細(xì)胞冷凍保存復(fù)蘇技術(shù)，介紹細(xì)胞凍存復(fù)蘇基本材料方法和細(xì)胞運(yùn)輸

登高遠(yuǎn)眺 · 發(fā)表于 2009-2-7 08:06:19

細(xì)胞株(系)的使用，為醫(yī)學(xué)研究和測(cè)試工作帶來了極大的方便。但細(xì)胞的傳代是有限制的，長(zhǎng)期連續(xù)傳代的細(xì)胞，不僅消耗大量的人力和物力，而且細(xì)胞的生長(zhǎng)與形態(tài)等會(huì)有一定退變或轉(zhuǎn)化，因而細(xì)胞失去原有的遺傳特性，有時(shí)還會(huì)由于細(xì)胞污染而造成傳代中斷，種子丟失。因此，在實(shí)際工作中常需凍存一定數(shù)量的細(xì)胞，以備替換使用。細(xì)胞冷凍與復(fù)蘇是細(xì)胞培養(yǎng)室的常規(guī)工作和通用技術(shù)。

第一節(jié) 細(xì)胞的凍存

一、概述

目前，細(xì)胞凍存最常用的技術(shù)是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護(hù)劑的緩慢冷凍法凍存細(xì)胞。細(xì)胞在不加任何保護(hù)劑的情況下直接冷凍，細(xì)胞內(nèi)外的水分會(huì)很快形成冰晶，從而引起一系列不良反應(yīng)。如細(xì)胞脫水使局部電解質(zhì)濃度增高，pH值改變，部分蛋白質(zhì)由于上述原因而變性，引起細(xì)胞內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)紊亂，溶酶體膜由此遭到損傷而釋放出溶酶體酶，使細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)成分造成破壞，線粒體腫脹，功能丟失，并造成能量代謝障礙。胞膜上的類脂蛋白復(fù)合體也易破壞引起細(xì)胞膜通透性的改變，使細(xì)胞內(nèi)容物丟失。如果細(xì)胞內(nèi)冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成細(xì)胞核DNA空間構(gòu)型發(fā)生不可逆的損傷，而致細(xì)胞死亡。因此，細(xì)胞冷凍技術(shù)的關(guān)鍵是盡可能地減少細(xì)胞內(nèi)水分，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可以使冰點(diǎn)下降，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，且對(duì)細(xì)胞無明顯毒性。慢速冷凍方法又可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少胞內(nèi)形成冰結(jié)晶的機(jī)會(huì)，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。

二、主要冷凍設(shè)備和材料

常用的細(xì)胞冷凍貯存器為液氮貯存器，規(guī)格有35L3和50L3兩種。使用時(shí)要注意以下幾點(diǎn)：

（1）一般兩周需充液氮一次，至少一個(gè)月充氮一次。液氮溫度達(dá)-196℃，使用時(shí)注意勿讓液氮濺到皮膚上，以免引起凍傷。

（2）液氮容器為雙層結(jié)構(gòu)，中間為真空層，瓶口有雙層焊接處，應(yīng)防止焊接部裂開。

（3）在裝入液氮時(shí)，要注意緩慢小心，并用厚紙卷筒或特制漏斗作引導(dǎo)，使液氮直達(dá)瓶底，如有專用液氮灌注裝置則更好。若為初次使用，加液氮時(shí)更要緩慢，以免溫度驟降而使容器損壞。

細(xì)胞凍存時(shí)常備的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%～20%的血清培養(yǎng)液，DMSO(分析純)或無色新鮮甘油(121°C蒸氣高壓消毒)，2mL安瓿（或?qū)Ｓ眉?xì)胞凍存管）、吸管、離心管、噴燈、紗布袋（或凍存管架）等。

三、細(xì)胞凍存方法

主要操作步驟為：

（1）選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，在凍存前一天最好換液。將多個(gè)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。適時(shí)去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。用吸管吸取培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，使其成為均勻分散的細(xì)胞懸液。懸浮生產(chǎn)細(xì)胞則不要消化處理。然后將細(xì)胞收集于離心管中離心(1000r/min，10分鐘)。

（2）去上清液，加入含20%小牛血清的完全培養(yǎng)基，于4℃預(yù)冷15分鐘后，逐滴加入已無菌的DMSO或甘油，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，細(xì)胞濃度為3×106～1×107/mL之間。

（3）將上述細(xì)胞分裝于安瓿或?qū)Ｓ美鋬鏊芰瞎苤校碴逞b1～1.5mL在火焰噴燈上封口，封口處要完全封閉，圓滑無勾。冷凍管要將蓋子蓋緊，并標(biāo)記好細(xì)胞名稱和凍存日期，同時(shí)作好登記（日期、細(xì)胞種類及代次、凍存支數(shù)）。

