抗菌肽的作用機理及其在畜牧生產中的應用

秋深葉一

　抗菌肽（anti－microbial peptides）是生物體內誘導產生的一類具有抗菌作用的生物活性肽，在機體抵抗病原入侵方面起著重要作用。
1 抗菌肽的類型及其結構特點

根據抗菌肽的氨基酸組成和結構特征可分為4類，即天蠶素（cecropins）。防御素（defensins）、蛙皮素（magainins，富含脯氨酸的抗菌肽）和蜂毒素（melittins，富含甘氨酸的抗菌肽）。
　　1.1 天蠶素（cecropins）目前報道的天蠶素約有30種。這類抗菌肽的結構已比較明確，由31～39個氨基酸殘基組成，分子量約4kD左右，含較少的半胱氨酸（Cys，不能形成分子內的二硫鍵，有強堿性的N端和強疏水性的C端，C末端酰胺化。在肽的許多特定位置有較保守的殘基，如2位上的色氨酸，5、8和 9位有1個或 2個賴氨酸（Lys），11位是天冬氨酸（ Asp）， 12位是精氨酸（ Arg）。有些位置盡管殘基不同，但仍為保守替換。對抗菌肽二級結構的理論預測及CD譜和二維核磁共振數據表明，其分子結構含有兩個α-螺旋： 5～21位為第一個螺旋，該螺旋中極性與非極性氨基酸含量相當，因而對水和脂均具親和性，即為兩親性α-螺旋； 25～37位為第二個 α-螺旋，其疏水氨基酸含量高，故該α-螺旋疏水性強。兩個α-螺旋間由22－24位的丙氨酸-甘氨酸-脯氨酸（Ala－Gly－Pro）組成的鉸鏈區（也稱結節部）連接。抗菌肽的螺旋-卷曲-螺旋結構特點對保持高抗菌活性具有特殊的重要性，而酰胺化的C端則對其廣譜作用極為重要。
　　1.2 防御素（defensins） 防御素是美國Ieherer實驗室首次從兔肺巨噬細胞中分離得到的兩個陽離子性極強的小分子抗菌肽，命名為defensin。現已在不同種屬動物的吞噬細胞中發現了20多種。大多數防御素由38～43個氨基酸殘基組成，帶有一個凈正電荷，含有6個位置保守的半胱氨酸并構成3個分子內二硫鍵，二硫鍵與抗菌活性密切相關。defensin由3個結構域組成：1個柔韌的 N瑞環、中部的雙親α-螺旋中心和帶有擬β-轉角的反向平行的β-片層的C末端。α-螺旋和N端環通過二硫鍵分別與β-片層的兩條鏈穩定相連，一種  Cys－ Xaa－ Xaa－ Xaa－ Cys或  Cys－ Xaa－Cys結構在不同種類防御素的分子結構中普遍存在，使α-螺旋得以穩定。
　　1.3 蛙皮素（magainins）蛙皮素最初是Zasloff等在非洲爪贈皮膚和胃粘膜腺體上皮細胞中分離到的小分子抗菌肽。這類肽帶正電荷，根據其殘基數目又可分為兩類：一類是小分子肽類，由15～43個氨基酸殘基組成，都含有Arg一Pro或Lys－Pro氨基酸對，有些則是典型的Arg－Pro－Arg結構；另一類是分子量較大的肽，由83個氨基酸殘基組成。其分子可分為兩個明顯的結構域，N端富含脯氨酸的P結構域和由其余富含甘氨酸的肽構成的G結構域。
　　1.4 蜂毒素（melittins）這類抗菌肽的共同特點是富含甘氨酸，有些是全序中富含甘氨酸，有些則是某一結構域富含甘氨酸。不含或含很少的半胱氨酸，不能形成分子內二硫鍵，氨基酸殘基上不具修飾基團。分子量為8～27個kD。通常這類抗菌肽均在N端有一個富含脯氨酸的P結構域，C端有一個富含甘氨酸的G結構域。P和G兩種結構域的存在可能與其廣譜抗菌作用有關。由于其具有較強的溶血作用而限制了其作為抗菌物質的使用。
2  抗菌胱的作用機理
　盡管關于抗菌肽的作用機理已研究得較多，但目前仍未十分明了。現行的抗菌肽作用模型認為，抗菌肽通過在細胞膜上形成離子通道造成內容物大量外泄而致細胞死亡。Christeson等認為，抗菌肽首先通過靜電作用被吸引到膜表面，然后疏水尾部插入細胞膜中的疏水區域，通過改變膜構象，多個抗菌肽聚合在膜上形成離子通道，造成細胞內容物泄露致細胞死亡。Fink等認為只有C端的疏水螺旋插入膜中，而N端的雙親螺旋只結合在膜表面。Juvvadi（1997）推測抗菌作用的第1步是抗菌肽的陽離子與膜上磷脂基團的陰離子之間相互作用，再與膜上碳氫化合物互作，然后疏水螺旋插入膜上，聚合形成孔道。Park（1997）發現蛙的1種抗菌肽Buforin具有完全不同的抗菌機理，它不裂解細胞膜，而是穿過膜后與DNA、RNA結合，快速導致細胞死亡。此外，人們還發現抗菌肽可通過抑制細胞呼吸、抑制細胞外膜蛋白的合成或抑制細胞壁的形成等機制來殺死細菌。目前對抗菌肽抗真菌的機理研究較少，Cavallarin（1998）發現位于Cecropins衍生物N末端螺旋區域的11個氨基酸順序與抗真菌活力有關；Lee等（1989）則觀察到真菌受抗菌肽作用后，細胞膜上有空洞形成，推測其與抑殺細菌的機理類同。

