葛根素的提取及結(jié)構(gòu)改造

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葛根素的提取及結(jié)構(gòu)改造 郭延生1魏彥明1 梁建平2崔潁2 （1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所）

摘要：為了探索有效的提取工藝和尋求合適的方法以提高葛根素的脂溶性和水溶性，利用醇提法從野葛中提取葛根素，在此基礎(chǔ)上，利用化學(xué)合成的方法對(duì)葛根素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改造。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：葛根素收率為1.41%，純度為97%；合成的兩種新化合物為3ˊ－亞甲基－六氫吡啶-葛根素和3ˊ－亞甲基－四氫吡咯－葛根素。 關(guān)鍵詞：野葛根葛根素提取結(jié)構(gòu)改造     葛根素是由豆科植物野葛（Pueraria lobata(wild.)Ohwi）或甘葛藤（Pueraria thomsonii Benth.）的干燥根中分離提取出的一種黃酮苷，化學(xué)名為4′,7-二羥基－8－D－葡萄糖基異黃酮。作為改善心腦血管循環(huán)的新藥，葛根素毒性小、安全范圍廣、療效好而極具臨床應(yīng)用價(jià)值[1]。但由于科技投入的不足，生產(chǎn)效率低，能耗大，產(chǎn)品缺乏競(jìng)爭(zhēng)力。另外，由于其異黃酮結(jié)構(gòu)水溶性和脂溶性都較差，生物利用度低，限制了它的廣泛應(yīng)用。目前，臨床應(yīng)用的葛根素注射液大多需加入高濃度的丙二醇才能達(dá)到該注射劑要求的藥物濃度，這樣使藥物的粘稠度較大，亦給生產(chǎn)造成過(guò)濾上的麻煩，成本增加[2]。實(shí)驗(yàn)證明大鼠灌胃和臨床口服葛根素的生物利用度都比較低，這在一定程度上影響其療效的發(fā)揮[3]。因此，探索有效的提取工藝和尋求合適的方法提高葛根素的脂溶性和水溶性，對(duì)提高其生物利用度，增強(qiáng)藥理活性具有重要意義。本研究在從野葛中提取葛根素的基礎(chǔ)上，對(duì)其提取物葛根素進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造。同時(shí)，考慮到葛根素的水溶性和以往對(duì)葛根素的結(jié)構(gòu)修飾主要集中在酚羥基和糖C－6??醇羥上，本研究在3ˊ或5′位引進(jìn)不同的Mannich堿，以期增強(qiáng)其藥理活性。此方法不但避免了葛根素的主要官能團(tuán)－酚羥基被也結(jié)合或屏蔽，也可以為異黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)修飾提供一種新的方法。 1材料與方法 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與藥品1.1.1儀器設(shè)備     紫外－可見分光光度計(jì)（HITACHI557,美國(guó)），紅外分光光度儀（HITACHI220-50，美國(guó)DELL公司），核磁共振分析儀(MERCURY 400BBP，美國(guó)),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE120，德國(guó))，分析天平，量筒，100ml三口圓底燒瓶，100ml、50m滴液漏斗，100ml分液漏斗，500ml三角瓶，水泵，蒸餾裝置（包括常壓蒸餾和減壓裝置），磁力攪拌器，紫外燈，80×3cm層析柱，薄層層析板，電熱套，濾紙等。 1.1.2試劑藥品野葛根(購(gòu)自蘭州佛慈制藥廠，產(chǎn)地陜西，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所鑒定)，葛根素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，薄層層析硅膠G(青島海洋化工有限公司)，柱層析硅膠（青島海洋化工分廠，粒度：200－300目）。酸性三氧化二鋁、正丁醇、氯仿、六氫吡啶，四氫吡咯，氯仿，乙醇，95%乙醇，無(wú)水吡啶、甲醇(均為分析純)，氫氧化鈉（固體），無(wú)水硫酸鎂（均為化學(xué)純），羧甲基纖維素鈉(CMC)。 2 實(shí)驗(yàn)方法 2.1 葛根素的提取     采用醇提法[4]，即稱取葛根2000g于三口圓底燒瓶中，加入95%乙醇2000mL,在水浴鍋中（58-60℃）熱浸29h，過(guò)濾，濾液備濃縮為浸膏。將浸膏用400mL水飽和正丁醇和400mL正丁醇交替溶解，即在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)振蕩1h，靜置2h，吸取上清液。上清液用水進(jìn)行萃取，萃取液濃縮至原體積的一半，再用正丁醇萃取，正丁醇萃取液經(jīng)三氧化二鋁柱脫色，再經(jīng)減壓濃縮，濃縮液靜置析出后，抽濾并經(jīng)自然干燥得粗制品0.75kg。