動物疫病實驗室檢驗采樣方法

雨寒

動物疫病實驗室檢驗采樣方法

NY/T 541—2002 前言 動物病料樣品的采集是動物疾病診斷、流行病學調查或免疫監測所不可缺少的重要步驟，在各國的獸醫學標準中都把這一部分納入第一重要內容，廣泛應用于動物疾病流行病學調查、動物檢疫和科研教學。世界動物衛生組織[World Organization for Animal Health(英)，Office Intentional des Epizootic(法)，OIE]推薦的診斷方法中，也將該部分內容列為第一部分內容。 本標準是依據世界動物衛生組織(OIE)《診斷試驗和疫苗標準手冊》(2000版)(Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines ，2000)第1·1.1章"Sampling Methods"的技術要求編寫的。本標準與該章的非原則性差異在于: ——本標準結合本國實踐經驗對操作程序和條件作了更具體的陳述和規定； ——本標準根據GB/T1.1-2000的規定和漢語習慣將該章的陳述性文本改為規范性標準文件。 本標準的附錄A為規范性附錄。 本標準由農業部畜牧獸醫局提出。 本標準由全國動物檢疫標準化技術委員會歸口。 本標準起草單位:農業部動物檢疫所。 本標準主要起草人:吳延功、杜元釗、朱萬光、劉佩蘭、仰惠芬。 1范圍 本標準規定了動物疫病診斷實驗室的樣品采集方法。 本標準適用于病因(原)學、病理組織學、血清學、免疫學等實驗室檢驗所需樣品的采集。 2樣品采集的一般原則和采集前的準備 2.1樣品采集所遵循的一般原則 2.1.1凡發現患畜(包括馬、牛、羊及豬等)有急性死亡時，如懷疑是炭疽，則不可隨意解剖，應采取患畜的血液，萬不得已時局部解剖作脾臟觸片的顯微鏡檢查。只有在確定不是炭疽后，方可進行剖檢。 2.1.2采取病料的種類，根據不同的疾病或檢驗目的，采其相應的臟器、內容物、分泌物、排泄物或其他材料；進行流行病學調查、抗體檢測、動物群體健康評估或環境衛生檢測時，樣品的數量應滿足統計學的要求。采樣時應小心謹慎，以免對動物產生不必要的剌激或損害和對采樣者構成威脅。在無法估計病因時，可進行全面的采集。檢查病變與采集病料應統籌考慮。 2.1.3內臟病料的采取，如患畜已死亡，應盡快采集，最遲不超過6h。 2.1.4血液樣品在采集前一般禁食8h。 2.1.5應做好人身防護，嚴防人畜共患病感染。 2.1.6應防止污染環境，防止疫病傳播，做好環境消毒和病害肉尸的處理。 2.2使用器械的消毒 刀、剪、鑷子等用具煮沸消毒30min，使用前用酒精擦拭，用時進行火焰消毒。器皿(玻制、陶制等)經103kPa高壓30min ，或經160℃干烤2h滅菌；或放于0.5%～1%的碳酸氫鈉(NaHCO3)水中煮沸10min～15min，水洗后，再用清潔紗布擦干，保存于酒精、乙醚等溶液中備用。注射器和針頭放于清潔水中煮沸30min。一般要求使用"一次性"針頭和注射器。采取一種病料，使用一套器械與容器，不可用其再采其他病料或容納其他臟器材料。采過病料的用具應先消毒后清洗。檢查過傳染性海綿狀腦病的器械要放在2mol/L的氫氧化納(NaOH)溶液中浸泡2h以上，才可再使用。 3樣品的采集 3.1血液 3.1.1采血部位 大的哺乳動物可選用頸靜脈或尾靜脈采血，也可采脛外靜脈和乳房靜脈血。