研究表明抗菌肽并不作用于高等動物細胞，這可能是由于高等動物細胞膜中的膽固醇阻礙抗菌肽的疏水面插入磷脂雙分子層；也可能是由于微生物與高等動物細胞膜的膜外結構的區別：高等動物細胞膜外表面的唾液酸與膜的距離有8nm，它可能與抗菌肽的帶正電區結合而阻止其接近細胞膜發揮殺傷作用。
3　動物體內的抗菌研究
　　各種動物在長期自然進化過程中，其體內已建立了一套維持其體內菌群穩態的機制。抗菌肽是這一機制中的主要因子之一，廣泛存在于所有脊椎動物和無脊椎動物機體中。例如，豬抗菌肽（PR－39）已被發現（Lee等，1989），它是一個分子量為4719D的肽，從豬腸中分離，屬于富含Pro－Arg的肽家族，不裂解野生型大腸桿菌，但對突變型K12有作用，其作用機制是通過阻斷蛋白質和DNA的合成，從而導致這些成分的降解。PR－39在一個單層囊泡中可以誘導鈣的降低和電流的線性增加，此誘導與肽濃度和膜上甘油磷酸酯（帶負電荷）有關。另外在豬小腸中，還發現另一種抗菌肽cecropin PI，它是以裂解細菌來完成殺菌作用的。Andersson（1995）運用基因工程技術從豬骨髓RNA中克隆到一種新型的CDNA，其編碼一個78殘基的抗菌肽NK－lysin，有3個分子內二硫鍵，這種肽對NK一敏感型的腫瘤細胞株YAC－1有裂解活性，但不裂解紅血球細胞。而在綿羊中至少已發現10種抗菌肽；牛中至少已發現30種抗菌肽；另外，牛奶中也分離到3種抗菌肽，它們具有抑制腸毒性大腸桿菌和單核細胞增多性李氏桿菌的生長的作用。

