常規(guī)病毒學(xué)實驗技術(shù)

曹志誠

常規(guī)病毒學(xué)實驗技術(shù)

（一）病毒的培養(yǎng)
實驗動物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、倉鼠
主要用于：
① 分離病毒，并借助感染范圍試驗鑒定病毒
② 培養(yǎng)病毒，制造抗原和疫苗
③ 測定各毒株之間的抗原關(guān)系，（用實驗動物作中和試驗和交叉保護實驗）
④ 制備免疫血清和單克隆抗體
⑤ 作病毒感染的實驗研究，包括病毒毒力測定、建立病毒病動物模型等
注意：選擇對目的病毒敏感的實驗動物品種品系，以及適宜的接種途徑和劑量。
雞胚
（一） 條件要求
    SPF雞、孵化溫度38-39℃，濕度40-70%，通風(fēng)。新鮮受精卵：產(chǎn)下后不超過10天并保存10℃左右。
（二） 優(yōu)點
組織分化程度低，可選擇不同的日齡和接種途徑，病毒易于增殖，感染病毒的組織和液體中含有大量病毒，容易采集和處理，而且來源充足，設(shè)備和操作簡便易行。
（三）接種途徑
1． 絨毛尿囊膜接種（10-12日齡雞胚）
    主要用于痘病毒和皰疹病毒的分離和增殖。
1） 方法一（造人工氣室）
① 在胚胎附近近氣室處，選擇血管較少的部位，用電烙器在卵殼上烙一個直徑約3-4mm的烤焦圈。
② 用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵殼，造成卵窗。
③ 在氣室端中央鉆一個小孔。
④ 用針尖挑破卵窗中心的殼膜，切勿損傷其下的絨毛尿囊膜。
⑤ 滴加滴生理鹽水于刺破處，用橡皮乳頭緊貼于氣室中央小孔上吸氣，造成氣室內(nèi)負(fù)壓，使卵窗部位的絨毛尿囊膜下陷而形成人工氣室，此時可見滴于殼膜上的生理鹽水迅速滲入。
⑥ 用1ml注射器滴入2-3滴接種物于絨毛尿囊膜上。
⑦ 用透明膠紙封住卵窗，或用玻璃紙蓋于卵窗中，周圍涂上熔化的石蠟密封，氣室中央的小孔用石蠟密封。
⑧ 雞胚橫臥于卵箱中，不許翻動，保持卵窗向上。
2）方法二
① 在氣室端的卵殼上開約1.5×1.5cm的口。
② 用滅菌眼科鑷子撕去一小片內(nèi)殼膜。
③ 滴入接種物。
④ 用透明膠紙封閉開口。
2． 尿囊腔接種（10-11日齡）
    用于正粘病毒和副粘病毒（NDV）
1） 畫出氣室和胚位
2） 在氣室接近胚位處涂沫碘酊和酒精消毒
3） 用鋼錐穿一小孔
4） 將注射器針頭沿此小孔插入0.5-1cm，注入接種物
5） 用石蠟封口，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次
3． 卵黃囊接種（6-8日齡）
    主要用蟲媒病毒以及鸚鵡熱衣原體和立克次氏體等的分離和增殖。
1） 畫出氣室和胚位
2） 垂直放置在卵座上，用碘酊和酒精消毒氣室外端
3） 以鋼錐在氣室中央錐一小孔
4） 將注射器針頭沿此小孔插入3cm，注入接種物
5） 用石蠟封口，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次
4．其它接種途徑
    羊膜腔接種，正粘病毒和副粘病毒
    靜脈接種，藍舌病毒
    腦內(nèi)接種，狂犬病毒
組織培養(yǎng)
原代細(xì)胞：應(yīng)用胰酶等分散劑將動物組織消化成單個細(xì)胞懸液，適當(dāng)洗滌以后，加入營養(yǎng)液，通常即可使其貼附于玻璃壁上，并生長增殖。
繼代細(xì)胞：將原代細(xì)胞從玻璃瓶壁上消化下來再作培養(yǎng)。
傳代細(xì)胞：由于遺傳突變或者在理化學(xué)物質(zhì)和致瘤病毒的作用下，組織培養(yǎng)細(xì)胞中有時出現(xiàn)惡性變細(xì)胞，也就是癌變細(xì)胞，這種病變細(xì)胞具有很高的增殖勢能，而且?guī)缀蹩梢詿o限地傳代。
原代細(xì)胞培養(yǎng)（以雞胚成纖維細(xì)胞為例）
1） 在無菌條件下采取9-10日齡雞胚，置滅菌平皿中，除去頭（或僅除去喙和眼）、爪和內(nèi)臟，并剪成塊。
2） 用Hanks液，充分沖洗后移入大號青霉素瓶或其它廣口瓶中，用眼科剪剪成1mm3大小的碎塊。
3） 加入Hanks液，充分沖洗，并靜置幾分鐘，待組織塊下沉，吸棄上層液體，再加洗液。如此反復(fù)沖洗2-3遍。
4） 于沉淀組織塊內(nèi)加入約4倍量的0.25%胰酶，并調(diào)整pH至7.6-7.8，振蕩混勻后置37℃水浴中感作30分鐘，每10分鐘輕輕搖動一次。
5） 取出，小心吸棄上層胰酶溶液，用洗液輕洗2次后，用大口徑吸管反復(fù)吹打，使細(xì)胞游離。
6） 用雙層或三層紗布過濾，收集濾液于離心管中，以600rpm離心沉淀5-10min，吸棄上清液，按每個雞胚5ml的量，加入營養(yǎng)液，并用吸管反復(fù)吹打，直至形成均勻的細(xì)胞懸液。
7） 細(xì)胞計數(shù)（培養(yǎng)時，使細(xì)胞達到5×105個/ml）
取細(xì)胞懸液0.5ml+2ml 0.1%結(jié)晶紫——構(gòu)椽酸（0.1mol/L）溶液，室溫或37℃溫箱中5-10分鐘，充分振蕩后進行計數(shù)。
按白細(xì)胞計數(shù)法計算4角4個大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)（N）。每ml懸液中的細(xì)胞數(shù)（n）=N/4×10000×K（稀釋倍數(shù)）。
傳代細(xì)胞系培養(yǎng)
優(yōu)點：1)可以無限的傳代。
      2)不少細(xì)胞系對病毒很敏感。
  3)某些傳代細(xì)胞系能在懸浮培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，適合病毒抗原的大量生產(chǎn)。
  4)生長旺盛，繁殖快速，對營養(yǎng)條件不苛刻。
缺點：在傳代過程中遭到支原體和病毒的污染。
細(xì)胞分散劑
1． 胰酶  使精氨酸或賴氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之間的多肽鏈發(fā)生水解，導(dǎo)致細(xì)胞間質(zhì)水解而使細(xì)胞或組織塊消化為分散的單個細(xì)胞。
2． 乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）
營養(yǎng)液
1． 人工綜合營養(yǎng)液
氨基酸、糖類、無機鹽類、維生素、輔酶、嘌呤、嘧啶、輔助生長因子。
2． 血清
1） 動物血清中含有細(xì)胞生長所必須的各種營養(yǎng)因子。
2） 促進細(xì)胞的貼壁和生長。
3） 具有很強的酸堿緩沖作用。

