牛結(jié)核病體外免疫診斷技術(shù)

醫(yī)獸堂

摘  要:  牛分支桿菌感染的主要特征是引起細胞免疫反應(yīng)。現(xiàn)在牛結(jié)核病的診斷試驗是以T細胞反應(yīng)機制為基礎(chǔ)的。低敏感性的結(jié)核血清學(xué)試驗是不值得提倡的，血清學(xué)試驗最好作為細胞學(xué)試驗的補充而不是替代。最近，發(fā)現(xiàn)了牛結(jié)核γ干擾素試驗是一種快速的（24 h）惟一使用全血的體外試驗，該方法在澳大利亞應(yīng)用，結(jié)果表明，比傳統(tǒng)的結(jié)核菌素法診斷牛結(jié)核更敏感。假陽性反應(yīng)的難題歸因于所使用的抗原制品間的交叉反應(yīng)特性，設(shè)動物對牛PPD和禽PPD的γ干擾素反應(yīng)作對照可解決假陽性的問題。雖然牛結(jié)核特異性蛋白已確認并被分類，這些特異性蛋白可能在血清學(xué)或細胞學(xué)診斷試驗中使用，但是它們可能因牛對牛分支桿菌感染的免疫反應(yīng)的遺傳多樣性而受到限制。?

　　關(guān)鍵詞： 牛分支桿菌;酶聯(lián)免疫吸附試驗;γ干擾素;單一結(jié)核菌素試驗?

