評價飼料酶質量的5種指標

mche2005 · 發表于 2009-5-3 10:45:21

評價飼料酶質量的5種指標
轉載自中國發酵工業商務論壇 »

目前，關于飼料酶的生產和應用的報道很多，從報道的內容分析，無論是生產水平還是質量鑒別能力都比以前有很大提高，但是目前還有很多問題需要研究。
目前廣泛使用的植酸酶、木聚糖酶、葡聚糖酶和果膠酶都有很多同功酶。只要產酶的微生物不同（工程菌除外），酶蛋白的結構通常也是不同的。根據最近的研究發現，植酸酶（可能是結構最簡單的飼料酶）至少有30種的同功酶，它們的活力表現隨pH值的變化情況都是不同的。至于其它飼料酶，例如木聚糖酶，至少有200種同功酶。
很多飼料酶使用者希望能有一套類似NRC的飼料酶使用標準或模板，供行業參考。事實上這幾乎是不可能的，至少在最近的數十年內這種設想還不成熟。飼料酶的質量評判和選用涉及很多因素，遠比普通的工業用酶復雜。一般的工業用酶，如淀粉酶和糖化酶，它們的使用場合比較固定，有比較確定的pH值、溫度、底物和作用時間，而且酶活成分也比較單一明確。但是對于飼料酶，由于飼料原料、加工要求和動物消化道pH的多樣性，需要考慮的因素很多、很復雜。
   動物飼養試驗經常發現，同樣活力的飼料酶，使用效果會不一樣，而且有時差異還很大。如：①同樣是5 000U/g的植酸酶，而且酶活定義和測定方法都符合GB/T18634—2002，為什么在蛋雞料中A酶需要添加100g/t才能達到與B酶添加60g/t同樣的效果？②為什么有的酶在蛋雞料中有效果而在生長豬料中效果很小，而有些酶無論在豬料還是在雞料中都有較好的效果？③為什么有些酶在仔豬料中有效果而在生長豬料中沒有效果？要回答這些問題，需要對飼料酶產品中酶活成分以及影響酶活力的因素進行詳細的分析。分析的因素主要有：酶活力定義、pH值、溫度、反應時間、底物性質及其濃度、耐酸穩定性等。關于酶活測定溫度、反應時間比較容易理解。飼料酶的活力測定溫度一般都選擇在37～ 40℃，反應時間選擇在15～30min。關于酶活力的定義，目前已經逐步改變了前幾年的混亂局面，多數使用國際單位，即每分鐘內從底物溶液中降解釋放1μmol還原產物所需要的酶量。需要重點考察的是pH值、耐酸穩定性和作用底物。
1  pH值對酶活力的影響
由于動物消化道食糜的pH值變化范圍很大，所以單純考慮在某個pH值條件下的酶活表現值是不全面的，最好能測定該酶活組分在比較廣泛的pH值范圍內的活力表現。如圖1所示，兩種植酸酶A和B酶活比較。

植酸酶A在pH5.5時有一個高峰值，而在其它pH條件下表現活力都很低。當pH值低于3.5以后基本沒有活力。但是植酸酶B不僅在pH5.5有一個峰值，在pH2.5時也有一個峰值，其作用范圍要比植酸酶A寬得多，使用效果也要優于A。顯然，要想達到同樣的使用效果，植酸酶A的添加量必須高于B。
2 酶反應底物的分析
底物的類型對酶活的測定值有很大影響，比較典型的是纖維素酶活力的測定，見表1。