取粗制品75g，加入95%的冰醋酸262mL，加熱至116℃溶解，并結(jié)晶得精品28.2g。 2.2 葛根素的結(jié)構(gòu)改造[5.6.7] 2.2.13ˊ－亞甲基－六氫吡啶-葛根素的合成    在三口圓底燒瓶中加入37％－40％的甲醛溶液10mL，在冰浴冷卻的情況下，用滴液漏斗滴加23mL六氫吡啶，維持反應(yīng)溫度在40℃左右，。滴加完畢后，室溫繼續(xù)攪拌2小時(shí)，靜置，溶液出現(xiàn)分層現(xiàn)象，上層為淡黃色的有機(jī)層，下層為水，移至分液漏斗，分出上層，加氫氧化鈉干燥，過(guò)濾，減壓蒸餾，收集85℃－90℃的餾分。精確稱取0.416g葛根素精品與三口圓底燒瓶中，加10mL無(wú)水吡啶溶解，溶液顯黃色，用滴液漏斗緩慢滴加0.4027g餾分。加熱攪拌回流，TLC跟蹤反應(yīng)，反應(yīng)約需8小時(shí)，所得反應(yīng)液用薄層層析板進(jìn)行分離（CH3Cl－CH3OH，2：1），得到淡黃色的晶體（106mg，收率26％）。其合成路線如下： 2.63ˊ－亞甲基－四氫吡咯－葛根素的合成     在三口圓底燒瓶中加入37％－40％的甲醛溶液10mL，在冰浴冷卻的情況下，用分液漏斗滴加16.8mL四氫吡咯，溫度一直保持在50℃以下，同時(shí)用磁力攪拌器攪拌，滴加完畢，室溫繼續(xù)攪拌2小時(shí)，靜置，溶液不分層，深紅色的液體。加氫氧化鈉干燥，放置，過(guò)濾，減壓蒸餾，收集100℃－105℃的餾分。精確稱取0.832g葛根素精品與三口圓底燒瓶中，加20mL無(wú)水吡啶溶解，用滴液漏斗滴加0.308g餾分，加熱攪拌回流，TLC跟蹤反應(yīng)，反應(yīng)約需5小時(shí)，停止反應(yīng)后減壓蒸除溶劑，所得產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱分離（CH3Cl－CH3OH－H2O，95：30：3），得到深紅色的固體結(jié)晶（83mg，收率10％），其合成路線如下： 2.3.葛根素及其衍生物的結(jié)構(gòu)鑒定 2.3.1葛根素提取物的純度分析     稱取干燥至恒重的葛根素5mg，于25mL容量瓶中，加95%的乙醇溶解并稀釋至刻度,吸取0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL溶液 圖3葛根素樣品HNMR圖譜     置10mL容量瓶，以1.0mL95%乙醇精密加水至10mL，搖勻。同時(shí)以1.0ml95%乙醇加水至10mL作空白對(duì)照，在250nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。處理數(shù)據(jù)，得回歸方程為：A=0.0658C+0.2469，r=0.9997。按文獻(xiàn)[8，9]，采用紫外-分光光度計(jì)，精密稱取葛根素25mg于50mL容量瓶中，加95%的乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。吸取1.0mL于25ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，取1.0mL乙醇同樣稀釋作空白對(duì)照，在250nm處測(cè)定吸收度由回歸方程計(jì)算出產(chǎn)品中葛根素的純度。 2.3.2紅外光譜鑒定     紅外光譜采用島津IR-440型紅外光譜儀，KBr壓片法測(cè)定[10]，掃描波長(zhǎng)500－4000cm－1。 2.3.3核磁氫譜（1H NMR）鑒定     將葛根素提取物及其衍生物溶于氘代甲醇[11]（CD3OD-d4）中在Mercury 400MHz核磁共振儀上測(cè)定氫譜，以四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)物。 3.結(jié)果與分析 3.1 葛根素提取物的收率和純度     由2.1和2.3.1可得出葛根素的收率和純度分別為1.41%和97%。 3.2紅外光譜分析[10]     葛根素提取物的IRυKBr Max（cm-1）：3398，1630，1584，1515，1443，1384，1257，1178，1118，1081，1041。與葛根素標(biāo)準(zhǔn)品的紅外數(shù)據(jù)基本一致：3370，1631，1607，1514，1447，1396,1273,1210，1103，1059，1008。     3ˊ－亞甲基－六氫吡啶-葛根素的合成IRv max（KBr）cm－1： 1626、1280、1441、3375、1064、2929、1499、1550、1532、 2282、1709、1725。其中3250－3450間的寬帶（3375）是由氫鍵締合的羥基的伸縮振動(dòng)引起；1709處的強(qiáng)吸收峰是分子中存在的C=O的明顯例證； 1626、1532、1550、1499、1441是苯環(huán)的骨架振動(dòng)引起的典型吸收；1280、1064表明分子中存在C-O－C結(jié)構(gòu)。     