常規實驗項目操作規程

曹志誠

常規實驗項目操作規程

一、細菌的分離培養和鑒定

（一）細菌的分離接種

1、平板劃線分離法：

以滅菌接種環取待檢材料少許，左手打開平皿蓋，使蓋與底成30度角，將材料先涂于培養基平板上的一邊，作為第一段的劃線，然后將接種環置于火焰上滅菌，再以該接種環的第一段劃線處相交接依次劃線數次為第二段劃線，再如上法滅菌，接種劃線，依次劃至最后一段，滅菌接種環。這樣每一段劃線內的細菌逐漸減少，即能獲得單個菌落，劃線時接種環應與培養基面平行，并應盡量將接種環放平，可以減少劃破培養基的現象。劃線間的距離寬窄要適宜，一般以相距0.5厘米左右為宜。最后一段劃線不要與第一段劃線相交。接種材料后肉湯培養基中含菌數量不太多時，可用滅菌接種環取待檢材料，在平板表面的一角涂布后，由左右兩邊向下移動連續平行線，直至劃滿整個平板表面。接種材料后，蓋好平皿蓋倒置于37℃溫箱中培養。

2、斜面分離法；

每份待檢材料用三支斜面培養基，以滅菌接種環沾取少許病料，放在第一管斜面培養基底部的凝結水中，共移三接種環，輕輕混合，依次由第一管向第三管移三接種環混合液，將斜面稍平放，使凝結水由底部向斜面流動，左右傾斜，讓凝結水布滿斜面表面，然后將培養基直立，置于37℃培養，由于病料的遞次稀釋，第二、三斜面上常可出現單個菌落。

3、平板傾注法：

取數管已溶化的深層瓊脂或含有特殊物質的瓊脂，用記號筆標記順序后，置于50℃恒溫水箱中，以滅菌接種環或毛細吸管取材料少許加入第一管中，將試管放于兩手掌中搓轉片刻使材料在培養基中混合均勻，從第一管中取材料1-3接種環，加入第二管中，混勻后，取材料加入第三管中，如此將全部培養基接種完畢。取相同數量的滅菌平皿，標記后，將各管中的材料分別傾于相應的平皿中，并使之均勻分布，待凝固后，將平皿倒置于溫箱中培養，此法不僅用于分離培養，而且可用作材料中活菌的記數。

（二）細菌的純培養

待檢材料中的細菌經上述方法分離培養后，取出加以檢查。先用肉眼觀察長出的菌落是純一的，還是混雜的。多數情況下，沿涂布劃線處長出較多的一種菌落，是材料中的病原菌的可能性較大，少數零散的菌落多為在操作過程中由外界進入的雜菌。為慎重，可挑取一部分菌落，制成革蘭氏染色片，置于鏡下檢查，如片中的細菌的形態和染色性統一，則用滅菌接種環仔細挑取該菌落的剩余部分，接種在適當培養基上，置溫箱中培養，待菌落長出后，再經肉眼及染色片的鏡檢證明統一后，即成為該菌的純培養。

（三）細菌的生化鑒定

細菌在培養基中生長時，由于它的分解代謝和合成代謝作用，可使培養基中的某些物質轉化為其它物質，由于細菌的種類不同，它們的代謝產物也不同。細菌的代謝活動是受細菌本身所具有的酶控制的，細菌的種類不同，它們所具有酶也不同。這些代謝產物和酶，可以利用化學方法檢查出來，這種方法可以叫生化實驗，生化實驗在鑒定細菌種類上有十分重要的作用。

1、大腸桿菌生化特性：葡萄糖○乳糖○甘露醇○阿拉伯糖+吲哚+甲基紅+VP-尿素酶-明膠液化-硫化氫-動力+/-檸檬酸鹽利用-

2、沙門氏菌生化特性：葡萄糖產氣+乳糖-蔗糖-水楊素-側金盞花醇-靛基質-甲基紅+VP-硫化氫+/尿素-明膠-丙二酸鈉-氫化鉀-動力+賴氨酸脫羧酶+苯丙氨酸脫氨酶-檸檬酸鹽+