（二）病毒感染力的滴定

LD50，EID50，TCID50
（TCID50的測定）
1． 在青霉素瓶中將病毒作連續(xù)10倍的稀釋，從10-1— 10-10。
2． 將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度作8孔，每孔接種100ul。
3．然后在每孔加入細(xì)胞懸液100ul，使細(xì)胞量達到3×105個/ml。
4．設(shè)正常細(xì)胞對照，正常細(xì)胞對照作兩縱排。
5．逐日觀察并紀(jì)錄結(jié)果，一般需要觀察5-7天。
6．結(jié)果的計算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法進行。
TCID50的計算方法：
1． Reed-Muench法

病毒液 稀釋度	出現(xiàn) CPE孔	不出現(xiàn)CPE孔	累計 出現(xiàn)CPE孔   不出現(xiàn)CPE孔		出CPE的孔  所占的%
10-1	8	0	27	0	100（27/27）
10-2	8	0	19	0	100（19/19）
10-3	7 3 1	1 5 7	11	1	91.6(11/12)
10-4			4	6	40（4/10）
10-5			1	13	0.7（1/13）
10-6	0	8	0	21	0（0/21）

               高于50%的百分?jǐn)?shù)-50%               91.6-50
距離比例=                                     =             =0.8
           高于50%的百分?jǐn)?shù)-低于50%的百分?jǐn)?shù)       91.6-40
lgTCID50=距離此例X稀釋度對數(shù)之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對數(shù)
       =0.8×(-1)+(-3)=-3.8
TCID50=10-3.8
2. Karber法
病毒液稀釋度     出現(xiàn)CPE孔的比率
10-1
8/8=1
10-2
8/8=1
10-3               

7/8=0.875
10-4              

3/8=0.375
10-5              

1/8=0.125
10-6            

0/8=0
lgTCID50=L-d(s-0.5)
L: 最高稀釋度的對數(shù)
D：稀釋度對數(shù)之間的差
S：陽性孔比率總和
lgTCID50=-1-（-1）×(3.375-0.5)
        =-3.875
TCID50=10-3.875/0.1ml

（三）病毒中和試驗

一、原理
抗體與相應(yīng)的病毒粒子特異性地結(jié)合，使后者喪失感染能力。
二、用途
1. 疾病診斷。
2. 病毒分離株的鑒定。
3. 不同病毒株的抗原關(guān)系研究。
4. 疫苗免疫原性的評價。
5. 免疫血清的質(zhì)量評價。
6. 測定實驗動物血清中是否存在抗體等。
三、分類
（一）終點法中和試驗
1. 固定病毒——稀釋血清法。
1)

將測好TCID50的病毒稀釋成200個TCID50的病毒懸液。
2)  在96孔微量培養(yǎng)板中將血清作連續(xù)倍比稀釋（具體方法是在96孔板中先加入50ul生長液，再加50ul待檢血清，混勻后，吸50ul至下一孔，如此下去。一直到1:256），每個稀釋度作4孔。
3)
在上述各孔內(nèi)加入50ul稀釋好的病毒液，混勻后放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中作用45min-60min。
4)
同時設(shè)待檢血清毒性對照，陰、陽性血清對照，病毒對照和正常細(xì)胞對照。
5)  感作完成后每孔加入100ul細(xì)胞懸液，放37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察并記錄結(jié)果。

6)  結(jié)果計算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法進行。

Reed-Muench計算方法：

血清稀釋度	CPE孔數(shù)	無CPE孔數(shù)	累      計          CPE孔數(shù)     無CPE孔數(shù)    保護率（%）
1:4（10-0.6）	0	4	0	9	100
1:16（10-1.2）	1	3	1	5	83
1:64（10-1.8）	2	2	3	2	40
1:256（10-2.4）	4	0	7	0	0
1:1024（10-3.0）	4	0	11	0	0

                        高于50%的保護率-50%   
距離比例=  
                 高于50%的保護率—低于50%的保護率


        83-50


=              = 0.7
             83-40
高于50%的保護率血清稀釋度的對數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對數(shù)
=-1.2+0.77×(-0.6)
=-1.66