3ˊ－亞甲基－四氫吡咯－葛根素的合成IRv max（KBr）cm－1：1123、3404、1625 1279、1441、1386、1550、1512、 615、 1531、798、1708、2282、1724、3717、23483250－3400或3404寬帶（－OH），1708（C=O），1625，1512，1550，1531， 1441，1386（苯環(huán)），1279，1123（C-O-C）。 3.3核磁氫譜（1H NMR）鑒定[11]     葛根素提取物1HNMR（CD3OD-d4，400MHz，TMS內(nèi)標(biāo)）：δ:8.04(1H,d,J=9Hz;C5-H)，6.98(1H,d,J=9Hz;C6-H)，7.36(2H,d,J=9Hz;C2′,6′-H)，6.98(2H，d，=9Hz；C3′,5ˊ-H)，8.14(1H，s;C2-H), 5.09(1H,d,J=10Hz;C1?-H)。     3ˊ－亞甲基－六氫吡啶-葛根素1H NMR（CD3OD-d4，400MHz，TMS內(nèi)標(biāo)）：δ：8.144（1H，s；C2-H），7.97（1H，d；C5-H），7.30（2H ，d，C2ˊ，6ˊ-H），6.91（1H，d，C6-H），6.81（1H，d，C5ˊ-H），5.07（1H，d，C1″-H），3.84（2H，s，Ar-CH2-），2.72（4H，s，－NCH2－），1.68（6H，t，－CH2CH2CH2-）。     3ˊ－亞甲基－四氫吡咯－葛根素1H NMR（CD3OD-d4，400MHz，TMS內(nèi)標(biāo)）：δ：8.249（1H，s；C2-H），8.05（1H，d；C5-H），7.43（2H ，d，C2ˊ，6ˊ-H），6.98（1H，d，C6-H），6.95（1H，d，C5ˊ-H），5.07（1H，d，C1″-H），4.279（2H，s，Ar-CH2－），1.985（4H，t，－NCH2-），1.296（4H，t，－CH2CH2-）。 4.討論     采用紫外分光廣度法對(duì)產(chǎn)品中葛根素的含量及純度進(jìn)行了檢測(cè)，所得產(chǎn)品葛根素收得率為1.41%，純度為97%；潘娓婕等[8]利用酸水解法所得葛根素收得率為1.36%，純度為98.32%，而張尊聽等[9]分離所得葛根素產(chǎn)率為1.2%，純度為93.4%。對(duì)比發(fā)現(xiàn)葛根素收得率比上述兩者都高，純度略低于前者，因此該工藝可進(jìn)行工業(yè)化試生產(chǎn)。     由于大部分藥物的療效是由藥物分子與生物受體分子間的相互作用而產(chǎn)生，因此，藥物分子的溶解性能及分子的大小、形狀和空間結(jié)構(gòu)都很重要。由此我們?cè)O(shè)想通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾來(lái)改善葛根素的水溶性和脂溶性，并改變其空間結(jié)構(gòu)，從而影響葛根素的藥理活性。但目前對(duì)葛根素的結(jié)構(gòu)修飾主要集中在酚羥基和糖C－6??醇羥基[12，13]，但反應(yīng)過(guò)程中結(jié)合和屏蔽了葛根素的主要官能團(tuán)－酚羥基，從而降低了物質(zhì)本身的生物活性。本試驗(yàn)利用Mannich反應(yīng)在葛根素的4′－OH的鄰位引進(jìn)了堿性基團(tuán)，該基團(tuán)可與酸結(jié)合生成鹽，由于鹽類物質(zhì)易溶于水，因此可顯著改善葛根素水溶性差的缺點(diǎn)，同時(shí)避免了與其主要管能團(tuán)－酚羥基發(fā)生反應(yīng)。     王昕[14]等對(duì)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的近四十種葛根黃豆甙元結(jié)構(gòu)改造產(chǎn)物進(jìn)行了對(duì)比，利用分子藥理學(xué)理論，討論了其結(jié)構(gòu)與抗缺氧及雌性激素作用的關(guān)系，對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，一般吸電子基團(tuán)的取代對(duì)抗缺氧作用不利；邵國(guó)賢等[15]根據(jù)抗缺氧實(shí)驗(yàn)觀察到一般吸電子基團(tuán)的取代對(duì)抗缺氧作用不利，而供電子基團(tuán)則有利于抗缺氧，推測(cè)可能是異黃酮的毗喃酮環(huán)上的氧原子的電子云密度與抗缺氧作用有關(guān)。葛根素是異黃酮類化合物，其生理活性與抗缺氧作用存在著極為密切的關(guān)系。據(jù)此推測(cè)本試驗(yàn)合成的2種新化合物其3′或5′取代基都是供電子基團(tuán)，故有利于抗缺氧作用，但是否具有比葛根素較強(qiáng)的藥理活性有待進(jìn)一步研究。

wanglf69

你說(shuō)的葛根素是不是從中草藥中提取？我不懂。