酶聯(lián)免疫吸附法在飼料安全檢測中的應用

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酶聯(lián)免疫吸附法在飼料安全檢測中的應用
       摘要：酶聯(lián)免疫吸附技術是一項先進的免疫化學測定技術，目前正愈來愈廣泛地應用于飼料安全檢測，本文簡要介紹了酶聯(lián)免疫吸附法的原理在飼料安全檢測中的運用及其試驗的條件要求。
　　關鍵詞：酶聯(lián)免疫吸附法；應用
　　酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）是免疫酶一種，是一項先進的免疫化學測定技術。因其具有特異性高、敏感性強、結果易于檢測，是飼料安全檢測中某些違禁藥品和添加劑，有害微生物的篩檢和毒素的檢測，是飼料安全檢測中一項新的檢測技術。
1 ELISA 的基本原理及方法類型
1.1 基本原理  EILSA主要是基于抗原或抗體能吸附至固相載體的表面并保持其免疫活性，抗原或抗體與酶形成的酶結合物仍保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應，用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其它物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量有一定的比例，加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，根據(jù)顏色反應的深淺進行定性或定量分析。
1.2方法類型  ELISA  既可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑和五種常見的檢測方法。
1.2.l  三個必要的試劑  固相的抗原或抗體；酶標記的抗原或抗體；酶反應的底物。五種常見的檢測方法  根據(jù)試劑的來源和樣品的性狀及檢測的具體條件，可分為：雙抗體夾心法，主要用于檢測抗原；間接法，主要用于檢測抗體；競爭法，既可用于檢測抗原又可用于檢測抗體；雙抗原夾心法，用已知抗原檢測未知抗體；中和法，檢測抗體。
2 ELISA在飼料安全檢測中的應用
　　飼料安全檢測需要在各種各樣復雜基質的檢樣中對含量非常低的有毒害物質進行檢測、定量和鑒定，由于飼料產品本身具有的附加值低，流通快，數(shù)量大的特點，因此利用快速、便捷、價廉、準確的檢測手段進行飼料安全檢測極為重要。目前在飼料安全檢測中通常采用初篩（提供某種有害物質是否存在的初步信息）——檢測（即進行分離和定量分析）——確認分析（對有疑問的有害物質提供明確的鑒定）程序來監(jiān)測飼料中的有毒有害物質。ELISA因其具有的比傳統(tǒng)的檢測方法靈敏度高、易于使用、較低的設備費用、快速等優(yōu)點，已越來越廣泛地應用于飼料中違禁藥品和添加劑的初篩，毒素的測定，和有害微生物的快速篩檢。
2.1 EllSA用于飼料中違禁藥物和添加劑的初篩2001年12月21日國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局推薦英國Randox公司生產的ELISA試劑盒為我國檢測動物激素和抗生素殘留的首選篩選試劑。目前用于飼料中違禁藥品和添加劑篩檢的商品化試劑盒有許多，例如德國r-Biopharm公司，意大利Tecna及美國Idexx公司的產品等，它們在飼料安全檢測中發(fā)揮著重要的作用。本文僅以ELISA試劑盒篩檢鹽酸克倫特羅為例做一介紹。
　　鹽酸克倫特羅簡稱克倫特羅（CL），因其對人類健康的極大危害，被嚴格禁止在飼料中添加。目前ELISA試劑盒已廣泛用于飼料中克倫特羅的初篩。其基本原理是抗原體反應。即利用樣品中的克倫特羅能與酶偶聯(lián)克倫特羅競爭性地與固相上已包被的克倫特羅結合。其基本步驟首先將克倫特羅抗體加入已包被克倫特羅抗體（羊抗兔IgG）的微孔板內，經過孵育和洗滌，加入克倫特羅酶標記物和待測樣品，樣品中的克倫特羅與克倫特羅酶標記物競爭克倫特羅抗體，洗滌除去沒有連接的克倫特羅酶標記物，將酶基質和發(fā)色劑加入到孔中并孵育，結合的酶標記物將無色的發(fā)色劑轉為藍色的產物，再加入反應停止液后，使顏色由藍轉變?yōu)辄S色，在450mm處測量，吸光度與樣品中鹽酸克倫特羅的濃度成反比。
2.2 ELISA用于飼料中毒素的測定
