對溶菌酶的工藝開發角度的綜述

葉赫娜蘭.孤城

王兄：

　　你好！

　　來信收到，你的報告很直接，也很簡潔，相信是企業所樂于接受的。你說的可行性報告，我稍后會一一做來，或者，王兄你做，是不是更直接，不管怎樣，我先把溶菌酶及其他結構活性物質（主要是蛋白）在畜牧行業的應用，簡單介紹下。

獸用結構蛋白，在分子時代以前，主要是以下幾個方面：

1、蛋白提取溶菌酶，主要用于很特殊的方面，如，極端抗藥性的感染情況下，奶牛子宮消炎等，原因是價格，換算成純蛋白，成本在2000-3000元/KG，用這種工藝得到的溶菌酶是不具備大量應用的可能的（大量應用的價格應在1000以內）。

2、蛋黃抗體，當惡性獸類流行病橫行時，會先讓雞輕微感染此病，然后在蛋黃內提取抗體，缺點還是成本，奇高。

3、免疫激活劑，主要是微生物細胞壁上附著的糖蛋白，是細胞壁的粗制品，低端產品，效果不穩定，不明確。

4、偽干擾素類產品，由免疫激活劑加載植物提取物，抗病毒合成藥物而成，低端產品，有效果，但事實是草藥和抗病毒藥物的效果，這類產品，簡直是他媽兒戲。

5、干擾素，理論上講，可以從血液得到動物干擾素，但干擾素有種的差異性，所以，從成本上考慮，不可能把動物源干擾素用于同種動物。所以，實際上，這種產品，是沒有的。

葉赫娜蘭.孤城

　　在分子時代前，得到蛋白藥物也是不難的，如溶菌酶，抗體，干擾素，但成本是不能接受的，只有進入分子時代后，用分子技術生產蛋白，才具有真正意義上的商業價值。

　　發酵行業進入分子時代后，畜牧業也正好面臨一個大的變動，就是歐盟的全面禁抗（抗生素），大陸的畜牧業，不具備依靠國內市場存活的能力，而大陸的養殖環境，又決定了養殖動物始終是在亞健康狀態生長，這就進入了一個悖論：誰用抗生素，誰的產肉率高，而誰的產品就沒法賣；誰不用抗生素，誰的產肉率就低，誰就賠錢賣！分子時代的溶菌酶，就是在這種環境下，被提上了議事日程。

　　為什么首先是溶菌酶，而不是其他產品，如干擾素，如抗體，被關注呢？不同于溶菌酶，做抗體，做干擾素，一方面，聽起來技術含量就高（注意，是聽起來，聽起來而已），而且，在人藥方面，抗體和干擾素積累了大量的技術經驗，比如說，高等動物基因在微生物細胞環境內表達，比如說，糖基化（沒有糖基化的蛋白會被蛋白酶水解，而來不及表達活性）及高等動物糖基化的種的差異性，這些經驗完全可以在開發雞，牛，豬，馬，鴕鳥，駱駝，老虎，等等而應用。

葉赫娜蘭.孤城

　　其實，這牽扯到畜牧業的行業特點，駱駝，老虎不是不能養，是量太少，而雞，牛，豬，我們關心的是在群體水平下，在可接受的經濟投入上，動物產品的最大化，雖然，個體死亡是構成群體死亡的元素，是行業不愿看到的，但，事實上，個體死亡是不被嚴肅對待的，更絕對不會真正注意個體水平的健康問題。換句話說，畜牧業關心的是，以經濟投入為x軸，以動物蛋白產量為y軸，得到函數的微分函數的最大值。

　　所以，只有具有以下特點的產品才有可能在這個行業里，（這種游戲規則下）被重視（或說，也會很快實現產品附加值）：

1、價格低，（當然，附加值更低）用量大，可以被大量應用，最好是防病或用于亞健康，如果治療，應用面就窄了（這個行業的市場容量之大，始終會超出人的想象，在行業待了4年，聽了不少傳聞，看了不少傳奇，當聽到哪個產品賣了多少，有時我還會吃驚，更不是業外人士可以想見）。
   