-1.66的反對數(shù)=1/46
即：1:46稀釋的待檢血清可保護50%的組織培養(yǎng)細(xì)胞免于出現(xiàn)CPE。
2. 固定血清——稀釋病毒法。
1) 將病毒作連續(xù)10倍稀釋
1） 將稀釋好的病毒接種96孔板，每個稀釋度接種一縱排共8孔，每孔50μl，做兩塊板子，在一塊板子的每孔加入50μl待檢血清（試驗組），另一塊板子的每孔加入50μl正常血清（對照組），混合后置37℃  5%CO2培養(yǎng)箱作用1h。
2） 然后在每孔中加入100μl細(xì)胞。
3） 另外還設(shè)兩縱排正常細(xì)胞對照。
4） 置37℃  5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察并記錄結(jié)果。
5） 分別計算每組病毒的TCID50，然后計算血清的中和指數(shù)。

試驗組TCID50
中和指數(shù)=
           對照組TCID50
(二) 蝕斑（痘斑）減數(shù)試驗
1、蝕斑技術(shù)
病毒蝕斑：又稱空斑，指病毒在已長成的單層細(xì)胞上形成的局限性病灶。
原理：將病毒懸液作連續(xù)的10倍稀釋，隨后各取定量，接種于已經(jīng)長成單層的敏感細(xì)胞上，并覆蓋中性紅瓊脂糖，待其出現(xiàn)蝕斑后計數(shù)，即可算出每毫升病毒懸液中所含的蝕斑單位。
用途：①用于病毒純化；②測定病毒懸液中感染病毒的含量。
2、蝕斑減數(shù)試驗

將病毒——正常血清混合物以及病毒——待檢血清混合物分別接種到單層細(xì)胞上，隨后覆蓋營養(yǎng)瓊脂或甲基纖維素，進行蝕斑測定，比較病毒——正常血清組和病毒——待檢血清組產(chǎn)生的蝕斑數(shù)，兩者的差數(shù)表示待檢血清的中和能力。以試驗組的蝕斑數(shù)比對照組減少50%作為判定依據(jù)，血清稀釋度就是其蝕斑減數(shù)試驗效價。
(三) 交叉保護試驗


先將實驗動物進行主動免疫或被動免疫，然后以待檢病毒進行攻擊，根據(jù)實驗動物被保護的情況，判定待檢V的種類或型別。其缺點是試驗周期太長，并且需要大量的實驗動物。
用途：（1）應(yīng)用已知V鑒定未知V
     （2）應(yīng)用已知免疫血清鑒定未知V
   （3）應(yīng)用已知V鑒定未知血清

（四）病毒的分離和鑒定
病毒材料的注備
1． 腦、肝、肌肉等器官或組織
    充分研磨后加入5倍量的Hank’s液（內(nèi)含P.S各200V/ml）反復(fù)凍融三次。2000rpm
10min，取上清作接種物。
2． 鼻液、乳汁、膿汁等分泌物或滲出物
    用內(nèi)含青、鏈霉素100u/ml的Hank’s液，將其稀釋3-5倍，充分混勻懸浮后，置4℃冰箱內(nèi)感作2-4h或過夜，200rpm 10min取上清作接種物。
3． 咽喉拭子或鼻拭子
    仔細(xì)用棉拭子擦拭咽喉部，并迅速將其泡入盛有2-5ml Hank’s液的（200-500u/ml P.S）試管內(nèi)，充分涮洗棉拭子，反復(fù)凍融3-5次，收集液體部分，2000rpm 10min，收集上清作接種物。
4． 糞便
    用含100u/ml P.S的Hank’s液作10-20倍稀釋，4℃感作4h，2000rpm 10min取上清作接種物。
5． 無菌的體液或雞胚液
    直接接種用。
  接種方法
1． 實驗動物
2． 雞胚
目前常用雞胚分離的病毒有正粘V、副粘V、痘V、腦炎V及引起禽類疫病的其它許多V。
3． 組織培養(yǎng)細(xì)胞。
  病毒增殖的判定
1． 細(xì)胞病變（CPE）
2． 抗原的測定
3． 中和試驗
4． 病毒間的干擾現(xiàn)象
乙型腦炎V        脊髓灰質(zhì)炎V
流感V        西方馬腦炎V
豬傳染胃腸炎         牛病毒性膜炎      粘膜病V
5． 電子顯微鏡觀察
6． 實驗動物或雞胚接種
病毒感染力的滴定
     LD50、EID50、TCID50
  病毒理化學(xué)特性的測定
1． 病毒核酸型鑒定（藥物抑制試驗）
FUDR、IVDR、BRUDR
原理：FUDR、ICDR、BRUDR是嘧啶的鹵化物，進入cell后發(fā)生磷酸化，摻入新合成的DNA以代替胸腺嘧啶產(chǎn)生至功能分子，從而抑制DNA的合成。常用濃度為50ug/ml。
2．脂溶劑敏感性試驗
1） 乙醚敏感試驗
取同批病毒分裝于兩個青霉素瓶中，每瓶16ml，在其中1瓶加入麻醉用乙醚，使終濃度為20%，兩瓶均用橡皮塞塞緊后，置4℃凍箱內(nèi)作用24h，其間不時振蕩，隨后以2000rpm離心20min。已加乙醚的小瓶，用毛細(xì)吸管吸取病毒液，移入另一小瓶內(nèi)，適當(dāng)吹打，使殘余乙醚揮發(fā)殆盡，然后滴定兩組病毒的TCID50。
2） 氯仿敏感性試驗
向病毒液內(nèi)加入分析純氯仿，使其終濃度為4.8%，置4℃振蕩混合10min。隨后500rpm 5min，然后吸取上層液體，滴定病毒TCID50。對照組病毒加入終濃度為4.8%的生理鹽水，同樣處理和滴定。
3．胰蛋白酶敏感試驗
脊髓灰質(zhì)炎V、豬傳染性胃腸炎V對胰酶有較強的抵抗力，痘V、呼腸孤V、皰疹V易被胰酶滅活。取病毒液兩瓶，每瓶1ml,在其中1瓶加入1ml 1%的trypsin，使終濃度為0.5%，另一瓶加入1ml 1640（培養(yǎng)基），用橡皮塞塞緊瓶口，將小瓶倒轉(zhuǎn)幾次，使其充分混合，置37℃1h，隨即加入滅活犢牛血清8ml，充分混合，終止胰酶的作用。最后滴定兩瓶V的TCID50。
4． 耐酸性試驗
    pH3.0 2h or pH5.0 1h
    取等量病毒液兩瓶，用0.1mol/L HCL將1個小瓶中的病毒液的pH調(diào)至3.0(or 5.0)，并在另一個小瓶內(nèi)加入相同于用酸量的培養(yǎng)基作為對照，置37℃水溶或室溫中感作2h(or 1h)，再用5.6%NaHCO3溶液將pH調(diào)回至7.2左右，對照組再加緊入相同于NaHCO3量的培養(yǎng)基，測定兩者的TCID50。
5． 耐熱性試驗
將病毒液分成等量的11小瓶，其中4小瓶分別置50℃、60℃、70℃、80℃水溶中1h，另6瓶置50℃水浴中分別感作5、10、15、30、60和180min，隨后測定每瓶V的感染X。
6． 病毒粒子大小測定
1)電子顯微鏡直接觀察（透射電鏡、磷鎢酸負(fù)染）
2)超速離心沉淀
3)濾過試驗
取澄清的病毒液20ml，留出1ml作為對照，將剩余的19ml病毒液在正壓下依次通過孔經(jīng)為450nm、225nm、100nm和50nm的各級微孔，每通過一種孔徑的濾膜就吸取1ml濾液用為樣品，并將剩余的濾液通過一次濾膜。最后測定原病毒液以及各級濾液的TCID50。
   病毒液種類      TCID50/0.1ml
   濾前病毒液     
10-6.75
450nm孔徑液
10-6.23