（4）將裝好細(xì)胞的安瓿或凍存管裝入沙布袋內(nèi)；置于液氮容器頸口處存放過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮中。采用控制降溫速度的方法也可采用下列步驟：先將安瓿置入4℃冰箱中2～3小時(shí)，再移至冰箱冷凍室內(nèi)3～4小時(shí)（此步可省略），再吊入液氮容器頸氣態(tài)部分存放2小時(shí)，最后沉入液氮中。

細(xì)胞凍存在液氮中可以長(zhǎng)期保存，但為妥善起見，凍存半年后，最好取出一只安瓿細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況，然后再繼續(xù)凍存。

第二節(jié)
細(xì)胞的復(fù)蘇

一、細(xì)胞復(fù)蘇的原則

在實(shí)際操作中，凍存細(xì)胞要進(jìn)行復(fù)蘇，再培養(yǎng)傳代。復(fù)蘇細(xì)胞一般采用快速融化法。以保證細(xì)胞外結(jié)晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細(xì)胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細(xì)胞。

二、細(xì)胞復(fù)蘇的主要操作步驟

（1）佩戴眼鏡和手套，從液氮罐中取出安瓿或冷凍管。

（2）迅速放入38℃水浴中，并不時(shí)搖動(dòng)，在1分鐘內(nèi)使其完全融化，然后在無菌下取出細(xì)胞。

（3）在1000r/min速度下離心5～10分鐘，棄去上層液，加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中，接種濃度1×109/L，置37℃溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況。若細(xì)胞密度較高，及時(shí)傳代。或無需離心直接將細(xì)胞加入瓶中，并加入培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)12～24小時(shí)后，充去上清，換入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

三、注意事項(xiàng)

在細(xì)胞復(fù)蘇操作時(shí)，應(yīng)注意融化凍存細(xì)胞速度要快，可不時(shí)搖動(dòng)安瓿或冷凍管，使之盡快通過最易受損的溫度段（-5～0℃）。這樣復(fù)蘇的凍存細(xì)胞存活率高，生長(zhǎng)及形態(tài)良好。然而，由于凍存的細(xì)胞還受其他因素的影響，有時(shí)也會(huì)有部分細(xì)胞死亡。此時(shí)，可將不貼壁、飄浮在培養(yǎng)液上（已死亡）的細(xì)胞輕輕倒掉，再補(bǔ)以適量的新培養(yǎng)液，也會(huì)獲得較為滿意的結(jié)果。

第三節(jié)
細(xì) 胞的運(yùn) 輸

由于培養(yǎng)細(xì)胞株(系)的商品化，細(xì)胞培養(yǎng)室之間的交流、交換和購買已成為生命科學(xué)研究中的一個(gè)重要組成部分，培養(yǎng)細(xì)胞的運(yùn)輸成為研究工作的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。如果不了解所要細(xì)胞的性狀、培養(yǎng)液特點(diǎn)及培養(yǎng)注意事項(xiàng)，運(yùn)輸時(shí)不注意使用特殊容器或溫度等，就可能影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，或出現(xiàn)差錯(cuò)，或?qū)е屡囵B(yǎng)失敗等。

裝運(yùn)細(xì)胞的主要方法如下：

一、
冷凍儲(chǔ)存運(yùn)輸

這是一種利用特殊容器內(nèi)盛液氮或干冰的運(yùn)輸方法。保存效果較好，但缺點(diǎn)是比較麻煩，不宜長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸，多需空運(yùn)，代價(jià)較大。

二、
充液法

此種方法較為簡(jiǎn)單。一般選擇生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，以生長(zhǎng)1/3～1/2瓶底壁為宜，去掉舊培養(yǎng)液，補(bǔ)充新的培養(yǎng)液至瓶頸部，保留微量空氣，擰緊瓶蓋，并用膠帶密封，放在一運(yùn)送盒內(nèi)，用棉花等做防震防壓處理。運(yùn)輸時(shí)間需4～5天，一般放在貼身口袋即可，到達(dá)目的地后倒出多余的培養(yǎng)液，只需保留維持生長(zhǎng)所需的培養(yǎng)液置37℃培養(yǎng)，次日傳代。如果在市內(nèi)運(yùn)輸或僅需數(shù)小時(shí)運(yùn)輸路程，也可將細(xì)胞附著面朝上，或把培養(yǎng)液全部倒掉放在胸部口袋運(yùn)送。靠附著于細(xì)胞表面的培養(yǎng)液，可使細(xì)胞短時(shí)間不受損。