2、可以適用于應付群體生長問題，令用戶在此水平核算成本與收益，而不是面對動物個體的問題。

3、開發商，如有遠見，把產品開發，定位時，充分考慮和接受以上兩點，而生產的產品。

葉赫娜蘭.孤城

那么，我們看一下，就會發現溶菌酶可以在現在的歷史條件下（歐盟的全面禁抗，及相應的國內國際背景），經過努力，是可以符合以上1，2，3，點了。因此，首先被關注的，是它（而抗體和干擾素，只能作為第二代產品應用----除非突然出現某種對癥的惡性流行病，才能打破這個次序）。

現在的歷史時期，是其他科研單位，包括我們實驗室，經典做抗體和干擾素，面對開發，首先想到人用藥模式（生產規模，利潤率，利潤、成本構成，利潤模式，市場模式），用它來衡量獸用溶菌酶開發，如果看不到市場真正的大小，即便不考慮轉讓費，就算只是“為做好一件事，而去做這件事”也是很容易打退堂鼓的，因為在人用藥的思路下（50升微型罐，精提取，精包裝，代金銷售，高回扣），獸用藥給出的價格，是不可想象的。

所以，目前暫沒有國內權威研究機構做這一塊工作，不過，既然已經進入了分子時代，而且，分子改造生產的確成本大大低于蛋清提取，行業內還是有做的。下面對此進行介紹。

葉赫娜蘭.孤城

澳洲易太公司，是名義上的海外公司，經濟內幕不詳。人員構成，以畜牧業海歸為主。口號類似湖南衛視，說：“我們一直被模仿，但從未被超越。”這樣類似的話。據說是國內最大的獸用溶菌酶生產廠家，應用技術不詳。但從成本考慮，肯定不是蛋清提取。懷疑是酵母菌表達。

杭州康德權公司，申請有一個專利，但似乎始終沒有產品問世，專利顯示，是用酵母菌表達（我甚至懷疑他們并沒有工業水平的技術，而搖瓶又太沒意義）。

其余有幾個生產成品而非原料的廠家，技術內幕不詳。如果做，應該也是酵母菌表達。

一般的，用酵母表達，成本應在600元/KG純蛋白以上，而目前的單位售價，大概在1000元/KG純蛋白以上（原料）。如果用大腸桿菌表達，300-400元/KG純蛋白或以下是可以做到的。但市場上應該沒有大腸桿菌表達的產品。

為什么懷疑（或推斷）大部分廠家是用酵母而不是大腸呢？我們實驗室做酵母和大腸都很普遍了，我來猜一下，可能基于以下三個原因：

葉赫娜蘭.孤城

1，最早做人用蛋白時，首選是酵母，是由于早期提取工藝下回避毒性問題。后來雖然技術攻克了，但成本集中在后面資金運作，所以也就不改了。如果（其實是只能）沿用人藥技術，而不做新的開發，沿用以往技術，是想當然的選擇。

2，二硫鍵，用大腸做的優勢在于高表達量，形成包涵體，二硫鍵的存在，對蛋白復性影響巨大，往往因為它的存在而無法復性。現在用的溶菌酶有兩個二硫鍵，折疊正確有一定困難。如果加信號肽，在酵母中表達并引出細胞，形成可溶性蛋白，則提取簡單----過一遍柱子就行，無需復性。

3，工藝問題，搖瓶做包涵體可以達到總蛋白的20%以上，但到罐上就不長了。關鍵是配方和工藝沒走通。做好這一步，國內的SCI文章發了很多，但經驗，（相對于我們以往做抗生素的水平）是一點也沒有。

而我們實驗室可以會避開以上問題。

作為微生物技術國家重點實驗室和國家糖工程中心，做蛋白的折疊（包涵體復性）和糖基化，并非我們實驗室的高端，但在國內，在這方面，我們是理所當然的權威。至于發酵罐工藝表達，先不必說你，我兩個老發酵的水平----這與我無關的----手上正好有與國外（原導師實驗室）合作開發的一個工藝，適合大腸的外源蛋白表達。緣由是這樣的：

葉赫娜蘭.孤城

最早，為了培養碩士生，也與其他院校交流（其實是做點東西和國內院校換DNA，當然互相擔保不用于商業目的），開發過一個做感受態細胞的蛋清溶菌酶，搖瓶水平，閑著也是閑著，把復性也做了。后來知道與獸用溶菌酶是一個。如果擴大，就套用做抗體的工藝就是了。所以，應該沒有問題。這是一個成熟的工業水平工藝。