225nm孔徑液
10-5.78

100nm孔徑液
10-4.50

50nm孔徑液
10-0.50
免疫——血清學(xué)檢查
目的：①新分離毒株的種類及型別的鑒定。
      ②檢測發(fā)病動物體液中的Ab，或進一步比較動物急性發(fā)病期和恢復(fù)期血清中的Ab效價，了解病毒性Ab是否有明顯的增長，從而判定V感染的存在。
（一） 中和試驗
1． 終點法中和試驗
固定病毒——稀釋血清法中和試驗
固定血清——稀釋病毒法中和試驗
2． 蝕斑（痘斑）減數(shù)試驗
1） 蝕斑技術(shù)
病毒蝕斑，又稱空斑，指病毒在已長成的單層細(xì)胞上形成的局限性病灶。
原理：將病毒懸液作連續(xù)的10倍稀釋，隨后各取定量，接種于已經(jīng)長成單層的敏感細(xì)胞上，并覆蓋中性紅瓊脂糖，待其出現(xiàn)蝕斑后計數(shù)，即可算出病毒懸液中每毫升所含的蝕斑單位。
用途：①用于病毒純化；②測定病毒懸液中感染病毒的含量。
2） 蝕斑減數(shù)試驗
將病毒——正常血清混合物以及病毒——待檢血清混合物分別接種到單層細(xì)胞上，隨后覆蓋營養(yǎng)瓊脂或甲基纖維素，進行蝕斑測定，比較病毒——正常血清組和病毒——待檢血清組產(chǎn)生的蝕斑數(shù)，兩者的差數(shù)表示待檢血清的中和能力。以試驗組的蝕斑數(shù)比對照組減少50%作為判定依據(jù)，血清稀釋度就是其蝕斑減數(shù)試驗效價。
3． 交叉保護試驗
    先將實驗動物進行主動免疫或被動免疫，然后以待檢病毒進行攻擊，根據(jù)實驗動物被保護的情況，判定待檢V的種類或型別。其缺點是試驗周期太長，并且需要大量的實驗動物。
用途：（1）應(yīng)用已知V鑒定未知V；
     （2）應(yīng)用已知免疫血清鑒定未知V；
     （3）應(yīng)用已知V鑒定未知血清。

