病毒及其疫苗的生產制備技術《醫用細胞工程》

登高遠眺

第一節
病毒的生產制備

病毒需在活的敏感細胞中才能增殖，在細胞培養技術不成熟之前，人們為研究病毒，往往采用雞胚接種或動物接種的方法來分離、鑒定病毒或制備一定量的病毒液，但這種方法因個體和種屬差異，不僅許多病毒難以找到合適的敏感動物，而且即使在敏感動物中繁殖，往往個體差異大而影響結果的判定，隨著細胞培養技術的發展，首先在病毒學研究方面獲得了廣泛的應用，為病毒的繁殖、鑒定提供了來自不同動物（包括人）、不同組織的細胞來源，通過敏感性篩選，目前絕大多數病毒均可有相應的敏感細胞，為病毒的分離、鑒定和增殖創造了條件。同時也為病毒的大量生產提供了細胞來源，隨著細胞大量生產技術的發展，因此對病毒來說只要有敏感的細胞，就可以進行大規模生產。

一、病毒生產的目的和用途

1、為了制備大量的病毒抗原，以制備病毒的亞單位疫苗或表面抗原疫苗，或用病毒抗原制備免疫血清（抗體）。

2、為了制備病毒的減毒活疫苗或滅活的死疫苗，以用于預防接種。

3、為了生產基因改造后或重組有其它多肽因子的病毒，以用于基因治療或殺腫瘤治療及基因疫苗的預防接種。

4、為了制備干擾素的病毒誘生劑（NDV、仙臺病毒等），用于干擾素的生產。

5、生物戰用的病毒生物戰劑。常選用毒力強、抵抗力強、對不同國家人群最敏感的病毒，又能通過氣溶膠或昆蟲和污染的水土進行傳播的病毒。這是戰爭狂們正在開展的研究，應警惕。

二、病毒生產制備的方法

1、動物接種，如狂犬病毒、腦炎蟲媒病毒采用鼠、兔腦內接種后收取腦組織制成懸液。

2、雞胚、鴨胚接種：如流感病毒、副流感病毒（NDV-F）、仙臺病毒等，目前尚無敏感細胞，常采用9～10日胚齡的尿囊腔接種，37℃孵育72小時收獲尿液，用雞紅血球測定血凝效價。Q熱用7日齡鴨胚進行卵黃囊接種收獲卵黃囊，馬腦炎病毒常采用10日齡雞胚體接種，收獲全胚體液等。

3、細胞培養法（詳見第二篇第18章）

不同的病毒選用相應的敏感細胞，采用轉瓶培養、多層培養、微載體培養或懸浮攪拌培養等方法,先大量增殖細胞，然后接種一定量的病毒,繼續培養適當時間時，凍融細胞后，離心收獲上清。

以上病毒大量生產后可制作病毒疫苗（死疫苗或減毒活疫苗），也可用來作干擾素誘生劑或提取病毒表面抗原成分，但反對用作生物戰劑，危害人類健康和生命。

第二節
病毒疫苗的生產制備

病毒疫苗的生產制備與病毒的生產制備基本相同，目前進行人工主動免疫，用于病毒病預防的疫苗有滅活疫苗（Killed Vaccine）,又稱死疫苗，減毒活疫苗（Live Vaccine）,亞單位疫苗，多肽疫苗、基因缺失的減毒活疫苗，基因工程亞單位疫苗，重組牛痘多價疫苗。

一、病毒疫苗的種類

(一)滅活疫苗：目前常用的有流行性乙型腦炎疫苗，狂犬病疫苗（二倍體細胞與地鼠腎細胞可用于生產狂犬病病毒固定毒滅活疫苗），流感滅活疫苗。常用甲醛為滅活劑，以滅活病毒核酸而不影響其抗原性。

(二)減毒活疫苗，通常采用自然法或人工法，通過動物傳代或細胞傳代篩選對人毒力低的變異株病毒。常用的有脊髓灰質炎疫苗、麻疹疫苗、流感溫度敏感突變株疫苗、流行性腮腺炎疫苗、風疹疫苗、黃熱病疫苗以及一些聯合疫苗（如麻疹、腮腺炎、風疹聯合疫苗）。

(三)亞單位疫苗：用化學試劑裂解病毒，提取包膜或衣殼上的亞單位，除去其核酸，以此制成的疫苗稱亞單位疫苗。如流感病毒的包膜提取后制成的血凝素和神經氨酸酶亞單位疫苗。

(四)多肽疫苗：采用乙肝攜帶者血提取的HBsAg的乙型肝炎疫苗或采用基因工程法制備的HBsAg基因表達產物制備的疫苗。

(五)基因缺失的減毒活疫苗：在病毒的基因組中，使其有毒力的相關基因發生缺失而制成的減毒活疫苗稱基因缺失的減毒活疫苗，如狂犬病毒的胸苷激酶（TK）缺失株（第一代）和gp3區缺失株（第二代），單純皰疹病毒的α22基因缺失株，目前有待進一步研究。

(六)基因工程亞單位疫苗：將病毒表面抗原基因，通過基因重組，在酵母或CHO細胞中進行表達亞單位多肽抗原成分而制成的疫苗，稱基因工程亞單位疫苗，如乙型肝炎病毒的表面抗原HBsAg的基因在酵母和CHO細胞中表達而提取獲得的純品HBsAg多肽。即將上市。

(七)重組牛痘多價活疫苗。以牛痘苗為載體來表達數十種外源性病毒抗原基因，如：HAV、HBV、麻疹病毒、I型和II型HSV、EBV，狂犬病毒等抗原基因，經基因重組后而制成的牛痘苗病毒，經一次劃痕接種可使機體同時能獲得對多種病毒的免疫力，大大減少了接種次數。此外腺病毒和脊髓灰質炎病毒的活疫苗也可作為載體與輪狀病毒的抗原基因重組后的活疫苗，經口服后可同時獲得兩種病毒的免疫力，有待于進一步研究、開發。

上述病毒疫苗有的是采用細胞培養技術和細胞工程來進行生產制備的，現將采用細胞工程制備病毒疫苗種類和敏感細胞以及生產方式規于下表。

二、細胞培養法制備的常用疫苗（如表25-1）。

表25-1
采用細胞培養法生產的常用病毒疫苗

疫 苗		制備疫苗 的 細 胞	培養方法
名 稱	活/死(疫苗株)
脊 髓 灰	滅活（Salk株）	猴腎細胞（原代/2-3代）	轉瓶培養
質炎疫苗	活（Sabin株）	Vero細胞	微載體培養
腮 腺 炎	活（ME株）	幼地鼠、狗腎	轉瓶培養
疫 苗		豚鼠腎細胞	羅氏瓶培養
麻疹活疫苗	Edomonste、 L16、滬191、 Moraten、 Schwar2株	原代雞胚纖維母 細胞，人二倍體 人羊膜、狗腎、羊腎 豚鼠腎細胞	羅氏瓶培養 轉瓶培養
單純瘡疹	死（72株）	兔腎、豚鼠腎	羅氏瓶培養
病毒疫苗		豚鼠胚成纖維細胞	轉瓶培養
巨細胞病毒疫苗	活（Towne株）	WI-38人胚肺細胞	轉瓶培養