3、巴氏桿菌生化特性；葡萄糖+果糖+半乳糖+蔗糖+肌醇-菊糖-麥芽糖-水楊素-鼠李糖-吲哚+尿素醇-氧化酶+接觸酶+筋膠液化-硝酸鹽還原+動力-溶血-麥康上生長-

二、藥敏試紙片的制備

（一）配制試劑：

1、PH6.0    磷酸鹽緩沖液

磷酸氫二鉀  0.2克  磷酸二氫鉀   0.8克  蒸餾水 加至100毫升  

15磅高壓20分鐘備用

2、PH3.0  枸櫞酸緩沖液

枸櫞酸   0.7克   磷酸氫二鈉   0.3克   蒸餾水 加至100毫升

15磅高壓20分鐘備用

3、PH7.8～8.0  磷酸鹽緩沖液

磷酸二氫鉀 0.0523克  磷酸氫二鉀1.672克  蒸餾水 加至100毫升

15磅高壓20分鐘備用

4、1N鹽酸

鹽酸     0.9毫升     蒸餾水  加至10毫升搖勻

5、蒸餾水若干滅菌備用。

（二）藥敏片的制備：

1、藥物與溶劑使用量

藥名	藥量(mg)	溶液	溶液量(ml)	代 號	藥名	藥量(mg)	溶 液	溶液量（ml）	代 號
青霉素	10	PH6.0	4	1	痢菌凈	10	水	10	18
新霉素	20	PH6.0	10	2	諾美殺星	20	水	5	15
氨芐青霉素	10	PH6.0	2.5	3	百病消	0.2	水	50	16
慶大霉素	0.5	PH6.0	5	4	先鋒6	20	水	15.5	21
土霉素	20	PH3.0	5	5	阿莫西林	30	水	25	22
鏈霉素	40	PH7.8	13.1	6	力克霉素	40	水	5	23
紅霉素	10	水	4	7	環丙殺星	20	水	10	24
氯霉素	40	水	10	8	強力霉素	30	水	15	30
痢特靈	40	水	10	9	喹乙醇	20	水	10	11
氟派酸	20	水	10	10	恩諾殺星	20	水	50	12

2、制備過程：

（1）新華濾紙打出直徑6mm的紙片，打上代號，裝入青霉素小瓶內，每瓶100片15磅高壓滅菌20分鐘，取出后烘干備用。

（2）按要求配制藥液，然后取藥液1ml加入有紙片的小瓶內，使紙片完全浸透藥液，4℃冰箱放置1～2小時，取出用無菌鑷子將紙片一張張平鋪在無菌平皿內，置37℃溫箱，將平皿蓋開一小縫，以便放出蒸汽，約2～3小時，待干燥后裝入無菌青霉素小瓶內，加塞，放入有干燥劑的容器內，冷暗處保存備用。