（五） 凝集試驗

定義：
    顆粒性抗原（如細(xì)菌、紅細(xì)胞等）或表面載有抗原的顆粒狀的物質(zhì)（如聚苯乙烯膠乳、紅細(xì)胞、炭素顆粒等），與相應(yīng)抗體在電解質(zhì)存在下凝集成團的試驗。
分類
    直接凝集試驗：顆粒狀A(yù)g與相應(yīng)Ab所發(fā)生的凝集反應(yīng)。（布氏桿菌）
    間接凝集試驗（被動凝集試驗）：可溶性抗原吸附到載體顆粒表面，與相應(yīng)抗體所發(fā)生的凝集反應(yīng)，可以證明相應(yīng)抗體的存在并測定效價。反相問接凝集試驗（反向被動凝集試驗）：將抗體吸附到顆粒表面與相應(yīng)抗原所發(fā)生的凝集反應(yīng)。
     間接血凝試驗
     膠乳凝集試驗
     炭凝集試驗            間接凝集試驗
     皂土凝集試驗
     脂質(zhì)體凝集試驗
     間接凝集抑制試驗：先將被檢的抗體（或抗原）與已知的抗原（或抗體）作用后，再與抗體（或抗原）致敏的顆粒時行反應(yīng)。
     反向凝集抑制試驗
        間接凝集試驗的優(yōu)點：快速、簡便、特異、敏感
間接血凝試驗（IHA）（PHA）
    口蹄疫、豬瘟、弓形體、胸膜肺炎、衣原體
    反向IHA：FMDV、水皰病病毒Ag、豬傳染笥胃腸炎病毒Ag、小鵝瘟病毒Ag等。
紅細(xì)胞作為載體的優(yōu)點：
1． 來源廣泛，容易取得。
2．紅細(xì)胞表面幾乎可以吸附任何一類的Ag或Ab，如蛋白質(zhì)、糖蛋白、核蛋白以及多糖等。
3．具有天然的均一性，比其它許多載體都更容易標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)格化。
缺點：容易破裂、難于保存
IHA的優(yōu)點：
①敏感性高、特異性強、重復(fù)性和穩(wěn)定性好，操作簡便、反應(yīng)迅速。
②既可定性又可半定量，而且試劑價格低廉，不需要特殊、復(fù)雜的設(shè)備。
注意：影響紅細(xì)胞凝集的因素很多：紅細(xì)胞的來源，致敏條件、操作技術(shù)、標(biāo)本中的雜質(zhì)、細(xì)菌污染和類屬Ag常引起非特異性凝集反應(yīng)。
1． 紅細(xì)胞的選擇和保存
選擇：許多種類動物的紅細(xì)胞，包括人的0型紅細(xì)胞都可用，但用得最多的是綿羊紅細(xì)胞。
保存：用玻璃珠脫纖法采集或用肝素抗凝。
②無菌的紅細(xì)胞在4℃冰箱中可保存3-4天。
②采血時加等量氏液和適量抗生素，4℃保存2周，但這樣紅細(xì)胞致敏時容液自凝。
2． 紅細(xì)胞的醛化
醛化劑：甲醛、戊二醛、丙酮醛、丙酮醛—甲醛雙固定、戊二醛—丙酮醛雙固定。
1） 無菌采取綿羊靜脈血，加至紅細(xì)胞保存液內(nèi)，4℃保存?zhèn)溆谩?/font>
2） 取紅細(xì)胞懸液1份，加入10倍量0.1mol/L、PH7.2磷酸緩沖液（PH7.2PB），洗5遍，并以該液配成8%紅細(xì)膩懸液。
3） 紅細(xì)胞懸液1份+3%丙酮醛液等量，24左右的室溫中用電磁攪拌器緩慢攪拌17h。PH7.2PB配成8%懸液，——丙酮醛固定紅細(xì)胞懸液。
4） 丙酮醛固定紅細(xì)胞懸液1份+等量3%甲醛液，如上攪拌17hr。
5） 再以PH7.2PB液洗5遍，最后用內(nèi)含0.1%疊氮鈉的ph7.2PB配成20%的紅細(xì)胞懸液，分裝后置4℃冰箱內(nèi)保存，可用2個月—雙醛化紅細(xì)胞懸液。
3．紅細(xì)胞的鞣化
作用： 可增加紅細(xì)胞吸附蛋白質(zhì)的能力，新鮮紅細(xì)胞用1：200000濃度的鞣酸，醛化紅細(xì)胞用1：100000濃度的鞣酸。
程序： 取紅細(xì)胞，用PH7.2PB洗4—5遍，并用同液配成2.5%懸液，同時以PH7.2PB臨時配制1：200000優(yōu)質(zhì)鞣酸，將其與紅細(xì)胞懸液等量混合，37℃水浴咸作15min。取出后用ph7.2PB洗一次，再用PH7.2pB配成20%紅細(xì)胞懸液。
4．致敏紅細(xì)胞的制備：
1） 抗體致敏紅細(xì)胞
取20%鞣化或未鞣化的雙醛化紅細(xì)胞懸液1ml，離心沉淀，棄去上清液，將沉淀紅細(xì)胞重新懸浮于0.1mol/L.PH3.5~4.0醋酸緩沖液10ml中，加入等量的提純IgG液（每毫升需含IgG100~300g）置37℃水浴中咸作2-4h，每15-20分釧用吸管輕輕吹吸混合2-3次。以ph7.2PB洗5遍，再將沉淀紅細(xì)胞用1%滅活免血清鹽水配成0.8%懸液備用。—— Ab致敏紅細(xì)胞懸液。
2） 抗原致敏紅細(xì)胞
  取PBS（PH6.4）4ml病毒抗原1ml，2.5%鞣酸化紅細(xì)胞懸液1ml，混勻后，置室溫下振蕩結(jié)合30—60min（隨病毒Ag種類不同）或37℃水浴30-45min，其間適當(dāng)振搖。隨后以1500rpm離心沉淀10min，并用2倍量的PH7.2PB(內(nèi)含1%滅活兔血清)洗2遍后，配成1%的致敏紅細(xì)胞懸液供試驗用。以病毒致敏的紅細(xì)胞懸液應(yīng)立即使用。4℃冰箱保存，不宜超過2天。
※致敏紅細(xì)胞的保存：用1%兔血清鹽水或0.4%明膠緩沖液洗滌，并用其配成2.5%懸液保存?zhèn)溆谩ｉL期保存：用含1%糖和4%兔血清的生理鹽水，將致敏紅細(xì)胞配成10%懸液，然后于真空中冷凍干燥。
乳膠凝集試驗
乳膠的預(yù)處理
取空白乳膠用PBS（PH7.4）配成2%溶液，加入10%的胰蛋白酶液，使其終濃度為1%，于56℃水溶作用18-24h，其間搖動幾次，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩谷槟z穩(wěn)定并減少非特異性凝集。（離心上清，將沉淀用PBS懸浮配成2%乳膠溶液）
乳膠的致敏
1． 將濃縮的病毒抗原作倍比稀釋（PBS），加入等量的2%空白乳膠中（逐滴加入，邊加邊搖動）。37℃作用15-30min。
2． 加入10%牛血清白蛋白，使終濃度為1%，混合均勻，37℃ 15-30nin，或2h，即得乳膠抗原。