　　結(jié)核菌素試驗是廣泛使用的最古老的免疫學(xué)試驗方法之一。自從羅伯特·庫克首次在1891年提出了結(jié)核菌素反應(yīng)，這種試驗一直應(yīng)用于動物和人結(jié)核病的免疫診斷。盡管傳統(tǒng)的結(jié)核菌素試驗得到了廣泛的應(yīng)用，但已證實該方法存在的問題。一些詳細研究牛單一結(jié)核菌素試驗（SIDT）的敏感性和特異性的文獻指出，在某種情況下，這種試驗方法的敏感性會大大下降。 Francis J等(1978)重復(fù)了該項工作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SIDT的敏感性只是中等水平（平均72%）。Wood P R等發(fā)現(xiàn)SIDT的敏感性為65.6%。??
　　雖然SIDT的特異性一般很高（98.8%），但在一些國家的一些畜群和一些特殊群體中，可因抗原與非典型結(jié)核分支桿菌間的交叉反應(yīng)而出現(xiàn)假陽性。另外,該試驗結(jié)果需要3 d，并且被檢牛在60 d~90 d內(nèi)不能再接受檢查。因此,亟待探索診斷結(jié)核病的替代試驗。?
　　1  血清學(xué)檢查?  
　　對牛結(jié)核病的早期血清學(xué)研究有各種不同的試驗，如皂土絮狀沉淀試驗、kaolin凝集試驗、直接熒光抗體試驗和補體結(jié)合試驗。所有這些試驗系統(tǒng)都使用粗制抗原制品，且非感染牛和其他分支桿菌感染的動物與該血清具有廣泛的交叉反應(yīng)，與較低的特異性問題一樣，這些血清學(xué)試驗也有很低的敏感性，而那些結(jié)核病牛的檢測結(jié)果卻是陰性。從這些早期研究中得到的惟一可喜的成果是在提高抗體效價和感染的嚴重程度之間存在相關(guān)性，也發(fā)現(xiàn)牛結(jié)核菌素試驗陽性者中抗體反應(yīng)有所提高。?
　　Thoen C A等首次報道了用結(jié)核純化蛋白提取物作抗原來進行牛結(jié)核病的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），在ELISA的早期研究中,Ritacco V等報道了其對牛結(jié)核病的敏感性為90%，特異性為89.8%但是后來該研究組成員對ELISA進行了更深入的研究，發(fā)現(xiàn)ELISA的敏感性下降至73.6%。Plackett等報道，曾對感染牛分支桿菌但對牛結(jié)核菌素試驗沒有反應(yīng)的動物進行了ELISA試驗檢測。但因抗體試驗的低敏感性，他們提議將ELISA作為結(jié)核菌素試驗的補充試驗。據(jù)報道，經(jīng)超聲處理的牛分支桿菌樣品用ELISA檢測發(fā)現(xiàn)其特異性很差，這可能是因為樣品中的廣泛交叉反應(yīng)熱激蛋白的濃度要比培養(yǎng)濾液蛋白高的緣故。從結(jié)核病的早期血清學(xué)試驗認識到，因分支桿菌間有廣泛抗原交叉反應(yīng)，故特異性抗原在發(fā)生特異性抗體反應(yīng)中是必要的。因牛分支桿菌的主要抗原已經(jīng)分離到且序列已測出，現(xiàn)在很容易解釋分支桿菌的早期血清學(xué)研究中的交叉反應(yīng)性高的原因。除了已知的非蛋白抗原間的交叉反應(yīng)外，還知道結(jié)核分支桿菌的許多主要蛋白抗原與分支桿菌屬有同源性，且與很多其他菌類有同源性。Fifis等報道，一種較大的牛分支桿菌特異性蛋白（MPT70）的使用大大提高了ELISA檢測牛結(jié)核病的特異性。盡管在Harboe M等的研究中MPT70的敏感性低,但他們還是支持其抗體效價和遲發(fā)性超敏反應(yīng)之間是負相關(guān)性。?
　　在用牛分支桿菌的實驗性感染過程中，雖然不同動物間反映出感染動物的數(shù)量非常不同，但發(fā)現(xiàn)在第19周至第28周間MPT70的抗體反應(yīng)很低，然后逐漸增加。牛分支桿菌感染牛的結(jié)核菌素試驗結(jié)果表明，可以誘導(dǎo)對MPT70的很強的免疫記憶抗體反應(yīng)。幾種研究表明，這種免疫記憶影響著后來的結(jié)核菌素試驗，在這些研究中選用了一些結(jié)核菌素試驗陽性的感染牛作為實驗動物。?
　　為了研究MPT70-ELISA的敏感性和特異性，使用了一批經(jīng)過選擇的血清樣，牛分支桿菌培養(yǎng)陽性牛109例，培養(yǎng)陰性牛229例，這229頭陰性牛中4頭在ELISA檢測中呈陽性，該檢測結(jié)果的特異性為98.2%；109頭培養(yǎng)陽性牛中有54頭是ELISA檢測陽性，故MPT70的ELISA的敏感性為49.5%。但是該次所有使用的血清的敏感性低，是因為這些牛最近剛接受了結(jié)核菌素試驗。在結(jié)核菌素試驗前采集的血清是可以應(yīng)用的。對32例牛分支桿菌感染牛進行MPT70-ELISA試驗，僅有4例陽性，即結(jié)果是12.5%的低敏感性。這又一次證實了牛分支桿菌感染牛對結(jié)核菌素有較強的免疫記憶反應(yīng)。MPT70-ELISA也在該情況下被用于檢測，從牛分支桿菌感染的牛群中抽出1 362頭，所有血樣都在結(jié)核菌素試驗前采集，這次實驗得出MPT70-ELISA的敏感性是18.1%，特異性為96.4%，這么低的敏感性，可能MPT70-ELISA反應(yīng)的假陽性率與交叉反應(yīng)的水平相關(guān)。?
　　1.1  抗原檢測?  
　　抗體已被用于人的痰液，尿液和腦脊液中的分支桿菌抗原的檢測。但是對獸醫(yī)來說，使用這些樣品是不太適用的。單克隆抗體已經(jīng)被用于牛分支桿菌培養(yǎng)物的陽性鑒定。以每毫升105  cfu的菌體濃度與ELISA相結(jié)合直接檢測牛分支桿菌。惟一從牛分離出的用于體外檢測牛結(jié)核的可實用的診斷樣品就是痰液，此階段的細菌水平最可能在該病發(fā)展到一定階段時才能檢測到。
　　1.2限 分支桿菌的免疫反應(yīng)圖譜?  
　　人的主要分支桿菌病，即麻風(fēng)病和結(jié)核病，通常很容易產(chǎn)生與因分支桿菌的生長所導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)免疫失敗相關(guān)的高水平的循環(huán)抗體。Thorns和Morris在幾種動物身上重復(fù)了牛分支桿菌感染的過程，且包括長期感染的病灶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛和人一樣，大多數(shù)個體能產(chǎn)生有效的T細胞反應(yīng)，在一些動物如鼯和獾，更頻繁的發(fā)生突發(fā)的疾病，因此，發(fā)現(xiàn)在種內(nèi)和種間存在一種相互關(guān)系，即T細胞反應(yīng)性和感染部位間的關(guān)系；另一方面是抗體水平和疾病發(fā)展程度間的關(guān)系。牛結(jié)核病的血清學(xué)研究支持這個說法。細胞學(xué)試驗如結(jié)核菌素、淋巴細胞增生試驗和γ干擾素試驗都比診斷牛結(jié)核病血清學(xué)試驗更簡單。從牛結(jié)核病的各種血清學(xué)的研究中得出的主要結(jié)論與從人結(jié)核病和麻風(fēng)病患者的相似研究中得出的結(jié)論是一致的。動物對分支桿菌感染的較差的反應(yīng)主要受血清學(xué)試驗敏感性的局限，而且分支桿菌抗原間的交叉反應(yīng)性也導(dǎo)致了高水平的假陽性反應(yīng)。因為只有感染個體的一個小片段有被這些單克隆抗體識別的抗原表位，故種屬特異性單克隆抗體已經(jīng)用于競爭ELISA（能產(chǎn)生一種特異抗體的試驗）中。迄今也沒有診斷結(jié)核病的血清學(xué)試驗被醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)實驗室用于常規(guī)方法。