轉(zhuǎn)基因技術(shù)與動物育種

shigang · 發(fā)表于 2009-4-9 17:25:52

轉(zhuǎn)基因技術(shù)與動物育種
摘
要：從20世紀(jì)80年代中后期以來，現(xiàn)代生物技術(shù)的出現(xiàn)和各種分子生物技術(shù)的應(yīng)用，使動物育種已開始從群體水平進(jìn)入分子水平。轉(zhuǎn)基因技術(shù)最為21世紀(jì)發(fā)展最為迅速的生物高新技術(shù)之一，隨著其不斷發(fā)展在動物育種中取的很大的成果。因此轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有誘人的前景和發(fā)展前途。本文簡要總述了轉(zhuǎn)基因技術(shù)的原理、方法、研究前沿領(lǐng)域以及應(yīng)用與動物育種的進(jìn)展情況。
關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因技術(shù)
轉(zhuǎn)基因動物
動物育種
引言:常規(guī)育種方法是建立在利用種內(nèi)遺傳變異的基礎(chǔ)之上的。但對于遠(yuǎn)緣生物的雜交是及其困難的，有些甚至是不可能的，這就是眾所周知的種間生殖隔離。那么能否打破這種隔離，使一種生物同時(shí)具有一種或幾種生物的優(yōu)良性狀，進(jìn)而培育符合人們意愿的生物新品種，更好的服務(wù)于人類？科學(xué)家們經(jīng)過多年艱苦的努力和探索，已經(jīng)使其成為可能，這就是在基因工程發(fā)展的基礎(chǔ)上，融基因工程和胚胎工程為一體的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。這種技術(shù)的應(yīng)用可以打破這種種的界限而使育種工作可以充分利用所有遺傳變異，其實(shí)質(zhì)就是通過對胚胎導(dǎo)入、去除或抑制部分基因，培養(yǎng)出獨(dú)具特色的動物。自Palmiter和Brinster1982年將大白鼠生長激素基因顯微注射到小白鼠受精卵獲得比正常小鼠大1倍的“超級巨鼠”以來，世界各國科學(xué)家競相開展轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究，通過多種轉(zhuǎn)基因方法在豬、牛、雞、兔、羊等動物上獲得成功。轉(zhuǎn)基因技術(shù)不僅可以加快改良遺傳性狀的進(jìn)程，使選擇的效率提高，改良的機(jī)會更多，而且可以提高動物生長速度以及動物的抗病力。如今轉(zhuǎn)基因技術(shù)正在對動物育種產(chǎn)生一場新的革命[1]。
1 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的概述
1.1轉(zhuǎn)基因技術(shù)的概念

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是一門起始于20世紀(jì)70年代高新技術(shù)，是按照科研和生產(chǎn)需要在分子水平上用人工方法提取或合成不同生物的遺傳物質(zhì)（DNA片段）,然后在體外切割,并連接形成重組 DNA,重組DNA再與載體的遺傳物質(zhì)重新組合，將其引入到?jīng)]有DNA的受體細(xì)胞中，進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，生產(chǎn)出符合人類需要的產(chǎn)品或創(chuàng)造出生物的新性狀,并使之能穩(wěn)定地遺傳給下一代[2]。簡要地說是指將體外重組DNA通過顯微注射或載體系統(tǒng)導(dǎo)入胚胎細(xì)胞中，并整合到基因組中，得到穩(wěn)定地表達(dá)的技術(shù)[3]。
1.2轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的概念

轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)是在20世紀(jì)80年代初發(fā)展起來的。從這項(xiàng)技術(shù)誕生的那天起,它就在改良畜禽生產(chǎn)性狀、提高畜禽抗病力以及利用轉(zhuǎn)基因畜禽生產(chǎn)非常規(guī)畜牧產(chǎn)品(如人藥用蛋白和工業(yè)用酶)等方面顯示了廣闊的應(yīng)用前景[4]。它是將外源基因或體外重組的基因轉(zhuǎn)移到動物的受精卵內(nèi),使其在隨后發(fā)育的動物體內(nèi)得到整合和表達(dá)，以產(chǎn)生具有新的遺傳特征或性狀的動物個體的過程，或者是將外源基因在特定調(diào)控元件作用下在某些宿主組織中進(jìn)行獨(dú)立的復(fù)制,并在一定的時(shí)間內(nèi)表達(dá)外源蛋白的過程[1]。
1.3轉(zhuǎn)入基因的選擇[5]