（六）標(biāo)記抗體技術(shù)（免疫標(biāo)記技術(shù)）

原理： 抗體能追蹤抗原，在抗原所在部位與之結(jié)合，一旦結(jié)合后就不易洗脫。但此種結(jié)合反應(yīng)肉眼不易察出。有一些物質(zhì)在超微量時，即能用某種特殊理化因素將其檢測出來。如將這些構(gòu)標(biāo)記在抗原或抗體分子上，就能利用調(diào)換體與原特異結(jié)合的特性，檢測抗原或抗體，即免疫標(biāo)記技術(shù)。
        熒光抗體技術(shù)（免疫熒光技術(shù)）
分類：  酶標(biāo)記抗體技術(shù)（免疫酶技術(shù)）
        同位素標(biāo)記抗體技術(shù)（放射免疫測定技術(shù)）
        鐵蛋白標(biāo)記抗體技術(shù)
免疫熒光技術(shù)
基本方法和原理
1． 直接法
    將標(biāo)記的特異熒光抗體，直接加在Ag標(biāo)本上，經(jīng)一定溫度和時間的染色，用水洗去來參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫干燥后封片，鏡檢。優(yōu)點：方法簡便，非特異熒光染色因素少。缺點：不夠敏感，且一種標(biāo)記抗體只能檢測一種Ag。
2． 間接法
  既可檢查抗體，也可檢查抗原。
1） 檢查抗原
  用已知未標(biāo)記的特異抗體（一抗）與抗原標(biāo)本進行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗體（二抗）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗原一抗體——抗抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗抗體，干燥封片后鏡檢。
2） 檢查Ab

Ab標(biāo)本為已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟同上。缺點：但特異性較差。可能是間接法的中間層可結(jié)合更多的標(biāo)記抗體所致。優(yōu)點：敏感性高，且標(biāo)記一種抗體球蛋白抗體，可用于多種抗原，抗體系統(tǒng)的檢查。既可檢測Ag，也可檢測Ab。
3． 補體法
應(yīng)用補體結(jié)合反應(yīng)的原理，用熒光素標(biāo)記抗補體抗體，鑒定未知Ag或未知Ab。先將未標(biāo)記的Ab和補體加在Ag標(biāo)本上，使其發(fā)生反應(yīng)，隨后再加標(biāo)記抗體抗體，使之形成Ag— Ab—cb抗補體復(fù)合物。缺點：特異性較差。優(yōu)點：敏感性高。標(biāo)記一種抗體補體Ab，可用于各種Ag—Ab系統(tǒng)的檢查（可用于各種動物）
間接法：雙層法、混合法、三層法。補體法：抗體一抗補體法、異屬補體結(jié)合法。涂片壓印片、冰凍切片、石蠟切片、組織培養(yǎng)物、可溶性Ag標(biāo)本（醋酸評維素膜）。
放射免疫測定技術(shù)
原理： 用放射性同位素標(biāo)記已知的Ab或Ag，用以檢測被檢材料中Ag 或Ab。隨后根據(jù)Ag—Ab復(fù)合物中的同位素放射性強度進行定性或定量的測定。優(yōu)點：敏感性和特異性都很強。缺點：射線污染。
分類和操作原理：
（一） 液相放射免疫測定
1． 直接法（Ag、Ab）
  用放射性同位素標(biāo)記病毒Ag或Ab。檢測相應(yīng)的Ab 或Ag。主要同于顆粒性物質(zhì)，如懸浮細(xì)胞內(nèi)病毒抗原的初步檢測，檢測Ag時，通過超速離心將Ag—Ab復(fù)合物沉淀下來，分別檢測沉淀物和上清液中的放射性強度，檢測Ab時，在Ab、Ag感作以后，再加入適當(dāng)濃度（40-50%飽和度）的硫酸銨，叫Ag—Ab復(fù)合物鹽析沉淀，而Ag仍處于溶解狀態(tài)。
2． 間接法（主要用于病毒抗體的檢測）
  被檢血清+ Ag+二抗離心沉淀
3． 競爭法（主要用于病毒抗原的檢測）
  被檢抗原+標(biāo)定濃度的特異抗體，混合咸作一定時間再加入標(biāo)定量的放射性同位素標(biāo)記抗原—離心沉淀。
（二） 固相放射免疫測定（聚苯乙烯小管或微量滴定板上，或者用溴化氫、二醛等將Ab偶聯(lián)或共價聯(lián)結(jié)于瓊脂糖珠或纖維素等表面）
1． 夾心法
Ab+待檢Ag+標(biāo)記Ab
2． 夾心間接法，與上法相比，敏感性更強。
    Ab包被+待檢Ag+另一動物的抗病毒Ab+同位素標(biāo)記的抗第二次Ab的抗抗體
3． 競爭法
    Ab包被+待檢抗原+標(biāo)記Ag
    兩者同時加入or待檢Ag先加
4． 阻斷試驗法