　　飼料中的毒素主要是由真菌產生的，主要包括黃曲霉毒素，簡曲霉毒素等。運用ELISA能測定飼料中霉菌毒素的含量。以測定黃曲霉毒素為例，黃曲霉毒素是一組化學結構類似的化合物，目前已分離鑒定出12種。在我國飼料標準中黃曲霉毒素的含量通常以黃曲酶毒素B1計，本文僅介紹競爭性ELISA間接法檢測黃曲霉毒素B1。目前ELISA試劑盒也廣泛用于飼料中黃曲霉毒素B1的測定。B1抗原能與黃曲霉毒素B1與載體蛋白的復合物競爭抗黃曲霉毒素B1的特異性單克隆抗體，在固相載體表面形成抗原抗體復合物、復合物再與現(xiàn)標記的第二抗體結合，在酶的作用下，底物發(fā)生降解而產生有色物質，通過酶標儀測定而計算出樣品中黃曲霉毒素B1的含量。其基本步驟首先用包被抗原包被酶標微孔板，洗滌去除未包被抗原，在微孔內加入系列標準黃曲霉毒素B1溶液（制作標準曲線）或樣品提取液，再加人稀釋抗體，孵育，洗滌，在微孔內加入酶標二抗，孵育，洗滌，微孔內加入酶底物溶液，孵育，加中止液中止反應，測量、計算出樣品中黃曲霉毒素B1濃度。
2.3 ELISA用于飼料中有害微生物的快速篩檢 飼料中常含有許多有害微生物，這些有害微生物不僅降低飼料品質，影響畜禽的健康，同時作為一種內源性污染，通過畜產品危及人類。目前飼料安全檢測中對飼料中有害微生物的控制主要是監(jiān)測飼料中沙門氏菌。傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測方法程序復雜，所用試劑繁雜、檢測周期長達七天，遠遠不能適應要求。目前已有許多ELISA試劑盒能方便、快速地篩檢出飼料中沙門氏菌的陽性樣品。據(jù)有關文獻報道，對一些食品（包括自然污染了沙門氏菌和為了對比人為加入少量沙門氏菌（0.04－0.2cfu／mL腸炎沙門氏菌）的食品用Salmonella-Tek試劑盒進行檢測的結果與用常規(guī)培養(yǎng)方法進行檢測的結果進行比較，兩種結果具有完全的一致性。但由于沙門氏菌與某些菌株之間存在相同的抗原，因此ELISA都是用于沙門氏菌的篩檢，而非確證試驗。
　　用ELISA篩檢沙門氏菌，根據(jù)其采用抗體分為多克隆酶和單克隆酶免疫分析篩選方法。其基本原理是利用與沙門氏菌抗原具有高特異性的單克隆（或多克隆）抗體來檢測沙門氏菌。其基本步驟是首先在包被有抗沙門氏菌的單克隆抗體（或吸附有沙門氏菌多克隆抗體）的微孔內加入經過前增菌和選擇性增菌的待檢樣品，樣品中如有沙門氏菌抗原存在，與孔內的特異性抗體結合形成抗原抗體復合物，洗滌去掉小孔內其它物質，加入接合劑，接合劑與抗原抗體結合物中的抗原結合，洗滌去掉未結合的接合劑，加入酶底物，沙門氏菌抗原顯色，再用終止液中止反應，測定光密度值，當光密度值大于或等于臨界值時，即可推定為陽性。
3 ELISA社駐的條件實求
　　由于ELISA檢測范圍在ng至Pg水平，屬于超微量分析技術，因此對試劑、物料及實驗各步驟的反應條件和操作都有嚴格的要求。
3.1 試劑和物料的條件要求  ELISA試驗所需的試劑分為主體試劑和輔助性試劑。通常采用的ELISA商品試劑盒中已包括了足夠進行96個測量的主體試劑和物料，如已包被抗體的微孔板、標準液、酶標記物濃縮液、抗體濃縮液、酶基質、發(fā)色劑、停止液等。在使用時須嚴格按照使用說明書進行，一次檢驗必須使用同一批號試劑盒內的試劑，不能使用超過有效期的試劑（物料）。對于未使用完的試劑和微孔板，必須于2℃～8℃密封保存。不能重復使用微量孔。對于加緩沖液、洗滌劑、樣本稀釋液等輔助性試劑的制備，應最好在臨用時配制。蒸餾水的質量至關重要，不合格的蒸餾水能使空白值升高，必須使用新鮮的雙蒸餾水來制備試劑。
3.2 操作步驟的條件要求 開始試驗前應將試劑盒和待測樣品回至室溫20℃－25℃，每一樣品及試劑均使用單獨的吸嘴以免交叉污染。在加樣時應力求準確，將樣品加入孔底，不可出現(xiàn)氣泡。在孵育培養(yǎng)時，由ELISA試驗一般都有二次抗原抗體反應，應注意使各ELISA條板的溫度迅速平衡，當室溫高于20℃，可將ELISA板避光放在實驗臺上以便不時觀測。在洗滌時應特別仔細，雖然洗滌在ELISA度試驗中不是一個反應步驟，但卻決定著試驗的成敗，洗滌的目的是洗去反應液中沒有與固相抗原（體）相結合的物質，以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質，如洗滌不徹底，特別是最后一次如有酶結合物的非特異性吸附存在，將使空白值升高。

寧衡

費用比較高，對使用的人不公平。