尿素酶快速測定方法之比較

李芝銀

隨著膨化技術在飼料工業中推廣普及，越來越多的飼料生產商在配方中使用膨化大豆粉，與其它蛋白資源一樣，大豆的適度熟化非常重要，熟化程度低會含抗胰蛋白酶等營養抑制因子，熟化度過高又會導致氨基酸利用率低。判斷膨化大豆粉是否合格的主要指標是脲酶活性。脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的條件下，每分鐘每克膨化大豆分解尿素所釋放的氨態氮的毫克數。脲酶本身無營養意義，但它與抗胰蛋白酶的含量接近，并且遇熱變性失活的程度與抗胰蛋白酶相似，因此，尿酶活性用來作為膨化大豆加熱是否合適的間接估測指標。脲酶活性沒有負值，最低為0。在我國現行的國標推薦值為0.3，在美國一般認為以不超過0.2為宜，并且針對日糧中有尿素的反芻動物而言不得超過0.12，當然對于家禽和豬0.3或稍高都可以接受。國內很多大企業一般均采用0.2。 實驗室定量測定脲酶活性的方法較復雜，有滴定法和pH增值法兩種，已有研究表明兩者對同一樣品測得的數值也不相等。目前國內絕大部分企業都采用快速而簡單的簡易判定方法定性地估測脲酶活性，一般來說，主要有如下兩種方法。
一.液態法
1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，會使酚紅指示劑改變顏色。
2.試劑
2.1尿素:GB696，分析純。
2.2酚紅指示劑
2.2.1稱取0.1g酚紅，加1.43mL0.1mol/L氫氧化鈉溶液，在研缽中研磨以促溶解；
2.2.2轉移至250mL定量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻備用。
3.操作方法
3.1取0.2g粉末樣品，置于25mL比色管中。
3.2加0.02g尿素，加酚紅指示劑2滴，再加水20mL，充分搖勻15s。
3.3記錄粉紅色出現時間，并根據時間判斷尿酶活性，顏色出現時間應少于15min。
顏色出現時間

脲酶活性
1min             極強
1～5min
強
5～15min
稍有
15min             無
同時作空白對照試驗。
樣品空白(不加尿素)及試劑空白(不加樣品)，只有上述空白正常時，即酚紅指示劑不改變顏色，試驗結果才是可靠的。
一般企業認為7、8分鐘變色較為合適。