不僅如此，如果專利有任何東西可能撞車，（雖然我知道在工業水平是不可能的）我們都有技術力量合理規避開（僅僅出于實驗室考慮，我們也會這么做）。

另外，在工藝方面，我們可以做交鑰匙工程，也可以和對方的技術人員協商解決，也可以先做可行性報告，不過，建議還是王兄做，一方面，你經驗多，我把情況介紹清楚，你還需要什么我再給，另一方面，如果我做，會套用原來的模板，那時的平均工資水平，定在6000元/年，相應的動力費用，也太低，還得從頭算，太煩。呵呵，不過王兄非讓我做，我就上。

葉赫娜蘭.孤城

至于琥珀酸等有機酸發酵，小分子藥物，PHA,PHB,聚乳酸，是實驗室賴以發家和申請課題經費的核心，也是我們的技術專長，如果轉讓，可能價值不菲----雖然實際上，錢我們早已經在國家那里拿到了，但此事關系到實驗室和整個生科院的聲譽。操作肯定要小心些。賢兄既然關心，我下次給你介紹清楚（很快，一兩天）。

賢兄身處此位，手頭企業資源比較豐富，看能讓我倆有何作為。在畜牧業，由于各國自然環境不同，人文環境不同，更有經濟環境及結構不同，國外產品其實不足訓！如果真讓此等產品推廣了，也許，畜牧行業就開始走出了仿造國外產品的時代。這樣，于國于民，于人于己，都不算壞事。作為上世紀九十年代的重點高校畢業生，你我也可了慰此心吧。

國外產品不足訓！----愿以此言，為一個好的開始。


                                                   弟，斌，即日

葉赫娜蘭.孤城

以上是和四川抗生素研究所的往來信件，談到溶菌酶，拿來放在這兒了。

1，不用WORD格式，省的弟兄們下載來下載去，煩。

2，不修改，雖然唐突，但是真實。

3，我的一家之言，錯誤和片面處肯定不少，歡迎批評，指正。真的，渴望交流。

        坐在實驗室，透過窗戶看出去，穿越層樓，是遠處群山的山頂，風云變時，姿態萬千。隨手抽屜內，有綠茶花茶烏龍茶，歡迎各位到山大，同品茗觀雨，孤城當側立執壺以奉。

葉赫娜蘭-孤城 于 2009-4-9 17:13 補充以下內容

弱弱的問一句，沒人留言嗎？批評也是好的啊。

葉赫娜蘭.孤城

分子生物學，并不是分子水平的生物，或生化，或生理學。其實，它是指分子水平的DNA學，除了DNA外, 對其他有機物也是圍繞與DNA的關系展開的。考慮到在我們發酵生理學的視點下，DNA的價值，是蛋白的信息載體，而一切生理變化，都是蛋白活性的宏觀表達。那么，目前的生物技術，可以認為只有兩個大的方面（或技巧）：1，通過分子水平DNA技術，抑制細胞內源蛋白活性。2，表達細胞外源蛋白及其活性。

表現在宏觀上，就可以實現代謝流調控，蛋白產品的獲得，用外源酶合成或催化反應等。比如像代謝流調控，我們找到編碼琥珀酸脫氫酶的基因，并敲除之，使這個蛋白不能表達，則從琥珀酸到延胡索酸的反應不能進行，來積累琥珀酸，屬于第一種情況。我們敲除PTSG這個基因，使細胞對各種不同的糖沒有選擇性，也屬于第一種情況，而引入另一個基因，使糖代謝加強，就是第二種情況了。在合成PHA時，外源基因指導合成三個外源酶，并在細胞內表達活性，就屬于第二種情況。當然，表達外源蛋白最典型的，還是直接以被表達蛋白為產品，不過當蛋白需要被修飾時（如糖基化），就又需要這兩種技巧的配合或反復使用了。

這樣得到的菌株，生產產物的代謝十分直接，往往轉化率在90%或以上。但是，細胞本身的活力比較弱，也會有大量的宏觀上類似回復突變的生理問題。這就是為什么我說：“現代發酵，分子調控，菌種和工藝是分不開的，有時，工藝唯一的目的，就是保證菌種處于某種特定狀態而已。”----因為，許多本來由我們過程工程師在生理水平控制的代謝，分子技術已經幫我們在種子階段解決了，而同時，又丟給我們一些不大不小的新問題。

以往，類似味精發酵，獲得初級代謝產品，并減少中間代謝產物和副產物，需要工藝近似苛刻的控制，而現在，就不必了。