毛皮動物小量采血可穿刺耳尖或耳殼外側靜脈，多量采血可在隱靜脈采集，也可用尖刀劃破趾墊0.5cm深或剪斷尾尖部采血。嚙齒類動物可從尾尖采血，也可由眼窩內的血管叢采血；兔可從耳背靜脈、頸靜脈或心臟采血。禽類通常選擇翅靜脈采血，也可通過心臟采血。 3.1.2采血方法 對動物采血部位的皮膚先剃毛(拔毛)，75%的酒精消毒，待干燥后采血，采血可用針管、針頭、真空管或用三棱針穿刺，將血液滴到開口的試管內。禽類等的少量血清樣品的采集，可用塑料管采集。用針頭刺破消毒過的翅靜脈，將血液滴到直徑為3mm～4mm的塑料管內，將一端封口。 3.1.3采血種類 3.1.3.1全血樣品 進行血液學分析，細菌、病毒或原蟲培養，通常用全血樣品，樣品中加抗凝劑。抗凝劑可用0.1%肝素、阿氏液(見第A.l章)(阿氏液為紅細胞保存液，使用時，以1份血液加2份阿氏液)，或枸櫞酸鈉(3.8%～4%的枸櫞酸鈉0.1mL，可抗1mL血液)。采血時應直接將血液滴入抗凝劑中，并立即連續搖動，充分混合。也可將血液放入裝有玻璃珠的滅菌瓶內，震蕩脫纖維蛋白。 3.1.3.2血清樣品 進行血清學試驗通常用血清樣品。用作血清樣品的血液中不加抗凝劑，血液在室溫下靜置2h～4h(防止曝曬)，待血液凝固，有血清析出時，用無菌剝離針剝離血凝塊，然后置4℃冰箱過夜，待大部分血清析出后取出血清，必要時經低速離心分離出血清。在不影響檢驗要求原則下可因需要加入適宜的防腐劑。做病毒中和試驗的血清避免使用化學防腐劑(如硼酸、硫柳汞等)。若需長時間保存，則將血清置20℃以下保存，但要盡量防止或減少反復凍融。樣品容器上貼詳細標簽。3.1.3.3血漿的采集 采血試管內先加上抗凝劑(每10mL血加檸檬酸鈉0.04g～0.05g)，血液采完后，將試管顛倒幾次，使血液與抗凝劑充分混合，然后靜止，待細胞下沉后，上層即為血漿。 3.2一般組織 3.2.1采樣方法 用常規解剖器械剝離死亡動物的皮膚，體腔用消毒的器械剝開，所需病料按無菌操作方法從新鮮尸體中采集。剖開腹腔后，注意不要損壞腸道。 作病原分離用:進行細菌、病毒、原蟲等病原分離所用組織塊的采集，可用一套新消毒的器械切取所需器官的組織塊，每個組織塊應單獨放在已消毒的容器內，容器壁上注明日期、組織或動物名稱。注意防止組織間相互污染。 3.2.2采樣種類 3.2.2.1病原分離樣品的采集 用于微生物學檢驗的病料應新鮮，盡可能的減少污染。用于細菌分離的樣品的采集，首先以燒紅的刀片燙烙臟器表面，在燒烙部位刺一孔，用滅菌后的鉑耳伸入孔內，取少量組織或液體，作涂片鏡檢或劃線接種于適宜的培養基上。 3.2.2.2組織病理學檢查樣品的采集 采集包括病灶及臨近正常組織的組織塊，立即放入10倍于組織塊的10%福爾馬林溶液中固定。組織塊厚度不超過0.5cm，切成1cm2～2cm2 (檢查狂犬病則需要較大的組織塊)。組織塊切忌擠壓、刮摸和用水洗。如作冷凍切片用，則將組織塊放在0℃～4℃容器中，盡快送實驗室檢驗。 3.3腸內容物或糞便 腸道只需選擇病變最明顯的部分，將其中的內容物棄去，用滅菌生理鹽水輕輕沖洗；也可燒烙腸壁表面，用吸管扎穿腸壁，從腸腔內吸取內容物，將腸內容物放入盛有滅菌的30%甘油鹽水緩沖保存液(見第A.2章)中送檢。或者，將帶有糞便的腸管兩端結扎，從兩端剪斷送檢。 從體外采集糞便，應力求新鮮。或者，用拭子小心地插到直腸粘膜表面采集糞便，然后將拭子放入盛有滅菌的30%甘油鹽水緩沖保存液中送檢。 