目前，在動物轉(zhuǎn)基因的選擇上主要考慮能提高動物的生長速度、產(chǎn)生性能、繁殖性能、抗性及開拓新的經(jīng)濟(jì)用途等幾個方面，主要包括四大類: 1）編碼蛋白基因，這類基因參與機(jī)體組織生長發(fā)育的調(diào)節(jié)，如生長激素基因等；2）抗性基因，抗逆、抗病等; 3）經(jīng)濟(jì)性狀的主效基因，如豬和綿羊的高繁殖力基因和肉牛的“雙肌”基因等，這些基因與動物的生產(chǎn)力密切相關(guān)；4）治療人類疾病所需的蛋白質(zhì)基因,以拓寬動物的經(jīng)濟(jì)用途

1.4轉(zhuǎn)基因動物的遺傳修飾策略[6]
轉(zhuǎn)基因動物的遺傳修飾策略包括：
（1）導(dǎo)致產(chǎn)生新功能的基因組修飾（gain of function,GOF）,主要有普通轉(zhuǎn)基因及基因重復(fù)；
（2）導(dǎo)致功能丟失的基因組修飾（loss of function, LOF），主要有插入突變、大片段缺失突變、點(diǎn)突變及條件性基因缺失突變；
（3）導(dǎo)致基因替換的基因組修飾，主要利用基因打靶技術(shù)使替換位點(diǎn)上的內(nèi)源基因被另一個基因取代，使得內(nèi)源基因丟失的同時(shí)，獲得另外一個基因的功能，這種策略通常比較精確，不影響鄰近位點(diǎn)基因結(jié)構(gòu)；
（4）染色體畸變。
1.5 生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的一般步驟包括[5]:
（1）選擇能有效表達(dá)的蛋白質(zhì)。

（2）克隆與分離編碼這些蛋白質(zhì)的基因。

（3）選擇能與所需動物組織特異性表達(dá)方式相適應(yīng)的基因調(diào)節(jié)序列。

（4）把調(diào)節(jié)序列與結(jié)構(gòu)基因重組拼接，并在培養(yǎng)細(xì)胞或小鼠中預(yù)先檢驗(yàn)其表達(dá)情況。

（5）把拼接的基因引入到受精卵的細(xì)胞核中。

（6）把引入后的受精卵移植到子宮，完成胚胎發(fā)育。

（7）檢測幼畜是否整合外源基因、外源基因的表達(dá)情況以及外源基因在其后代中的傳遞情況。部分后代細(xì)胞攜帶有轉(zhuǎn)入的外源基因，利用這些動物培育的新的品系。
2 轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的一般方法

使動物組織能夠特異性地表達(dá)外源蛋白質(zhì)，需要人為地將編碼這種蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)移到動物的胚胎中,使目的基因能夠整合到動物染色體上，進(jìn)而得到表達(dá) [7] 。
制作轉(zhuǎn)基因動物的方法主要有以下幾種。
2.1顯微注射法
是由美國人Gordon于1980 年首次發(fā)明。顯微注射法的制作過程是將SV40 的TK基因整合的質(zhì)粒以顯微注射法注入到小鼠受精卵原核中,首次成功地培育出轉(zhuǎn)基因小鼠。其基本原理是通過顯微鏡注射將外源基因直接注射到受精卵的雄原核內(nèi),將外源基因整合到DNA 中,發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物。其優(yōu)點(diǎn)是直接對基因進(jìn)行操作,整合率較高.缺點(diǎn)是技術(shù)難度高,成功率低[8,9,10,11]。
2.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒傳染法

此法的研究是1974 年Janenissh等將SV40DNA注入小鼠囊胚腔中，獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。其原理是利用逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs區(qū)域具有的轉(zhuǎn)錄啟動子活性這一特點(diǎn)，將外源基因連接到 LTRs的下部進(jìn)行重組后，再使之包裝成為高滴度的病毒顆粒，直接感染受精卵或注入囊胚中，攜帶外源基因的反轉(zhuǎn)錄病毒DNA可以整合到宿主染色體上。逆轉(zhuǎn)錄病毒法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，外源基因的整合率高，動物病毒所具有的啟動子不但可以引發(fā)一些選擇標(biāo)記基因的表達(dá)，還能引發(fā)所導(dǎo)入的外源基因的表達(dá)，缺點(diǎn)是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體容量有限并且外源基因

