㎜為高度敏感。 2結(jié)果 2.1白頭翁三種提取物抑菌試驗(yàn)結(jié)果（略）     從表1可知：原白頭翁素的抑菌效果明顯，對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、副傷寒桿菌較為敏感。對(duì)大腸桿菌作用較弱。（注：另做乙酸對(duì)照實(shí)驗(yàn)證明原白頭翁素中所加乙酸無(wú)抑菌作用）；白頭翁總皂苷有一定的抑菌效果，對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、副傷寒桿菌、大腸桿菌均有抑菌作用，低濃度時(shí)抑菌作用較弱；白頭翁浸膏液抑菌效果介于兩者之間，有濃度依賴關(guān)系。 2.2白頭翁湯及各組分不同濃度抑菌結(jié)果（略）     從表2可見(jiàn), 四藥單提中黃連對(duì)金黃色葡萄球菌高敏，對(duì)大腸桿菌抑菌作用中等；秦皮對(duì)副傷寒桿菌高敏，綠膿桿菌中敏；黃柏和白頭翁1:1濃度時(shí)對(duì)四種菌達(dá)中敏。從復(fù)方合煎抑菌作用看，白頭翁湯的抑菌作用不是各組成成分效果的加和。對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用不如黃連，對(duì)副傷寒桿菌的抑菌效果不如秦皮。 3討論     原白頭翁素又名原白頭翁腦，原銀蓮花素，為淡黃色油狀液體，有刺激性，在堿性中易被破壞，在pH4-5條件下穩(wěn)定。其沸點(diǎn)為45℃（1.5mmHg），由于其屬于揮發(fā)油類(lèi)成分，因此目前常用水蒸氣蒸餾法制備。白頭翁皂苷是原生苷，因苷類(lèi)是往往與能水解苷的酶共存，常用的方法是甲醇、乙醇或沸水法[4]。浸膏系指用適宜的溶劑浸出有效成分，蒸去全部溶劑并調(diào)整濃度至規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)而制成的劑型[5]。     試驗(yàn)結(jié)果表明：白頭翁根的三種不同的提取物原白頭翁素、白頭翁總皂苷、白頭翁浸膏液均有著不同程度的抑菌作用。且它們的抑菌效果隨著濃度的增加而增強(qiáng)，三者的抑菌效果以原白頭翁素為佳。它們對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、副傷寒桿菌較為敏感，對(duì)大腸桿菌作用相對(duì)弱一些。白頭翁還有很好的抗阿米巴原蟲(chóng)、陰道滴蟲(chóng)作用，現(xiàn)代研究還具有抗腫瘤和提高免疫功能的作用[6]。     白頭翁湯為治熱毒痢疾的首選方，從白頭翁湯合煎與拆方抑菌試驗(yàn)表明：白頭翁湯的抑菌作用不是各組成成分效果的加和。白頭翁湯對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用不如黃連；對(duì)大腸桿菌的抑菌作用不如黃連、黃柏；對(duì)副傷寒桿菌的抑菌效果不如秦皮。提示本方對(duì)痢疾的療效并非主要是通過(guò)抗菌作用實(shí)現(xiàn)的。有試驗(yàn)表明白頭翁湯能顯著降低血漿內(nèi)毒素的作用[7]。本項(xiàng)試驗(yàn)也說(shuō)明，中藥復(fù)方的解毒、涼血作用不能單純用抑菌作用解釋[8]。