3.4胃液及瘤胃內容物 3.4.1胃液采集 胃液可用多孔的胃管抽取。將胃管送入胃內，其外露端接在吸引器的負壓瓶上，加負壓后，胃液即可自動流出。 3.4.2瘤胃內容物采集 反芻動物在反芻時，與食團從食道逆入口腔時，立即開口拉住舌頭，另一只手深入口腔即可取出少量的瘤胃內容物。 3.5呼吸道 應用滅菌的棉拭子采集鼻腔、咽喉或氣管內的分泌物，蘸取分泌物后立即將拭子浸入保存液中，密封低溫保存。常用的保存液有pH7.2～7.4的滅菌肉湯(見第A.3章)或磷酸鹽緩沖鹽水，如準備將待檢標本接種組織培養，則保存于含0.5%乳蛋白水解物的漢克氏(Hanks)液中。一般每支拭子需保存液5mL。 3.6生殖道 可采集陰道或包皮沖洗液，或者采用合適的拭子，有時也可用尿道拭子采集。 3.7眼睛 眼結膜表面用拭子輕輕擦拭后，放在滅菌的30%甘油鹽水緩沖保存液中送檢。有時，也采取病變組織碎屑，置載玻片上，供顯微鏡檢查。 3.8皮膚 病料直接采自病變部位，如病變皮膚的碎屑、未破裂水泡的水泡液、水泡皮等。 3.9胎兒 將流產后的整個胎兒，用塑料薄膜、油布或數層不透水的油紙包緊，裝入木箱內，立即送往實驗室。 3.10小家畜及家禽 將整個尸體包入不透水塑料薄膜、油紙或油布中，裝入木箱內，送往實驗室。 3.11骨 需要完整的骨標本時，應將附著的肌肉和韌帶等全部除去，表面撒上食鹽，然后包入浸過5%石炭酸溶液的紗布中，裝入不漏水的容器內送往實驗室。 3.12腦、脊髓 3.12.1全腦、脊髓的采集 如采取腦、脊髓做病毒檢查，可將腦、脊髓浸入30%甘油鹽水液中或將整個頭部割下，包入浸過消毒液的紗布中，置于不漏水的容器內送往實驗室。 3.12.2腦、脊髓液的采集 3.12.2.1采樣前的準備 采樣使用特制的專用穿刺針，或用長的封閉針頭(將針頭稍磨鈍，并配以合適的針芯)；采樣前，術部及用具均按常規消毒。3.12.2.2采樣方法 3.12.2.2.1頸椎穿刺法:穿刺點為環樞孔。將動物實施站立或橫臥保定，使其頭部向前下方屈曲，術部經剪毛消毒，穿刺針與皮膚面呈垂直緩慢刺入。將針體刺入蛛網膜下腔，立即拔出針芯，腦脊髓液自動流出或點滴狀流出，盛入消毒容器內。 3.12.2.2.2腰椎穿刺法:穿刺部位為腰薦孔。實施站立保定，術部剪毛消毒后，用專用的穿刺針刺入，當刺入蛛網膜下腔時，即有腦脊髓液滴狀滴出或用消毒注射器抽取，盛入消毒容器內。 3.12.2.3采樣數量 大型動物頸部穿刺一次采集量35mL～70mL，腰椎穿刺一次采集量15mL～30mL。 3.13液體病料 采集膽汁、膿、粘液或關節液等樣品時，用燙烙法消毒采樣部位，用滅菌吸管、毛細吸管或注射器經燙烙部位插入，吸取內部液體材料，然后將材料注入滅菌的試管中，塞好棉塞送檢。也可用接種環經消毒的部位插入，提取病料直接接種在培養基上。 供顯微鏡檢查的膿、血液及粘液抹片的制備方法:先將材料置玻片上，再用一滅菌玻棒均勻涂抹或另用一玻片推抹。組織塊、致密結節及膿汁等亦可在兩張玻片中間，然后沿水平面向兩端推移。用組織塊作觸片時，持小鑷將組織塊的游離面在玻片上輕輕涂抹即可。 3.14乳汁 乳房先用消毒藥水洗凈(取乳者的手亦應事先消毒)，并把乳房附近的毛刷濕，最初所擠的3～4把乳汁棄去，然后再采集10mL左右乳汁于滅菌試管中。進行血清學檢驗的乳汁不應凍結、加熱或強烈震動。 