3、說明：

（1） 金霉素、土霉素、四環素等通常用PH3.0枸櫞酸緩沖液稀釋。

（2） 青霉素、慶大霉素、卡挪霉素等用PH6.0磷酸緩沖注液稀釋。

（3） 對PH要求不嚴格的藥物，如磺胺類藥物可用蒸餾水稀釋。

（4） 有些不溶于水的藥物，可選擇可溶解它的溶劑先溶解后再稀釋，如四環素用HCL溶解，氯霉素、紅霉素等用95%乙醇溶解。

三、染液的配制

（一）改良的革蘭氏染色法

1、染液的配制

（1）結晶紫染液   結晶紫1克，蒸餾水100毫升。

（2）革蘭氏碘液  碘片10克，碘化鉀20克，蒸餾水1000毫升。

（3）脫色劑   95%乙醇2份，丙酮（化學純）1份。

（5） 復染劑  沙黃1克，蒸餾水100毫升。

2、染色法

（1）抹片，空氣干燥，緩慢通過火焰2-3次固定。

（2）用結晶紫染液染色約1分鐘。

（3）直接加革蘭氏碘液于抹片上（不同法去結晶紫）助染約1分鐘。

（4）水洗后，加脫色劑，反復沖洗。

（5）水洗后，用沙黃液復染約30秒鐘。

（6）水洗后，用濾紙吸干、鏡檢。

（二）瑞氏染色法

1、染液配制：瑞氏染色劑粉0.1克，純粹白甘油1.0毫升，中性甲醇60.0毫升。

置染料于一個干凈的乳缽中，加甘油后研磨至完全細末，再加入甲醇使其溶解，溶解后盛于棕色瓶中經一星期，過濾于中性的棕色瓶中，保存于暗處，該染色劑保存時間越久，染色的色澤愈鮮。

2、染色法

（1） 涂片任其自然干燥。

（2）加染色液約1毫升于涂片上，染色1分鐘，使標本被染液中的甲醇所固定。

（3）再加上與染液等量的磷酸鹽緩沖液（或自來水）用口吹氣，使染液與蒸餾水充分混合，并防止染液的沉淀，經5分鐘左右，使表面顯金屬的閃光。

（4）蒸餾水沖洗后，用濾紙吸干、鏡檢。

四、玻璃器皿的準備

（一）處理

1、新購入玻璃器皿的準備：新購玻璃器皿常附著有游離的堿質，不可直接使用，用前必須先用洗衣粉水或清水洗凈，然后在1%～2%鹽酸溶液中浸泡24小時，以中和其堿質，最后用清水洗凈鹽酸，干燥后備用。

2、用后玻璃器皿的處理：凡被病原微生物污染過的玻璃器皿，在洗滌前必須先進行嚴格消毒。

（1）一般玻璃器皿（如平皿、試管、燒杯、三角瓶等）均可放在高壓消毒器內在15磅壓力下滅菌20～30分鐘。

（2）吸管、玻片、蓋玻片等可浸泡于5%石炭酸或其他的消毒劑溶液中48小時。浸泡吸管的玻璃筒底部應鋪以紗布棉墊，以防投入吸管時管尖破裂。吸過血清、血液的吸管，若無病菌污染，可立即用清水沖洗。