Ab包被+已知Ag+被檢血清+同位素標(biāo)記的Ab。
（三） 放射免疫自顯影
用同位素標(biāo)記Ab
or Ag，然后進行瓊脂擴散試驗或免疫電泳對流免疫電脈，檢測相應(yīng)的Ag or Ab。擴散或電泳完畢后，將瓊脂板置于鹽水和ddH2O中充分浸泡，除去未結(jié)合的標(biāo)記Ab或Ag。干燥后，覆蓋X光膠片，置暗室中曝光1-2天。經(jīng)過顯影和定影，即可在X光膠片上顯示特異的沉淀線。
免疫酶技術(shù)
免疫酶染色法
抗酶抗體法
放大抗體法：同時使用酶標(biāo)記抗體和抗酶抗體
1． 酶標(biāo)記抗體法
1） 直接法
    用酶標(biāo)記的特異性Ab，直接檢測病毒或病毒Ag。在將含有uirus或virus Ag的組織和細(xì)胞標(biāo)本固定的消除其中的內(nèi)源性酶以后，應(yīng)用酶標(biāo)記Ab直接處理，隨后滴加底物顯色，直接鏡檢。
2） 間接法
    將含有V或V Ag的組織或細(xì)胞標(biāo)本，先用特異性V Ab處理，充分涮洗后，再用酶標(biāo)記的抗體處理，使其形成Ag-Ab-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，最后滴加底物，鏡檢。
2． 抗酶抗體法
不需進行酶的標(biāo)記，比前都簡便和靈敏
1） 免疫球蛋白橋法
搭橋：用二抗（如抗兔IgG的抗體）將抗體和已結(jié)合在病毒抗原上的同種動物（兔）特異性Ab連接起來。
   加酶，形成Ag+Ab+抗抗體+抗酶抗體+酶加底物顯色、鏡檢。
2） 可溶性酶——抗酶復(fù)合物法（PAP）
3） 雜交抗體法
    將來自同種動物的抗IgG抗體（或其Fab碎片）與抗酶抗體（或其Fab碎片）結(jié)合起來，使之成為一種具有抗IgG和抗酶雙重活性的雜交抗體。再用這種雜交抗體進行免疫酶染色。Ag+Ab+雜交Ab+酶
（一） 免疫酶測定法
    固相免疫酶測定法：利用固相載體，以化學(xué)的或物理的方法將Ag或Ab聯(lián)接于其上，制成免疫吸附劑，隨后進行免疫酶測定。
    均相免疫酶測定法：不需將游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物分離，也不需要載體，直接從溶液中測定結(jié)果。
1． 固相免疫酶測定法
根據(jù)固相載體的種類和免疫吸附劑的制備方法。分為兩類：、
1） 酶聯(lián)免疫吸附試驗或測定法（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）。
① 間接法，用Ag包被板子+Ab（未知）+抗Ab+酶底物顯色
② 雙抗體夾心法，用于檢測Ag。Ag+Ag（未知）+抗Ab+酶底物顯色
③ 競爭法：（測定Ag）
利用酶標(biāo)記Ag和未標(biāo)記Ag共同競爭有限量的Ab，測定樣品中的Ag。需同時微只加酶標(biāo)記Ag的系統(tǒng)作對照。Ab+待檢Ag和酶標(biāo)記Ag（與可先加待檢樣品，稍后再加酶標(biāo)記Ag）。對照組：只加酶標(biāo)記Ag。
④ 夾心間接法
  應(yīng)用酶標(biāo)記抗抗體測定Ag。Ab+Ag（待檢）+不同種動物的同的Ab+酶標(biāo)抗第二種抗體的動物球蛋白（二抗）
2） 特定Ag基質(zhì)球法（Defined antigen substrate sphere, DASS）
    應(yīng)用溴化氰活化的瓊脂糖球作為固相載體，將Ag或Ab結(jié)合于其上，制成免疫吸附劑。
2．均相酶免疫試驗（酶放大免疫試驗）
利用競爭原理，將含有小分子半Ag的樣品，酶標(biāo)半Ag及相應(yīng)Ab混合感作，隨后測定酶的活性。如果樣品中主要用于激素、抗菌素和嗎啡微生物等小分子半Ag的檢測，沒有半Ag，則酶標(biāo)半Ag與Ab結(jié)合，酶的活性受到抑制。
ELISA的操作要領(lǐng)：
1． 固相載體的選擇
聚苯乙烯微量反應(yīng)板
   PVC塑料軟板
   硝酸纖維素膜，斑點——ELISA（Dot—ELISA）
   疏水聚酯布，布——ELISA（C-ELISA）
2． 預(yù)備試驗
     確定酶結(jié)合物、包被抗原或抗體的最適濃度，底物的最適反應(yīng)時間。
1） 酶結(jié)合物的確定
  用PH9.6的碳的酸鹽緩沖液將IgG稀釋至100ug/ml,加入固相載體的每一孔中進行包被,洗滌后將酶結(jié)合物以1:200,1:400,1:800……作系列稀釋,依次加入各孔,每一稀釋度加2孔。反應(yīng)完畢后加底物顯色，以能產(chǎn)生光吸收值（A）為1.0的稀釋度為結(jié)合物的最適濃度。
2） 包被蛋白質(zhì)濃度的確定
  將欲包被的蛋白質(zhì)用PH9.6的碳酸鹽緩沖液作1：10，1：20，1：40…….系列稀釋，每一稀釋度包被2個孔，然后進行常規(guī)的ELISA操作。以能產(chǎn)生光吸收值（A）為1.0的稀釋度為包被蛋白質(zhì)的最適濃度。
3） 底物最適作用時間的測定
  以最適稀釋度Ag和酶結(jié)合物進行試驗，加入底物后在不同時向終止反應(yīng)，即可確定最適反應(yīng)時間。
3． 包被
1） 載體
2） 包被液的PH：通常用PH9.5~9.6,0.05mol.L or 0.1mol/L的碳酸鹽緩沖液稀釋Ag
or Ab。吸咐時的PH一般為9.0左右。如PH較低，則吸附時間延長，但PH低于6.0則非特異性吸附增加。
3） 吸附時間與溫度，一般為4℃過夜，有時也可采用37℃吸附1-5h。
4） 蛋白質(zhì)濃度，在固相載體上，每孔加入量一般為0.1-100us/ml。濃度太高，令固Ag或Ab蛋白分子之間的相互作用較大而影響載體對蛋白質(zhì)的吸附，濃度太低，則感染性下降。
4． 洗滌，將載體各也甩干，再加洗滌充滿各孔，靜置3-7min如此重復(fù)3次。
    常用的洗滌液： 含有0.05%吐溫-20，0.01mol/L
PH7.4的PBS或含有0.05%吐溫-20，0.01mol/L
PH7.4的Tris-cl。
5． 封閉
抗原或抗體包被后，載體表面仍可能遺留有未吸附蛋白質(zhì)的空白位點，從而造成下一步的非特異性吸附。
封閉液： 1%-3%牛血清白蛋白，3%-5%脫脂乳，10%牛或馬血清加入封閉液后，37℃吸附 2h，然后洗滌。
6． 結(jié)果判定
1） 目視比色法：定性
2） 光電比色法：P/N比法，P/N值≥2.0為陽性