纖維素酶是一種復合酶，天然的纖維素都是不溶解于水的高分子聚合物，降解這種聚合物需要多種酶活力的協同組合。根據目前的研究發現，有實際使用價值的纖維素酶至少含有4種活性（C1酶、Cx酶、纖維二糖酶和 β-葡萄糖苷酶）。濾紙酶活（FPA）體現了各活性組分的復合效應，比較符合纖維素酶的實際使用效果。CMCase（以羧甲基纖維素為底物的纖維素酶測定值）沒有體現C1酶的效應（把天然的結晶纖維素分解為可溶于水的游離纖維素），而在實際使用過程中C1酶通常是限速反應的關鍵酶。顯然，以FPA作為選擇飼料纖維素酶的依據比CMCase更合理（即選擇纖維素酶B比較好）。但是，準確測定FPA比較困難，而且數值也比較低，目前絕大多數纖維素酶產品的活力都是以CMCase來表示（包括國外）。
木聚糖酶是第二大飼料用酶，對它的研究也很多。相對而言，木聚糖酶的結構要比植酸酶復雜，影響的因素也更多。木聚糖酶主要有二大類：造紙用木聚糖酶和飼料用木聚糖酶。造紙用的木聚糖酶的測定底物是樺木木聚糖（birchwood xylan），而飼料用木聚糖酶的測定底物是燕麥木聚糖（oat xylan）。因此根據表2的分析結果，選擇木聚糖酶A作為飼料用酶比較合理。
那么如果都采用燕麥木聚糖（Sigma X0627）作為底物，其它測定條件也一樣。比較如下2種木聚糖酶C和D（見圖2），在pH值2.0～7.0的范圍內，木聚糖酶C的表現值始終高于木聚糖酶D，是否就可以確定木聚糖酶C優于D呢？
用無淀粉麥麩作為實際作用底物進行試驗，發現結果與圖2顯示的結果相反，木聚糖酶D優于C（見圖3）。
   在200ml醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH5.5）中加入10.0g無淀粉麥麩和0.50g木聚糖酶，在40℃保溫8.0h。木聚糖酶D可以降解20.5%的麥麩，而木聚糖酶C只能降解18.7%的麥麩，其原因與纖維素酶的情況類同。試驗使用的木聚糖酶是一個復合酶，燕麥木聚糖（Sigma X0627）是溶于水的，而在飼料中存在的木聚糖絕大多數是不溶于水的。
3 酶蛋白的耐酸穩定性
   飼料酶的耐酸穩定性也是考察飼料酶質量的一個指標，如圖4、圖5、圖6和圖7所示，比較米曲霉和黑曲霉發酵物中的酶活力。
除了果膠酶以外，黑曲霉發酵產物中的各酶活幾乎都要比米曲霉發酵產物中的活性高。使用在仔豬料中，黑曲霉發酵物的效果要優于米曲霉發酵物；但是，添加在生長豬料中發現米曲霉發酵物要優于黑曲霉發酵物。通過耐酸性試驗發現，米曲霉發酵物中酶蛋白的耐酸性要明顯優于黑曲霉發酵物。在pH值2.5的條件下40℃保溫2h，米曲霉發酵物中的木聚糖酶、β-葡聚糖酶和纖維素酶的酶活損失都不超過20%，而黑曲霉發酵物中的酶活損失幾乎都超過了70%（見表3）。
但是在pH值大于4.0的條件下，這2組酶系均有很好的穩定性。在pH4.0的條件下40℃保溫2 h，酶活力損失均不超過20%（見表4）。
生長豬胃酸較多，pH值很低，對黑曲霉發酵物的活性成分破壞較大。而仔豬胃酸較少，pH值在4.0左右，對黑曲霉發酵物的活性破壞較少。
4 關于液態發酵和固態發酵產品的分析
目前，國內幾乎所有液態發酵生產飼料酶的企業都宣傳液態發酵的產品優于固態發酵的產品，很多從事動物營養學研究的科研工作者也贊同這個觀點。事實上這個論點有很大的片面性，固態發酵生產在中國、印度、巴西等發展中國家存在，在日本、荷蘭等一些發達國家也很受重視（主要是能耗低和基本沒有污染排放），固態發酵產品的質量也很好。如果產酶菌是霉菌（事實上天然的酶制劑高產菌大多數是霉菌），相對液態發酵而言，固態發酵的產品有以下2個方面的優勢：①酶蛋白屬于次級代謝產物。霉菌的次級代謝產物通常是在霉菌進行分化時形成的。液態培養抑制霉菌分化，所以霉菌固態發酵單位體積的酶產量往往比液態發酵高5～10倍；②固態發酵的原料比較粗放，終產物往往含有多種酶活性，很適合于用作飼料添加劑。而液態發酵的酶系往往比較單一，往往只有一種酶活比較高，而其它組分的酶活很小。
   飼料原料中含有很多非淀粉多糖，分解這些非淀粉多糖需要一組或多組酶系的共同協作才能完成。固態發酵生產的非淀粉多糖酶通常都含有多個亞基甚至多個酶系，固態發酵的底物基本上都是農副產品（主要是麥麩），底物的誘導效應使得發酵產生的酶系有很好的針對性。在酶活測定值相等的條件下，固態發酵生產的酶在飼料中顯示的效果往往要比液態發酵生產的酶更為顯著。
   固態發酵最大的缺點是機械化程度低，勞動強度大，很難進行細菌和酵母的培養。目前高產酶的基因工程菌基本上都是酵母菌和細菌，只能采用液態發酵。
固態發酵主要有托盤式、厚層通風式和轉鼓式3種。托盤式產量最小，但是具有投資少、操作簡便和產品質量好等優點，國內很多企業采用這種方式，利潤空間也比較大。托盤式發酵生產一噸成品原曲需要耗費32～36個勞動日，這在西方發達國家是難以承受的，但是在發展中國家目前還是可以操作的。
5 耐熱和儲存穩定性
耐熱穩定性需要考察二種情況，一種是干物質的耐熱性能，另一種是在水溶液中（或高水分條件下）的穩定性。有報道說某種飼料酶耐熱性能很好，可以耐受飼料的高溫制粒而不失活，這種說法是不全面的，有些酶在干物質條件下有很好的穩定性，但是在高溫水溶液中（或含水量很高的物料中）會很快失活。筆者曾測試一種木聚糖酶，在干粉（含水量不超過10.0%）條件下，105℃保溫2h，酶活損失不超過10.0%，但是在80℃水溶液中保溫5min，酶活損失超過40.0%。進一步試驗發現這種木聚糖酶在飼料的高溫制粒（85～90℃）過程中活力損失通常要超過24.0%。當然，如果不考慮高溫制粒，筆者建議優先選擇價格比較低廉而且活力比較高的粉狀飼料酶。
儲存穩定性對于某些酶產品是必須考慮的。有些霉菌產纖維素酶的能力很強，但是產品的儲存穩定性很差。即使在冬季（環境溫度不超過15℃）存放3個月，活力損失也要超過50.0%。顯然，這種情況無論是對于生產企業還是用戶都要引起重視。
飼料酶質量的評價涉及很多因素，很多科研工作者在這個領域進行了大量工作，積累了很多經驗。但是由于問題的復雜性，目前還沒有成型的公式可以參考。以前筆者曾設想通過實驗室的酶活分析來推算其使用效果，并發表了一些這方面的言論，現在看來，有些觀點是片面的、甚至是錯誤的。關于飼料酶的研究，我們僅僅處于起步階段，不知道的遠遠多于知道的。