難以植入生殖系統(tǒng)。成功率較低。而且逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體具有致癌性，所攜帶的外源基因片段的長度受到限制，一般不超過10kb [8,12,13,14,15]
。
2.3精子載體法
Lavitrano等1989 年首次報(bào)道把PSV CAT質(zhì)粒與小鼠的附睪精子共育30min,進(jìn)行體外受精和移植,獲得了陽性鼠并能遺傳給后代。但不少實(shí)驗(yàn)利用相似的方法進(jìn)行研究，未能重復(fù)這一結(jié)果。直到十年后Anthomy等才驗(yàn)證了這一事實(shí)。其原理是直接用精子作為外源DNA載體的基因轉(zhuǎn)移法，精子直接與外源的DNA混合培養(yǎng)，外源基因可以進(jìn)入精子頭部，受精后可以發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是利用精子的自然屬性克服人為機(jī)械操作給胚胎
的損傷，整合率高，成本低。缺點(diǎn)是結(jié)果不穩(wěn)定 [9, 10,11,13,15,16]
。
2.4 體細(xì)胞核移植法

1997 年，英國PPL公司的科學(xué)家Schnieke與羅斯林研究所的Wilmut等聯(lián)手通過體細(xì)胞核移植技術(shù)率先在世界上制作了轉(zhuǎn)基因綿羊Dolly。研究者將人凝血因子IX基因整合到羊胎兒的成纖細(xì)胞中，然后用整合了IX基因的羊胎兒成纖細(xì)胞作核供體，獲得了3只轉(zhuǎn)基因綿羊（其中一只生后不久死去）。該技術(shù)的步驟是：首先將外源基因?qū)氲襟w細(xì)胞中，再將該細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，選擇其中有外源基因的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，再把這種細(xì)胞的細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞中，將重組胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)或者植入同步化的假孕動物的輸卵管進(jìn)行動物克隆，從而獲得轉(zhuǎn)基因動物。體細(xì)胞核移植制備轉(zhuǎn)基因動物總效率高于原核顯微注射法，另外可以在核移植前選擇后代的性別，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代遺傳背景及遺傳穩(wěn)定性一致，故不需選配，僅一代就可建立轉(zhuǎn)基因群體，節(jié)約時(shí)間和費(fèi)用。存在的問題是研究基礎(chǔ)較為薄弱，體細(xì)胞系難以建立，細(xì)胞的傳代次數(shù)有限，成功率低 [10,14,17,18,19,20,21]
。
2.5 胚胎干細(xì)胞法
胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞,Embryo
Stem
Cell)
指囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中尚未進(jìn)行分化的細(xì)胞。這種細(xì)胞具有類似癌細(xì)胞無限繁殖和高度分化的潛能，將目的基因轉(zhuǎn)移入ES細(xì)胞導(dǎo)入囊胚或經(jīng)篩選后對轉(zhuǎn)入外源基因的ES細(xì)胞進(jìn)行克隆，可培育轉(zhuǎn)基因個體。1981 年Evans等用不同的培養(yǎng)系統(tǒng)從小鼠囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離開建立了多潛能干細(xì)胞。Bradly等于1984年用顯微注射法將從 129/SV/EV 鼠中分離的ES細(xì)胞株移植到胚泡腔，植入受體母鼠子宮，發(fā)育成生殖嵌合體。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，可對轉(zhuǎn)化的干細(xì)胞進(jìn)行陽性選擇，提高了轉(zhuǎn)基因效率；可以克服外源基因隨機(jī)整和所帶來的一些弊端，而且可在體外條件下對外源今音的表達(dá)進(jìn)行篩選，為創(chuàng)造特定的預(yù)知轉(zhuǎn)基因動物開拓了一條新的途徑。缺點(diǎn)是第一代一般是嵌合體，很難把外源基因遺傳給后代；而動物育種需經(jīng)過嵌合體途徑，受ES細(xì)胞的生殖嵌合能力以及交配概率的影響，實(shí)驗(yàn)周期較長 [8,13,14,17,18,22]
。
2.6
人工酵母染色體法
人工件木染色體法是近年來發(fā)展起來的新型載體，能夠克隆出百萬堿基對的大片段外源DNA 。該方法可以通過兩條技術(shù)途徑達(dá)到轉(zhuǎn)基因的目的。第一條途徑是胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染酵母人工染色體后，體外篩選。陽性胚胎干細(xì)胞囊胚腔注射；第二條途徑是酵母人工染色體的原核注射。其優(yōu)點(diǎn)是：（1）保證巨大基因的完整性；（2 ）保證較長的外源片段在轉(zhuǎn)基因動物研究中的整合率提高；（3）鑒于基因的完整性，目的基因上下游側(cè)翼序列可以消除或減弱基因整合后的位置不變。因此，人工酵母染色體法具有廣闊的應(yīng)用前景。Fujiwara等建立210KB人工酵母染色體DNA轉(zhuǎn)基因小鼠，在乳腺獲得高水平表達(dá)人乳白蛋白，而未表現(xiàn)出普通轉(zhuǎn)基因鼠所出現(xiàn)的位置效應(yīng) [14,15,18,22]
。
2.7
基因打靶技術(shù)

