飼料蛋白質

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有什么簡單有效的方法測量飼料中的蛋白質含量

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凱氏定氮是測CP最簡單的了

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什么是凱氏定氮是測CP　要怎么搞

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凱氏定氮法是分析有機化合物含氮量的常用方法。要測定有機物含氮量，通常是設法使其轉變成無機氮，再進行測定。 凱氏定氮法首先將含氮有機物與濃硫酸共熱，經一系列的分解、碳化和氧化還原反應等復雜過程，最后有機氮轉變為無機氮硫酸銨，這一過程稱為有機物的消化。為了加速和完全有機物質的分解，縮短消化時間，在消化時通常加入硫酸鉀、硫酸銅、氧化汞、過氧化氫等試劑，加入硫酸鉀可以提高消化液的沸點而加快有機物分解，除硫酸鉀外，也可以加入硫酸鈉、氯化鉀等鹽類類提高沸點，但效果不如硫酸鉀。硫酸銅起催化劑的作用。凱氏定氮法中可用的催化劑種類很多，除硫酸銅外，還有氧化汞、汞、硒粉、鉬酸鈉等，但考慮到效果、價格及環境污染等多種因素，應用最廣泛的是硫酸銅。使用時常加入少量過氧化氫、次氯酸鉀等作為氧化劑以加速有機物氧化。消化完成后，將消化液轉入凱氏定氮儀反應室，加入過量的濃氫氧化鈉，將NH4+轉變成NH3，通過蒸餾把NH3驅入過量的硼酸溶液接受瓶內，硼酸接受氨后，形成四硼酸銨，然后用標準鹽酸滴定，直到硼酸溶液恢復原來的氫離子濃度。滴定消耗的標準鹽酸摩爾數即為NH3的摩爾數，通過計算即可得出總氮量。在滴定過程中，滴定終點采用甲基紅-次甲基藍混合指示劑顏色變化來判定。測定出的含氮量是樣品的總氮量，其中包括有機氮和無機氮。 以蛋白質為例，反應式如下： 消化：蛋白質 + H2SO4→（NH4）2SO4 + SO2↑+ CO2 ↑+ H2O 蒸餾：（NH4）2SO4 + 2NaOH→ Na2SO4 + 2 H2O + 2NH3 ↑ 2NH3 + 4H3BO3→（NH4）2B4O7 + 5H2O 滴定：（NH4）2B4O7 + 2HCl + 5H2O→2NH4Cl + 4 H3BO3 蛋白質是一類復雜的含氮化合物，每種蛋白質都有其恒定的含氮量[約在14％~18％，平均為16％（質量分數）]。凱氏定氮法測定出的含氮量，再乘以系數6.25，即為蛋白質含量。 本法適用于測定0.2～1.0mg氮的樣品測定。 通過本實驗使學生能理解凱氏定氮法的原理，掌握凱氏定氮法的操作方法。 [方法和步驟] （一）消化 1、準備6個凱氏燒瓶，標號。1、2、3號燒瓶中分別加入適當濃度的蛋白溶液1.0mL，樣品要加到燒瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶頸上。再依次加入硫酸鉀-硫酸銅接觸劑0.3g，濃硫酸2.0mL，30%過氧化氫1.0mL。4、5、6號燒瓶作為空白對照，用以測定試劑中可能含有的微量含氮物質，對樣品測定進行校正。4、5、6號燒瓶中加入蒸餾水1.0mL代替樣液，其余所加試劑與1、2、3號燒瓶相同。 2、將加好試劑的各燒瓶放置消化架上，接好抽氣裝置。先用微火加熱煮沸，此時燒瓶內物質炭化變黑，并產生大量泡沫，務必注意防止氣泡沖出管口。待泡沫消失停止產生后，加大火力，保持瓶內液體微沸，至溶液澄清后，再繼續加熱使消化液微沸15min。在消化過程中要隨時轉動燒瓶，以使內壁粘著物質均能流入底部，以保證樣品完全消化。消化時放出的氣體內含SO2，具有強烈刺激性，因此自始自終應打開抽水泵將氣體抽入自來水排出。整個消化過程均應在通風櫥中進行。消化完全后，關閉火焰，使燒瓶冷卻至室溫。 （二）蒸餾和吸收 蒸餾和吸收是在微量凱氏定氮儀內進行的。凱氏定氮蒸餾裝置種類甚多，大體上都由蒸氣發生、氨的蒸餾和氨的吸收三部分組成。 1、儀器的洗滌 儀器安裝前，各部件需經一般方法洗滌干凈，所用橡皮管、塞須浸在10%NaOH溶液中，煮約10min，水洗、水煮10min，再水洗數次，然后安裝并固定在一只鐵架臺上。 儀器使用前，微量全部管道都須經水蒸氣洗滌，以除去管道內可能殘留的氨，正在使用的儀器，每次測樣前，蒸氣洗滌5min即可。較長時間未使用的儀器，重復蒸氣洗滌，不得少于三次，并檢查儀器是否正常。仔細檢查各個連接處，保證不漏氣。 