（七）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）與疾病診斷

聚合酶鏈反應(yīng)（ polymerase chain reaction,
PCR）是1985年Mallis等根據(jù)核酸自然擴增的原理，建立的一種人工體外擴增DNA技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)研究及病毒病的診斷。
基本原理
PCR又稱為體外酶促基因擴增，即在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸（dNTP）存在的條件下依賴于DNA聚合酶的體外擴增反應(yīng)，其原理類似于天然DNA的復(fù)制。雙鏈靶DNA分子變性后解鏈，兩條單鏈DNA分別經(jīng)復(fù)性與兩條引物互補結(jié)合，在4種dNTP存在和合適的條件下，由DNA聚合酶催化引物由5’――3’ 擴增延長，每經(jīng)過變性、復(fù)性、延伸一個循環(huán)，模板DNA增加1倍，新合成的DNA鏈又可作為下一循環(huán)的模板，經(jīng)過30-50個循環(huán)，可使原DNA量增加106-109倍。由于引物的序列決定了擴增的范圍，而數(shù)十個循環(huán)，又使原DNA模板大量增加，因此，PCR具有特異、敏感等許多優(yōu)點，適用于病毒性疾病的診斷。
主要步驟
PCR的每一個循環(huán)包括變性、復(fù)性、延伸3個步驟。
1）變性   通過加熱（90-95℃），使雙鏈DNA模板的氫鍵斷裂，雙鏈解離成單鏈。
2）復(fù)性   適當(dāng)降溫（42-62℃），使引物與其互補的模板在局部形成雜交DNA雙鏈。
3）延伸   72℃，在DNA聚合酶、4種脫氧核糖核苷酸底物及Mg+離子存在的條件下，引物延長，新鏈合成。
幾種模板的處理方法
1.  細(xì)菌

挑細(xì)菌于離心管中，加適量ddH2O，渦懸，于沸水浴中變性10min，迅速置冰浴中，然后3000rpm離心數(shù)秒，取上清作為模板。
2.  細(xì)胞培養(yǎng)物
收集病變的細(xì)胞（不要凍融）懸液，10000rpm離心數(shù)秒，取細(xì)胞沉淀用適量Sample Buffer懸浮，加入蛋白酶K至終濃度為100μg/ml，于37℃溫箱中作用1h，取出于沸水浴中變性10min,立即置冰浴中，3000rpm離心數(shù)秒,取上清作為模板。
Sample  Buffer

終濃度
KCl                   50mM
Tris-HCl(pH9.0)       10mM
MgCl2                 1.5mM
明膠                  0.01%
Triton X-100          0.1%
NP-40                 0.45%
Tween 20              0.45%
3. 質(zhì)粒、病毒基因組DNA
沸水浴中變性10min，迅速置冰浴上備用。
4. 病料與鼻拭子
1) 用勻漿器將病料組織充分勻漿，用TEN緩沖液按1:5進行稀釋。
2) 收集懸液于離心管內(nèi)，-20℃反復(fù)凍融三次。
3) 取出，5000rpm離心5min。
4) 取472.5μl上清液于另一離心管中，加入25μl
10%的SDS(終濃度為0.5%)

和2.5μl
20mg/ml的蛋白酶K(終濃度為100μg/ml)，混勻。
5) 50℃水浴過夜
6) 用等體積(500μl)的苯酚:異戊醇、苯酚:氯仿:異戊醇、氯仿:異戊醇各抽提一次
7) 吸取上清，加2倍體積的無水乙醇、0.1倍體積的3M NaAc于－20℃沉淀30min，

10000rpm離心10min。
8) 沉淀用70%乙醇洗一次，真空抽干，用20μl
ddH2O溶解，－20℃保存?zhèn)溆谩?/font>

新鄉(xiāng)某豬場李平

@@007: @@007: @@007:

聽說這也做這些東西>>>安普美豬病防控中心（李文剛博士豬病化驗室）成立于2000年，由傳染病預(yù)防獸醫(yī)學(xué)博士、留日博士后、河南農(nóng)大研究生導(dǎo)師、鄭州牧專李文剛博士所創(chuàng)辦，是專門從事豬病診斷、化驗和豬場疫病綜合防控技術(shù)推廣和培訓(xùn)的專業(yè)研究中心。
安目前安普美的科研實力與綜合優(yōu)勢較強勁，擁有最先進的實驗儀器設(shè)備和權(quán)威的豬場疫病檢測專家團；全面的豬場疫病的動態(tài)網(wǎng)絡(luò)預(yù)警與監(jiān)測；并有最新的市場疫情預(yù)測信息與發(fā)布及預(yù)防控制措施，同時配備多名高級專業(yè)的技術(shù)專家常年坐診和檢測，現(xiàn)配套有血清學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)菌學(xué)全套檢驗儀器設(shè)備，診斷試劑齊全，檢測技術(shù)先進。
安研究中心自創(chuàng)建伊始就堅持多元化合作與研發(fā)方針，先后與中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國中醫(yī)藥大學(xué)、沈陽藥科大學(xué)、河南科技學(xué)院，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)合作建立規(guī)模化豬場臨床科研項目，研究中心以“以信譽為根本，以創(chuàng)新求發(fā)展；以客戶為中心；以服務(wù)拓市場”為宗旨，以“引領(lǐng)科技、造福于民”為理念，致力打造一流的規(guī)模化豬場疫病防控體系，為中國畜牧業(yè)的健康發(fā)展和國家食品安全生產(chǎn)做出應(yīng)有的貢獻。
安目前重點開展豬病臨床診斷、實驗室分析檢測、豬場整套疫病防控技術(shù)推廣和基層人員的培訓(xùn)等工作。

曹志誠

感謝各位的來訪，有機會 到你們那里去看看！！！相互學(xué)習(xí)交流一下！