基因打靶技術(shù)，也稱定位整合技術(shù)。基因打靶的方法是將細(xì)胞基因組中的某一序列克隆并加以改造后重新導(dǎo)入細(xì)胞中，這一序列就可以與基因組內(nèi)的同源序列發(fā)生重組，從而將改造后的基因轉(zhuǎn)移到基因組沒，實(shí)現(xiàn)基因的定位突變。1988 年Mansow首次采用該技術(shù)使轉(zhuǎn)移基因在體內(nèi)的定點(diǎn)整個成為現(xiàn)實(shí)，產(chǎn)生了敲除特定基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。該技術(shù)的方法包括基因敲除和基因契入，同源重組等方法。此方法的優(yōu)點(diǎn)在于清除了盲目性和偶然性，并且整合位點(diǎn)，精確表達(dá)水平高。其缺點(diǎn)是產(chǎn)生的串聯(lián)重復(fù)序列不穩(wěn)定，能自發(fā)進(jìn)行二次同源重組
[8,11,12,14,16,18]
。
2.8
原始生殖細(xì)胞技術(shù)

原始生殖細(xì)胞（Primordial germ cell,PGC ）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)在原理和方法上與ES細(xì)胞技術(shù)相似。而且制作轉(zhuǎn)基因家禽方面有明顯的優(yōu)勢。Brimster將ZF---LacZ系供小鼠的PGC植入C57B2/6XSTL雜交一代小鼠的曲精管，發(fā)現(xiàn)移植后的PGC能發(fā)育成具有受精能力的精子細(xì)胞，并能產(chǎn)生后代，Nationtff等于1994 年用此方法制作了轉(zhuǎn)基因雞。而大家畜PGCS可否像小鼠ES細(xì)胞那樣抑制分化并增加，到目前還不能得出確切結(jié)論。如果能，這將為動物轉(zhuǎn)基因帶來一場革命 [9,19]。
2.9脂質(zhì)體介導(dǎo)法

將構(gòu)件的還有外源基因的載體通過用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將外源基因轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的體細(xì)胞，然后，篩選的細(xì)胞與轉(zhuǎn)核的卵母細(xì)胞融合，經(jīng)電激活在體外培養(yǎng)至囊胚移入受體,最終獲得轉(zhuǎn)基因個體。脂質(zhì)體易于制備并具有高效運(yùn)載DNA片段的能力,其最大特點(diǎn)是可與受體細(xì)胞類型發(fā)生結(jié)合,受體細(xì)胞會將含外源基因的脂質(zhì)體吞噬進(jìn)來,從而實(shí)現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)移.岳軍明等采用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)技術(shù)將人EPO基因轉(zhuǎn)移到小鼠體內(nèi),為貧血病人的基因治療提供了科學(xué)依據(jù) [11,18]
。
2.10 電擊法
電擊法又叫電穿孔法，電脈沖刺激法或電場轉(zhuǎn)移法。其原理是外界的高電壓脈沖可以改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使膜產(chǎn)生可變性的電穿孔，從而使得一定大小的DNA分子通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞核，并進(jìn)一步整個到宿主DNA上。1992年，Lonue等利用該方法在魚類的轉(zhuǎn)基因研究中獲得成功。許麗艷等利用該方法制作了轉(zhuǎn)人A Y W基因家蠅 [8,11,18]
。
2.11胞質(zhì)內(nèi)顯微注射法
鑒于精子載體法存在較大爭論，1999 年Authony CF perry等預(yù)先將小鼠精子進(jìn)行破膜處理，與編碼綠色熒光蛋白GTP或S—半乳糖苷酶報(bào)道分子的外深DNA短時(shí)間共孵育，然后微注射入減數(shù)分裂Ⅱ期的卵母細(xì)胞中，最后可獲得轉(zhuǎn)基因的表達(dá)胚胎，然后通過胚胎移植能得到轉(zhuǎn)基因動物 [15,21,22]
。
2.12
扎刺法
這種方法是先將胚胎放在含有目的基因的培養(yǎng)液里，然后用針扎到細(xì)胞或細(xì)胞里。針快速拔出，此時(shí)外源基因就進(jìn)入細(xì)胞核。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的流動性隨之而關(guān)閉，胚胎內(nèi)進(jìn)入的溶液很少。這種方法比顯微注射快，對胚胎損害小，但轉(zhuǎn)基因頻率低 [8]
。