首先在蒸氣發生器中加約2/3體積蒸餾水，加入數滴硫酸使其保持酸性，以避免水中的氨被蒸出而影響結果，并放入少許沸石（或毛細管等），以防爆沸。沿小玻杯壁加入蒸餾水約20mL讓水經插管流入反應室，但玻杯內的水不要放光，塞上棒狀玻塞，保持水封，防止漏氣。蒸氣發生后，立即關閉廢液排放管上的開關，使蒸氣只能進入反應室，導致反應室內的水迅速沸騰，蒸出蒸氣由反應室上端口通過定氮球進入冷凝管冷卻，在冷凝管下端放置一個錐形瓶接收冷凝水。從定氮球發燙開始計時，連續蒸煮5min，然后移開煤氣燈。沖洗完畢，夾緊蒸氣發生器與收集器之間的連接橡膠管，由于氣體冷卻壓力降低，反應室內廢液自動抽到反應室外殼中，打開廢液排出口夾子放出廢液。如此清洗2～3次，再在冷凝管下換放一個盛有硼酸-指示劑混合液的錐形瓶使冷凝管下口完全浸沒在溶液中，蒸餾1～2min，觀察錐形瓶內的溶液是否變色。如不變色，表示蒸餾裝置內部已洗干凈。移去錐形瓶，再蒸餾1～2min，用蒸餾水沖洗冷凝器下口，關閉煤氣燈，儀器即可供測樣品使用。 2、無機氮標準樣品的蒸餾吸收 由于定氮操作繁瑣，為了熟悉蒸餾和滴定的操作技術，初學者宜先用無機氮標準樣品進行反復練習，再進行有機氮未知樣品的測定。常用巳知濃度的標準硫酸銨測試三次。 取潔凈的100mL錐形瓶五只，依次加入2%硼酸溶液20mL，次甲基藍-甲基紅混合指示劑（呈紫紅色）3～4滴，蓋好瓶口待用。取其中一只錐形瓶承接在冷凝管下端，并使冷凝管的出口浸沒在溶液中。注意：在此操作之前必須先打開收集器活塞，以免錐形瓶內液體倒吸。準確吸取2mL硫酸銨標準液加到玻杯中，小心提起棒狀玻塞使硫酸銨溶液慢慢流入蒸餾瓶中，用少量蒸餾水沖洗小玻杯3次，一并放人蒸餾瓶中。然后用量筒向小玻杯中加入10 mL 30％NaOH溶液，使堿液慢慢流入蒸餾瓶中，在堿液尚未完全流入時，將棒狀玻塞蓋緊。向小玻杯中加約5mL蒸餾水，再慢慢打開玻塞，使一半水流入蒸餾瓶，一半留在小玻杯中作水封。關閉收集器活塞，加熱蒸氣發生器，進行蒸餾。錐形瓶中的硼酸-指示劑混合液由于吸收了氨，由紫紅色變成綠色。自變色時起，再蒸餾3～5min，移動錐形瓶使瓶內液面離開冷凝管下口約lcm，并用少量蒸餾水沖洗冷凝管下口，再繼續蒸餾1min，移開錐形瓶，蓋好，準備滴定。 在一次蒸餾完畢后，移去煤氣燈，夾緊蒸氣發生器與收集器間的橡膠管，排除反應完畢的廢液，用水沖洗小玻杯幾次，并將廢液排除。如此反復沖洗干凈后，即可進行下一個樣品的蒸餾。按以上方法用標準硫酸銨再做兩次。另取2mL蒸餾水代替標準硫酸銨進行空白測定二次。將各次蒸餾的錐形瓶一起滴定。 3、未知樣品及空白的蒸餾吸收 將消化好的蛋白樣品三支，空白對照液三支，依次作蒸餾吸收。 加5mL熱的蒸餾水至消化好的樣品或空白對照液中，通過小玻杯加到反應室中，再用熱蒸餾水洗滌小玻杯3次，每次用水量約3mL，洗滌液一并倒入反應室內。其余操作按標準硫酸銨的蒸餾進行。 由于消化液內硫酸鉀濃度高而呈粘稠狀，不易從凱氏燒瓶內倒出，必須加入熱蒸餾水5 mL稀釋之，如果有結晶析出，必須微熱溶解，趁熱加入玻杯，使其流入反應室。此外，還應當注意趁儀器洗滌尚未完全冷卻時立即加入樣品或空白對照液，否則消化液通過冷卻的管道容易析出結晶，造成堵塞。 （三）滴定 樣品和空白蒸餾完畢后，一起進行滴定。 打開接受瓶蓋，用酸式微量滴定管以0.0100mol/L的標準鹽酸溶液進行滴定。待滴至瓶內溶液呈暗灰色時，用蒸餾水將錐形瓶內壁四周淋洗一次。若振搖后復現綠色，應再小心滴入標準鹽酸溶液半滴，振搖觀察瓶內溶液顏色變化，暗灰色在一二分鐘內不變，當視為到達滴定終點。若呈粉紅色，表明已超越滴定終點，可在已滴定耗用的標準鹽酸溶液用量中減去0.02mL，每組樣品的定氮終點顏色必須完全一致。空白對照液接受瓶內的溶液顏色不變或略有變化尚未出現綠色，可以不滴定。記錄每次滴定耗用標準鹽酸溶液毫升數，供計算用。 [結果與計算] 運算下列公式計算出每次無機氮標準樣品和未知樣品的總含氮量。 式中 WN——每毫升樣品的含氮毫克數； A——滴定樣品消耗的鹽酸量（mL）； B——滴定空白消耗的鹽酸量（mL）； C——測定樣品所取用量（mL）； 0.0100——標準鹽酸物質的量濃度（mol/L）； 14.008——每摩爾氮原子質量（g/mol）。 三次樣品測定的含氮量相對誤差應小于±2%。 樣品粗蛋白含量＝總氮量× 6.25 6.25為含氮量換算為蛋白質含量的系數。.這個系數來自蛋白質平均含氮量為16％，實際上各種蛋白質因氨基酸組成不同，含氮量不完全相同。

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