豬胰脂酶熱穩定性的研究

dazhui · 發表于 2008-4-2 11:09:02

近年來關于脂肪酶催化酯交換反應的報道越來越多，其應用越來越廣泛。但實際應用中，游離酶存在不少缺點，其中熱穩定性較差是最重要的缺點之一。故從二十世紀六十年代起[1，2]，發展起來一項新技術——酶的固定化技術，與游離酶相比有顯著的優點，對于熱穩定性的影響較為顯著。本文研究了從豬胰臟中提取的豬胰脂酶催化的最適溫度和固定于豬骨頭后的固定化酶的最適溫度和儲藏穩定性。 1 實驗材料與方法 1.1實驗材料豬胰脂酶（實驗室自制），豬骨頭（自制，乙醚處理、洗滌），橄欖油，試劑均為分析純。 1.2主要實驗儀器 PHS-3B精密pH計（上海雷磁儀器廠）、恒溫磁力攪拌器（上海）等。 1.3主要實驗方法 1.3.1豬胰脂酶的提取[3]。 1.3.2豬胰脂酶的固定化方法稱取一定量的豬胰脂酶（5.0g）在冰浴中加入到一定體積（50ml）pH值為6.5、離子強度為0.03M的磷酸鹽緩沖溶液中溶解，然后加入一定量（12.5g）的豬骨頭，在0℃下攪拌1小時，離心后，用緩沖溶液洗滌。然后常溫下真空干燥，放入冰箱儲存備用。 1.3.3胰脂酶活力的測定方法[3]。 1.3.4豬胰脂酶的最適溫度的測定將一定量的豬胰脂酶在不同的溫度下按1.3.3測酶活。 1.3.5固定化豬胰脂酶熱失活研究將固定化豬胰脂酶置于培養箱中，在不同溫度下（30℃~60℃）保持一定時間。然后按1.3.3測酶活。 2 結果與討論豬胰脂酶固定化前后酶活分別為1.96U和0.71U，固定化后酶活的降低主要是由于測定酶活時，酶的質量按固定化后的總量，而非酶的絕對質量。 2.1豬胰脂酶的最適溫度圖1 游離與固定化豬胰脂酶最適溫度從圖1中可以看出，豬胰脂酶在固定化后最適溫度從40℃提高為55℃。豬胰脂酶在固定化后，可能是結構得到了加固，在受熱時，結構變化較小，使酶的二級、三級等高級結構不易發生變化。故酶在固定化后，最適溫度得到提高，其使用范圍更加廣泛。 2.2固定化豬胰脂酶熱失活研究圖2 保溫時間與剩余酶活圖從圖2可以看出固定化豬胰脂酶在30℃條件下保存，酶活變化不大，而60℃酶活下降較為明顯。其中剩余酶活（活力）指不同溫度下保溫的酶的酶活與未保溫酶的酶活的比值乘以100。圖3 保溫時間與Ln（et/e0）圖酶的一步失活模型方程可表示為et=e0exp（-kdt）[1，2]，變形為Ln（et/e0）= -kt，其中e0、et分別指起始酶活和剩余酶活，t指時間。用Ln（et/e0）對t作圖，見圖3，30℃，40℃，50℃及60℃的回歸方程和相關系數分別為：Y=4.61，R2=0.998；Y=-0.0037X+4.61，R2=0.925；Y=-0.0118X+4.61，R2=0.925；Y=-0.045X+4.61，R2=0.825，以上的R2值均大于R2（0.01）（6）=0.700，故以上回歸方程高度顯著。通過圖3可以看出固定化豬胰脂酶失活符合酶的一步失活模型。圖4 保溫溫度與酶失活常數圖通過不同溫度下的（-k）對溫度作圖，見圖4，可以清楚地看出溫度越高失活越快，特別是超過50℃后。 3 結論 3.1 豬胰脂酶在固定化后，熱穩定性得到提高，最適溫度從40℃提高到55℃。 3.2 固定化豬胰脂酶失活符合酶的一步失活模型，當儲藏溫度高于50℃時，酶失活速率加快。