（3）盛有固體培養基（如瓊脂）或油脂（如液體石蠟、凡士林）的玻璃器皿，應于消毒后趁熱將其中的培養基或油脂倒凈，并單獨用溫水洗凈，以免污染其他玻璃器皿。

（4）凡盛有血液或血清的試管或玻璃瓶等，在高壓滅菌之前，必須將其中血清或血液倒入一燒杯中（無病菌污染的血清和血液可直接用清水洗凈），然后洗凈再進行滅菌。

（5）凡曾吸取瓊脂的吸管，不論是否需要消毒，均應于用后立即用熱水沖洗干凈，然后再進行消毒，否則瓊脂凝固，不易沖洗。

（二）洗滌

1、一般玻璃器皿的洗滌

（1）將消毒處理過的玻璃器皿浸泡于清水中，用毛刷或試管刷沾洗衣粉，若器皿上有油污或記號筆標記，用熱水刷洗。最后用清水沖洗2～3次。

（2）經清水沖洗后，如仍有污跡，可用清潔液浸泡24小時，取出用清水沖洗干凈。如不能立刻刷洗，也應用清水浸泡，以免干燥后不易洗刷。

2、吸管的洗滌

（1）將吸管從消毒劑中取出后，先用細鐵絲取出管口的棉塞，若棉塞太緊不易取出時，可將鐵絲尖端壓扁，插入棉塞與管壁之間，輕輕一轉即可將棉塞拉出。

（2）將吸管浸泡于洗衣粉水中，以特制的毛刷或尖端纏有少許棉花的細鐵絲洗刷吸管內部，鐵絲尖端的棉花應隨時更換。

（3）以膠皮管一根，一端接沖洗球，另一端接吸管的尖端，在清水中反復沖洗數次。若仍有污跡，再按（2）處理或置于清潔液缸內浸泡24小時，取出后充分水洗。

（4）洗凈的吸管最后再用蒸餾水沖洗一遍，倒立于底部墊有棉花的鐵絲筐中晾干。

3、玻片的洗滌  取出經過消毒的玻片放入洗衣粉水中煮沸10分鐘，然后用紗布沾洗衣粉擦洗，再經清水沖洗，放入清潔液中過夜，取出后用水洗去清潔液。

4、云霧狀玻璃器皿的洗滌：凡玻璃器皿上有云霧狀而不能用普通方法洗凈時，可用清潔液浸泡24小時，再以清水洗去清潔液。然后用洗衣粉水洗刷干凈為止。

（三）干燥

洗凈的玻璃器皿倒置于清潔的木架上或鋪有清潔紗布的平臺上，令其自然干燥。若急需使用，可將玻璃器皿放入50℃左右干燥箱中迅速烘干，但溫度不宜太高，以免玻皿破裂。玻皿干燥后，用干凈的綢布拭去干后的水跡，玻片干燥后，保存在清潔容器內，或浸于95%酒精中，使用時再用軟布擦去。

（四）包裝

如玻璃器皿需要滅菌，應于滅菌前將玻璃器皿妥善包裝，以免滅菌后被環境中的雜菌污染。

1、平皿的包裝：將平皿用紙嚴密包好，一副或數副包成一包，或放入金屬盒（筒）內直接進行滅菌。

2、吸管的包裝：吸管包裝前，應先用細鐵絲塞少許棉花于吸管口端距管口約半寸處，將吸管一一分別用紙包好，然后大紙將數只吸管包成一束，也可將包好的吸管置于金屬筒中進行滅菌。

3、試管和其他玻璃器皿的包裝：試管和其他玻璃器皿的開口處必須包裝嚴密，加棉塞或直接用紙包扎。棉塞要松緊適度，既要易于撥出，又不能自行脫落為佳。

（五）滅菌

用于盛放無菌材料和細菌分離培養用的清潔玻璃器皿，使用前必須進行滅菌。可用干熱滅菌或高壓蒸氣滅菌。

1、干熱滅菌：用干熱滅菌箱，通常在160℃溫度下處理2小時，溫度超過180℃時，棉塞和紙包易燒焦起火。器皿放入烘箱之前必須干燥，以免引起玻璃破碎，器皿在烘箱內不宜過滿，應留有一定空隙，滅菌后應待溫度降至60℃以下時，才能開門取器皿，否則玻璃可能因突燃遇冷而破碎。

2、高壓蒸氣滅菌：用高壓滅菌器，用15磅壓力處理20～30分鐘，壓力器指針上升至2～3磅時徐徐打開氣門，排出滅菌器內所存留的空氣，直至排出的蒸氣內不夾雜空氣為止，然后關緊氣門，壓力上升至15磅時開始計時。高壓蒸氣滅菌后，玻璃器皿上常常有水珠，可再用烘箱（60～80℃）烘干。

五、無菌操作技術注意事項

1、為了避免外界環境中細菌的污染。在檢測過程中如傾注培養基平板、接種、移種、分離純菌、活菌記數、制備菌懸液等都要在無菌室內進行，如果沒有無菌室，要在酒精燈周圍10厘米的無菌區內操作。

2、實驗室內必須保持整潔，除必要的設備和儀器外，其它物品都不應放在室內。每天清晨或試驗工作結束后，均應打掃衛生，工作臺面，邊臺和桌椅等均用消毒溶液擦拭。

3、實驗人員在進入無菌實驗室前，必須穿戴整潔的工作衣帽和口罩，換鞋后才允許入內。

4、在檢測工作中必須做到嚴格無菌操作防止污染和感染，使用的器械、容器和培養基等，必須要經過滅菌。

5、在檢測工作中，不慎菌液滴在桌面或地面，或濺在其他物體上，必須立刻加以處理，污染的玻璃器皿和器械，可進行高壓滅菌或在消毒液中進行消毒。

suweitong

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