除上述幾種常用的轉(zhuǎn)基因方法外，人們?yōu)榱诉m應(yīng)于一些特殊需要也探索了一些其他的方法。如畸胎瘤細(xì)胞介導(dǎo)法，激光導(dǎo)入法，受體介導(dǎo)法，染色體片段顯微注射法，高效微彈法等，但均因不太成熟不能廣泛使用。綜上所述，雖然目前使用的制備轉(zhuǎn)基因動物的方法也不少，但總體看來，仍不是十分理想，效率較低 [22]
。

3提高轉(zhuǎn)基因效率的方法[10,22]

轉(zhuǎn)基因的效率主要體現(xiàn)在導(dǎo)入基因的整合與表達(dá)上。轉(zhuǎn)基因在宿主體內(nèi)的整合與表達(dá) 一直是轉(zhuǎn)基因基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。主要表現(xiàn)在兩個方面，一是基因構(gòu)件的設(shè)計(jì)和轉(zhuǎn)基因陽性胚的篩選方法，二是對“位置效應(yīng)”有緩解作用的特殊DNA 序列的研究和基因共轉(zhuǎn)移的探索。
3.1 基因構(gòu)件的設(shè)計(jì)
3.1.1 啟動子和內(nèi)含子

啟動子決定了外源基因在體內(nèi)能否表達(dá)及表達(dá)效率的高低。把外源基因及其相配套的啟動子重組后，導(dǎo)入受體動物細(xì)胞，使其在染色體特異位點(diǎn)上進(jìn)行定向重組，整合與表達(dá)，是建立轉(zhuǎn)基因動物及其應(yīng)用研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。選擇能指導(dǎo)外源基因高水平表達(dá)的啟動子，對于研究外源基因在轉(zhuǎn)基因動物中的表達(dá)十分重要外源基因的有效表達(dá)還取決于轉(zhuǎn)入基因是否有內(nèi)含子，在轉(zhuǎn)基因動物中用 DNA比CDNA 有更適宜的表達(dá)。Chol 和Palmiter 分別用實(shí)驗(yàn)證明了這一點(diǎn)。
3.1.2 增強(qiáng)子，反式作用因子和載體

由于增強(qiáng)子的作用無方向性和位置性，外源DNA 整合后可能受插入位點(diǎn)臨近部位宿主增強(qiáng)子序列的作用，因而，構(gòu)建基因時(shí)帶有增強(qiáng)子序列，將會有效地提高目的基因的表達(dá)水平。另外，研究發(fā)現(xiàn)，某些增強(qiáng)子具有組織特異性，對實(shí)現(xiàn)目的基因的組織特異性表達(dá)有重要作用。反式作用因子在外源基因的特異表達(dá)中不僅能激活不同種外源基因轉(zhuǎn)錄，而且能結(jié)合到染色體的不同位點(diǎn)，同時(shí)，將一個基因的調(diào)節(jié)序列與另一個基因的結(jié)構(gòu)序列重新組合，可以產(chǎn)生新的組織特異性表達(dá)。自從Cohen 等1973 年引入質(zhì)粒PSC101 作克隆載體以來，克隆載體的整體結(jié)構(gòu)與效率已有極大的發(fā)展改進(jìn)，酵母人工染色體載體是近年來發(fā)展起來的新型載體。利用該載體能保證巨大基因的完整性，可清除或減弱位置效應(yīng)，從而提高外源基因的表達(dá)水平。
3.1.3 轉(zhuǎn)基因定位整合設(shè)計(jì)

轉(zhuǎn)基因的定位整合，可通過打靶技術(shù)實(shí)現(xiàn)，該技術(shù)可以清除操作過程的盲目性和偶然性，進(jìn)行有目的基因定位，從而提高轉(zhuǎn)基因效率。
3.2 體內(nèi)標(biāo)志系統(tǒng)的應(yīng)用