3.15精液 精液樣品用人工方法采集，所采樣品應包括"富精"部分，并避免加入防腐劑。 3.16尿液的采集 在動物排尿時，用潔凈的容器直接接取。也可使用塑料袋，固定在雌畜外陰部或雄畜的陰莖下接取尿液。采取尿液，宜早晨進行。 3.17環境 為監測環境衛生或調查疾病，可從遺棄物、通風管、下水道、孵化廠或屠宰場采集有代表性樣品。 4送檢樣品的記錄 送往實驗室的樣品應有一式三份的送檢報告，一份隨樣品送實驗室，一份隨后寄去，另一份備案。樣品記錄至少應包括以下內容: a)畜主的姓名和畜禽場的地址； b)畜(農)場里飼養的動物品種及其數量； c)被感染的動物種類； d)首發病例和繼發病例的日期及造成的損失； e)感染動物在畜群中的分布情況； f)死亡動物數、出現臨床癥狀的動物數量及其年齡； g)臨床癥狀及其持續時間，包括口腔、眼睛和腿部的情況，產奶或產蛋的記錄，死亡情況和時間，免疫和用藥情況等； h)飼養類型和標準，包括飼料種類； i)送檢樣品清單和說明，包括病料的種類、保存方法等； j)動物治療史； k)要求做何種試驗； l)送檢者的姓名、地址、郵編和電話； m)送檢日期。 5樣品的運送 所采集的樣品以最快最直接的途徑送往實驗室。如果樣品能在采集后24h內送抵實驗室，則可放在4℃左右的容器中運送。只有在24h內不能將樣品送往實驗室并不致影響檢驗結果的情況下，才可把樣品冷凍，并以此狀態運送。根據試驗需要決定送往實驗室的樣品是否放在保存液中運送。 要避免樣品泄漏。裝在試管或廣口瓶中的病料密封后裝在冰瓶中運送，防止試管和容器傾倒。如需寄送，則用帶螺口的瓶子裝樣品，并用膠帶或石蠟封口。將裝樣品的并有識別標志的瓶子放到更大的具有堅實外殼的容器內，并墊上足夠的緩沖材料。空運時，將其放到飛機的加壓艙內。 制成的涂片、觸片、玻片上注名號碼，并另附說明。玻片兩端用細木條分隔開，層層疊加，底層和最上一片，涂面向內，用細線包扎，再用紙包好，在保證不被壓碎的條件下運送。 所有樣品都要貼上詳細標簽。 附錄A (規范性附錄) 待檢樣品保存液的配制 A.1阿(Alserer)氏液 葡萄糖　　　　　　　　　　　　　　　2.05g 檸檬酸鈉(Na3C6H5O7·2H2 O) 　　　　　　　　　0.80g 氯化鈉(NaCl) 　　　　　　　　　　　0.42g 蒸鎦水(或無離子水) 　　　　　　　　加至100mL 溶解后，以10%檸檬酸調至pH為6.1分裝后，70kPa 10 min滅菌，冷卻后4℃保存備用。 A.2 30%甘油鹽水緩沖液 甘油　　　　　　　　　　　30mL 氯化鈉　　　　　　　　　　4.2g 磷酸二氫鉀　　　　　　　　1.0g 磷酸氫二鉀　　　　　　　　3.lg 0.02%酚紅　　　　　　　　1.5mL 蒸餾水　　　　　　　　　　加至100mL 加熱溶化，校正pH值為7.6，100 kPa 15min滅菌，冰箱保存備用。 A.3肉湯(broth) 牛肉膏　　　　　　　　3.5g 蛋白胨　　　　　　　　10g 氯化鈉　　　　　　　　5g 充分混合后，加熱溶解，校正pH為7.2～7.4，再用流通蒸氣加熱30min，用濾紙過濾，獲苗黃色透 明液體，分裝于試管或燒瓶中，以100kPa20min滅菌。保存于冰箱中備用。

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樣品的數目怎么確定，才能符合統計學的要求。