二、半固態法
1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，會使酚紅指示劑改變顏色。
2.試劑
2.1稀硫酸（H2SO4）0.2N。
2.2尿素一酚紅試劑
2.2.1將1.2克酚紅溶解于30ml0.2N的NaOH中；
2.2.2用蒸餾水將之稀釋至約300mL；
2.2.3加入90g尿素（分析純）并溶解之；
2.2.4用蒸餾水稀釋至2L；
2.2.5加入14mL 1.0N的H2SO4或70mL o.2N的H2SO4；
2.2.6用蒸餾水稀釋至最后體積3L；
2.2.7溶液應具明亮的琥珀色。
3.操作方法
3.1在一個150ml的燒杯中倒入少量試劑，注意溶液必須呈明亮的琥珀色。若溶液已轉變為深桔紅色，滴人稀硫酸溶液并攪拌之，直至溶液再度呈琥珀色。
3.2量一匙粉末樣品，放置于培養皿中。
3.在樣品上加入兩匙試劑，輕輕攪拌，將樣品平鋪于培養皿中。若仍有干樣品斑點，則再加入試劑，直至將樣品浸濕。
4.放置5分鐘后觀察：
a.       沒有任何紅點出現：再任其放置25分鐘，若仍無紅點出現，說明大豆粉過熟。
b.      有少量紅點：少量尿素酶活性，可用。
c.       樣品表面約有25％為紅點覆蓋：少量尿素酶活性，可用。
d.      豆餅表面約有50％為紅點覆蓋：尿素酶活性較高，不可以使用。
e.       豆餅表面的75％－100％為紅點覆蓋：尿素酶活性很高，樣品過生，不能使用。
以上兩種簡易脲酶活性估測方法在國內各飼料廠被廣泛采用，尤其是后者在膨化大豆粉生產的在線檢測上很普遍。盡管這兩種方法原理一樣，但是，因其操作過程差異，所以對膨化大豆粉品質的反映內容也不盡相同。
三、液態法和半固態法之比較
首先需要說明的是，這兩種脲酶活性快速檢測方法沒有行業約定俗成的名稱，筆者接觸過的企業均只采用其中的一種方法，對前者可以稱之為“試管法”，后者稱之為“表面皿法”，根據其實施的過程及樣品的狀態，筆者將其區分為“液態法”和“半固態法”。
從實施方法來看，液態法是過程檢測，從開始一直到規定時間段結束，而半固態法屬于斷點檢測，是5分鐘后看結果；液態法通過控制各個體合格，總體自然合格，而半固態法要求的是總體符合統計學上的合格，即允許部分個體不合格。簡單地說，液態法要求每一個微粒的熟化程度均要滿足5分鐘以內不變色，如果一個不合格，整個批次為不合格；而半固態法允許部分微粒在5分鐘內變色，部分不合格，總體可以是合格的。從這點上來說，液態法對膨化大豆粉的品質要求更高，控制更嚴格，不僅要求熟化，而且要均勻熟化。舉例說明，如果在熟化完全的大豆粉樣品中摻入微量（可以是一粒）生大豆粉，液態法會立即變色從而判定為不合格，而半固態法只是增加了一個變色點，總體上仍是合格的。
從上可以看出，這兩種檢測方法對膨化大豆粉品質的反映內容是不一樣的。半固態法反映的是產品符合統計學上的合格，而液態法反映的是完全合格。這兩種不同檢測方法對膨化設備的要求也是有差別的，液態法要求設備能均勻熟化，而半固態法允許產品出現部分不合格，只要總體上符合就可以，對膨化設備的要求自然要低。
可能會有人疑問，膨化大豆粉出來的不都應該是均勻一致的嗎？其實不然，物料在膨化機內受到濕、熱、機械剪切的共同作用從而熟化，機械剪切對膨化大豆粉所起的作用大約能占三成多，如果結構設計上缺陷或部件磨損，就會導致熟化不均勻。目前濕法膨化大豆粉的出料溫度大都在135度左右（對家禽和豬要求可能低點），六年前，筆者曾遇到過膨化大豆粉出料溫度在170度，用液態法檢測仍不合格，出來的料有熟的，有褐變的，還有少許夾生的，如果用半固態法檢測，估計就合格了。次年，一膨化廠使用某企業膨化機生產膨化大豆粉，因不熟被退貨六十噸，根據大部分企業采用半固態法檢測的情況，將其以一定比例摻入熟化料中，最終符合統計學上的合格。上述事件，大概就是這兩種不同測定方法的實踐意義吧。

北京現代洋工機械科技發展有限公司 李芝銀

complement

請問膨化大豆粉的脲酶活性指標控制在多少合適？

李芝銀

看來沒仔細看啊 呵呵
在我國現行的國標推薦值為0.3，在美國一般認為以不超過0.2為宜，并且針對日糧中有尿素的反芻動物而言不得超過0.12，當然對于家禽和豬0.3或稍高都可以接受。國內很多大企業一般均采用0.2。正大系統一般為0.02~0.05。尿素酶活性不是越低越好，太低，會影響蛋白消化吸收率。因此，一些大集團也同時測定蛋白溶解度，一般在0.75~0.8之間。
前些日子參加膨化機國家標準預審，其中對膨化大豆粉的脲酶活性以0.2計。

complement

對，正大系統的要低一些，我們的標準和它差不多。

春節

"滴人稀硫酸溶液并攪拌之，直至溶液再度呈琥珀色。"請問如果操作失當，多滴了一兩滴稀硫酸，會不會影響測定結果？

vicar

說的很透徹啊

蘇曉

向李芝銀同志致敬，我這段時間從他的共享中在膨化方面受到很大幫助。