解決轉(zhuǎn)基因動物效率低的一個方法是發(fā)展一種著床前篩選轉(zhuǎn)基因陽性胚胎的方法，目前應(yīng)用的有PCR 法和體內(nèi)標(biāo)志系統(tǒng)即使用報(bào)道基因的方法，一般常用的報(bào)道基因有細(xì)菌氯酶素乙酰基轉(zhuǎn)移酶（CAT），S—半乳糖苷酶，將其作為轉(zhuǎn)基因動物的標(biāo)志，這些標(biāo)志系統(tǒng)的成功應(yīng)用大大提高轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)效率。另外，修正外源基因mRNA
的錯誤剪接，增加外源基因拷貝數(shù)，增加核糖體進(jìn)入位點(diǎn)等方法也可以提高轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平。
3.3
特殊DNA 序列的研究

對位置效應(yīng)有緩解作用的特殊的DNA 序列包括MAR、LCR 及隔離子，這些DNA 序列要通過特殊的分子機(jī)制來激活外源DNA 的表達(dá)。MAR 序列是指細(xì)胞核中與核工業(yè)骨架基質(zhì)結(jié)合的DNA
區(qū)段。其特點(diǎn)是富含DNA 拓?fù)涿涪蚩汕懈畹男蛄袑AR 序列可以提高基因表達(dá)效率的原因尚不是很清楚.鑒于MAR幾個物種共同的特征是位于其機(jī)能轉(zhuǎn)錄單位的邊界,因此推測MAR 序列有可能通過核內(nèi)因子(拓?fù)涿涪虻?使附近基因形成獨(dú)立的調(diào)控元,從而屏蔽位置效應(yīng)對轉(zhuǎn)基因表達(dá)的影響。LCR 是另一類對基因表達(dá)有促進(jìn)作用的特殊DNA,其結(jié)構(gòu)和機(jī)能在進(jìn)化上是相當(dāng)保守的。通過幾個物種B-珠蛋的附近LCR
序列研究表明:⑴ LCR 序列使與其相連的外源基因在轉(zhuǎn)基因鼠系中表現(xiàn)出非位點(diǎn)依賴性高效表達(dá);⑵LCR 影響下游附近 200Kb 區(qū)域染色體結(jié)構(gòu)及DNA 復(fù)制模式;⑶LCR 與珠蛋的基因相互作用具有組織及發(fā)育特征性;⑷珠蛋的基因LCR 具有組織特異性DNaseI 超敏位點(diǎn).綜合實(shí)驗(yàn)推測,LCR 可以摒除位置效應(yīng)的主要原因可能是通過其鄰近染色體開放組織來起作用。隔離子序列在染色體中的作用可能是干擾其上游順式元件和其下游DNA
序列之間的相互作用,這只是一種假設(shè),深層原因還需進(jìn)一步研究。
3.4 利用基因共轉(zhuǎn)移提高表達(dá)效率

利用基因共轉(zhuǎn)移提高外源基因表達(dá)效率的途徑又稱基因拯救。具體是將高效表達(dá)的基因結(jié)構(gòu)與低效表達(dá)基因結(jié)構(gòu)共轉(zhuǎn)移,其表達(dá)效率往往得到改善。共轉(zhuǎn)移之所以能提高外源基因的表達(dá)效益,有可能是因?yàn)槟承┗蛑写嬖谠鰪?qiáng)子或隔離子序列或是某些基因的轉(zhuǎn)錄激活同時(shí)帶動其它基因的轉(zhuǎn)錄激活。共轉(zhuǎn)移緩解外源基因的染色質(zhì)化,則可能涉及內(nèi)元的存在.
內(nèi)元的存在可能使異染色質(zhì)化受到某種程度的抑制。

4 轉(zhuǎn)基因動物檢測的方法[5]

以轉(zhuǎn)基因鼠為例，說明轉(zhuǎn)基因動物檢測的方法。雌鼠受精后12h分離受精卵，在體外將加工的外源基因注射到受精卵原核內(nèi)，將10-30個注射過的卵移植到假孕母鼠的輸卵管種，待幼鼠出生后采樣提取DNA。將制備好的DNA樣品點(diǎn)到尼龍膜或硝酸纖維素膜上，再用所注射的基因做成探針，做斑點(diǎn)雜交，檢測出帶有外源基因的小鼠。然后采集血樣或外源基因表達(dá)的器官組織用以制備RNA 。用外源基因作為探針與制備的RNA進(jìn)行Northern分子雜交，檢查外源基因是否轉(zhuǎn)錄成mRNA.接著對帶有外源基因的小鼠進(jìn)行放射免疫測定，以檢測由外源基因合成的蛋白質(zhì)。可用原位雜交法測出外源基因在染色體上的整合部位，還可將帶外源基因的小鼠進(jìn)行繁殖，檢查基因是否進(jìn)入生殖系統(tǒng)，以及在后代中的傳遞情況；另外，還可通過細(xì)胞培養(yǎng)建立轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞株，研究基因在染色體上的位置和基因的調(diào)節(jié)，找出基因的表達(dá)與基因在染色體上的整合部位的關(guān)系。對其他動物除了收集受精卵的方式，注射外源基因和胚胎移植不同之外，其余的檢測方法都是相同的。

5轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)在動物育種中的應(yīng)用[23]
5.1 通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良重要經(jīng)濟(jì)性狀利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以培育出生長快、產(chǎn)量高、回報(bào)率好的優(yōu)良品種[24]
。
例如，Harnmer 等（1985）首先利用轉(zhuǎn)基因操作技術(shù)獲得了轉(zhuǎn)基因豬。
5.2 通過轉(zhuǎn)基因可實(shí)現(xiàn)抗病育種

例如，外源Mx-基因在豬體內(nèi)的表達(dá)，可增強(qiáng)豬抗流感病毒的能力。導(dǎo)入乳鐵蛋白基因的轉(zhuǎn)基因奶牛，具有很強(qiáng)的乳房炎抗病力。
5.3 通過轉(zhuǎn)基因還可改進(jìn)動物產(chǎn)品的質(zhì)量

例如，β-乳球蛋白在奶牛和奶山羊中的表達(dá)，可改變?nèi)榈鞍椎臉?gòu)成，從而提高奶的質(zhì)量和價(jià)值。再如，一種調(diào)控蛋白結(jié)構(gòu)基因的導(dǎo)入，可以改變羊或蠶支持蛋白的合成，進(jìn)而改變羊毛或絲的成分，提高其質(zhì)量。
5.4 通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可使奶牛或奶山羊獲得在乳腺中生產(chǎn)對合成藥物有重要意義的肽和蛋白質(zhì)的新功能，即乳腺生物反應(yīng)器。
其核心內(nèi)容是通過各種轉(zhuǎn)基因技術(shù),將乳腺組織特異性啟動子驅(qū)動的外源基因,在動物乳腺組織高效表達(dá),在乳汁中生產(chǎn)目的產(chǎn)品[25]。目前研制生物反應(yīng)器的主要目的基因有：人類凝血因子、α抗胰蛋白酶、胰島素、人體白蛋白、干擾素等等。
5.5 通過轉(zhuǎn)基因可建立毒理試驗(yàn)的動物模型

如生產(chǎn)對致癌物質(zhì)、誘變劑和毒物敏感的轉(zhuǎn)基因動物，從而有助于對環(huán)境中的危險(xiǎn)因素的認(rèn)識。
5.6 轉(zhuǎn)基因動物在人類醫(yī)學(xué)研究中也有廣闊的應(yīng)用

例如，通過研究制備用于人類臟器移植轉(zhuǎn)基因豬。通過轉(zhuǎn)基因還可為胃腸癌的研究和治療提供動物模型系統(tǒng)。
5.7 通過轉(zhuǎn)基因可使動物產(chǎn)生新的代謝途徑，從而提高其生產(chǎn)性能

例如，具有外源半胱氨酸生物合成基因的轉(zhuǎn)基因羊，其生長速度得到大幅度提高。
6 轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)應(yīng)用于動物育種中存在的問題及對今后育種工作的建議
6.1 轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)應(yīng)用于動物育種中存在的問題
動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)目前存在的問題主要有以下幾個方面：
6.1.1 目前制作轉(zhuǎn)基因動物的效率還很低

綜合各國實(shí)驗(yàn)研究的報(bào)道可以看出，目前動物轉(zhuǎn)基因的效率仍然很低，這是制約轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵問題之一。經(jīng)典的轉(zhuǎn)基因技術(shù)（通常指顯微注射法）應(yīng)用在牛上，形成的合子存活率僅15%，其中僅約18%能發(fā)育為活犢牛[26]。
6.1.2 難以控制轉(zhuǎn)基因在宿主基因組中的行為

現(xiàn)有的動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)仍無法實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的定點(diǎn)整合，轉(zhuǎn)基因在宿主基因組中的插入是隨機(jī)的。轉(zhuǎn)基因在宿主基因組中的隨機(jī)插入可能導(dǎo)致內(nèi)源基因的破壞或失活，也可能激活某
些正常狀態(tài)下關(guān)閉的基因，結(jié)果導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因陽性個體出現(xiàn)不育、胚胎死亡和畸形等不良現(xiàn)象[27]。
6.1.3 難以形成轉(zhuǎn)基因畜禽品種或品系

轉(zhuǎn)基因的隨機(jī)整合使得每個個體的外源基因在其基因組上的位置均不一樣，因此無法使轉(zhuǎn)基因固定，加上轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定遺傳問題也未能解決，因而也就無法形成轉(zhuǎn)基因畜禽品種或品系。迄今為止，雖然有一些轉(zhuǎn)基因動物個體的后代也表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因陽性，但未見有培育成功轉(zhuǎn)基因畜禽品種或品系的報(bào)道。
6.1.4 無法控制轉(zhuǎn)基因的表達(dá)頻率和水平[27]
多數(shù)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)強(qiáng)烈地受著其在宿主染色體上整合位點(diǎn)的影響，即存在著所謂的位置效應(yīng)(position
effect)，相鄰基因或異染色質(zhì)區(qū)域影響著外源基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致同樣的基因在不同的轉(zhuǎn)基因個體表達(dá)的水平很不一致，大部分轉(zhuǎn)基因(尤其是cDNA) 的表達(dá)水平低得難以檢測，而個別個體轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平卻又太高，使宿主動物難以承受。
6.1.5轉(zhuǎn)基因動物模型可能與預(yù)期不符

在鐮刀狀貧血動物模型研究中，人們試圖將突變的血紅蛋的基因轉(zhuǎn)入小鼠以獲得鐮刀狀貧血動物，但結(jié)果使研究者大失所望，所有的轉(zhuǎn)基因動物都只表現(xiàn)出鐮刀狀紅細(xì)胞的病變而未發(fā)現(xiàn)貧血 [10] 。
6.1.6
轉(zhuǎn)基因動物的安全問題

轉(zhuǎn)基因動物給人帶來好處的同時(shí) ，也存在著許多安全性問題。其主要包括：（1）具有某些優(yōu)勢性狀的轉(zhuǎn)基因動物可能會對生態(tài)平衡及物種多樣性產(chǎn)生不良影響；（2）轉(zhuǎn)基因動物器官移植可能會增加“人獸共患”病的機(jī)會；（3）用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的食品有可能使食用者發(fā)生過敏反應(yīng)；（4 ）轉(zhuǎn)基因動物的研究還將會引發(fā)一系列社會倫理問題。為了確保轉(zhuǎn)基因動物對人體的安全性，在大規(guī)模生產(chǎn)之前必須對轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行嚴(yán)格和生物安全檢測 [19] 。
6.1.7人們不了解哪些基因控制著多數(shù)生理過程，不了解基因表達(dá)的發(fā)育控制和組織特異性控制的機(jī)制。
6.1.8 沒有制定出申請轉(zhuǎn)基因動物的合理方案，有關(guān)轉(zhuǎn)基因的倫理學(xué)問題還困擾著許多人。
6.2 對今后轉(zhuǎn)基因動物育種工作的建議[1]
6.2.1 進(jìn)一步加強(qiáng)基礎(chǔ)性問題的研究

如在提高基因轉(zhuǎn)移效率和定點(diǎn)整合的方法學(xué)方面應(yīng)予以優(yōu)先研究;對一些已用于轉(zhuǎn)移的基因，對其發(fā)育和組織特異性表達(dá)的基因開關(guān)和表達(dá)物水平控制的機(jī)制，應(yīng)給予充分重視。
6.2.2 加強(qiáng)學(xué)科間、部門間的合作

轉(zhuǎn)基因動物涉及生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、畜牧學(xué)、獸醫(yī)學(xué)的理論和技術(shù)問題，需要多門類、多學(xué)科的研究人員通力合作。另外，此研究也是一個具有高風(fēng)險(xiǎn)、高投人的研究領(lǐng)域，需要政府企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)共同參與完成。
6.2.3 加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因動物的安全性評估

隨著功能性基因組研究的開發(fā)以及新基因的不斷發(fā)現(xiàn)和利用，需要積累相應(yīng)的大量科學(xué)數(shù)據(jù)來為新基因?qū)Νh(huán)境和人體健康的影響做出正確評價(jià)。因此，有必要建立轉(zhuǎn)基因安全性評估中心和相關(guān)技術(shù)體系，為轉(zhuǎn)基因動物安全性提供科學(xué)依據(jù)盡管轉(zhuǎn)基因技術(shù)目前還不完善，還在發(fā)展之中，但與傳統(tǒng)的育種方法相比，它仍具有許多優(yōu)點(diǎn)。相信隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，它將逐步走向成熟，給動物育種和生產(chǎn)帶來重大變革。

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