在水生動物中，Schnapp等（1996）從青圓蟹（Carcinus maenas）的血細胞中分離到3種具有殺菌作用的肽，并對其中的一個6.5 kD的抗菌肽進行部分序列分析。從不同種鱟的血細胞中也分離到多個抗菌肽，發現它們具有與其他昆蟲、蛙和哺乳類動物抗菌肽共同的結構特點，即由于多個精氨酸和賴氨酸殘基的存在而帶陽性電荷，形成兩親性二級結構，能選擇性地作用于細菌外層細胞膜的某些組分，如帶陰離子的磷脂，增大其滲透性而殺死或抑制細菌的生長，并具有與幾丁質結合的活性等。 Park等報道了鯰（Parasiliuus asotus）受傷時上皮粘膜細胞層分泌一種分子量為 2 kD的抗菌肽Parasin I，具有廣譜強抗菌活性，沒有溶血作用，其抗菌活性是蚌皮素2的12～100倍。對水生甲殼動物及魚類體內抗菌肽的研究表明，抗菌肽是水生動物防御系統的主要成分之一。
4  抗菌聯的基因工程
　　由于抗菌肽具有廣譜殺菌作用、相對分子量較小、熱穩定、水溶性好等優點，更為重要的是抗菌肽對真核細胞幾乎沒有作用，僅作用于原核細胞和發生病變的真核細胞，在當前不少病原菌對原有抗生素逐步產生耐藥性時，對動物體內自然產生的抗菌肽功能的了解以及設計一種方法來調節動物體內自然抗菌肽的功能以替代抗生素的研究便顯得極為重要。其中通過抗菌肽基因的克隆與表達而大量生產抗菌肽是一種較為直接而有效的方法。目前昆蟲和植物抗菌肽基因工程，在國內外已有不少成功的報道，但畜禽抗菌肽基因工程國內外尚未見報道。因此，運用基因工程技術，通過對畜禽及水生動物抗菌肽的研究，以提高畜禽及水產養殖品種的抗病能力，將對減少甚至替代抗生素的使用起到積極的促進作用。隨著分子生物學技術的發展，抗菌肽在動物生產中的應用前景將十分廣闊。
抗菌肽前景廣闊的新型抗生素
   隨著抗生素的長期廣泛應用，病原菌耐藥性也日趨嚴重.;
   廣譜抗菌，殺菌力強，尤能殺耐藥菌
   自發現青霉素以來，抗生素一直是人類治療病原微生物感染疾病的有力武器，但隨著抗生素的長期廣泛應用，病原菌耐藥性的形成也日趨嚴重，迫切要求開發新型抗生素，而且前從微生物中尋找新生物的難度已愈來愈大。來源于動物的抗菌肽(也稱為殺菌肽，動物多肽抗生素)的發現，為開發新型抗生素提供了新的廣闊的來源。近年來，對抗菌肽的理論和應用研究獲得了迅速發展。
   抗菌肽的發現起源于對昆蟲免疫機制的研究，當昆蟲受到外界刺激時，發生免疫應答反應，在體內誘導產生出具有強烈抗菌活性的物質，抗菌肽是其中重要組成成份。后來，又在兩棲動物、哺乳動物中分離得到類似的具有抗菌活性的多肽，使人們對抗菌肽的起源及其在進化中的作用有了新的認識。隨著對抗菌肽結構與功能、抗菌肽-生物膜相互作用機理、抗菌肽基因的分子生物學、抗菌肽基因工程等研究的深入進行，抗菌肽在醫療、農業等領域顯現出廣闊的應用前景。

抗菌肽的概念和分類
   抗菌肽原指昆蟲體內經誘導而產生的一類分子量在4KD左右，具有抗菌活性的堿性多肽物質。最初，人們在研究北美天蠶的免疫機制時，發現其滯育蛹經外界刺激誘導后，其血淋巴中產生了具有抑菌作用的多肽物質，這類抗菌多肽被命名為天蠶素(Cecropins)。后來，從其他昆蟲以及兩棲類動物、哺乳動物中，也分離到結構相似的抗菌多肽。迄今為止，在不同動物組織中已發現了很多具有抗菌作用的蛋白質和多肽，已有70多種抗菌多肽的結構被測定，抗菌肽的概念得到了極大的擴展。
   根據抗菌肽的結構，可將其分為5類：(1)單鏈無半胱氨酸殘基的α-螺旋，或由無規卷曲連接的兩段α-螺旋組成的肽；(2)富含某些氨基酸殘基但不含半胱氨酸殘基的抗菌肽；(3)含1個二硫鍵的抗菌多肽；(4)有2個或2個以上二硫鍵、具有β-折疊結構的抗菌肽；(5)由其它已知功能的較大的多肽衍生而來的具有抗菌活性的肽。其中最早分離到的Cecropins和從非洲爪蟾中分離到的Magainins等屬于第一類抗菌肽，通常也將其稱為Cecropin類抗菌肽，目前對此類抗菌肽的研究也較深入。

抗菌肽的生物學效應
   抗菌肽具有廣譜抗菌活性，對細菌有很強的殺傷作用，尤其是其對某些耐藥性病原菌的殺滅作用更引起了人們的重視。
   除此之外，人們還發現，某些抗菌肽對部分病毒、真菌、原蟲和癌細胞等有殺滅作用，甚至能提高免疫力、加速傷口愈合過程。
   抗菌肽的廣泛的生物學活性顯示了其在醫學上良好的應用前景。

抗菌肽的作用機制
   自從發現抗菌肽以來，已對抗菌肽的作用機理進行了大量研究。目前已知的是，抗菌肽是通過作用于細菌細胞膜而起作用的，在此基礎上，提出了多種抗菌肽與細胞膜作用的模型。但嚴格地說，抗菌肽以何種機制殺死細菌至今還沒有完全弄清楚。
   目前一般認為,Cecropin類抗菌肽作用于細胞膜，在膜上形成跨膜的離子通道，破壞了膜的完整性，造成細胞內容物泄漏，從而殺死細胞。
   對于抗菌肽破壞膜的完整性，使細胞內外屏障喪失，從而殺死細菌這一觀點已得到基本統一的認識，但對其具體作用過程、是否存在特異性的膜受體、有無其它因子協同等問題尚不十分清楚，存在不同看法。不同抗菌肽的作用機制可能不一樣，尚有待進一步研究。

抗菌肽基因工程
   抗菌肽在動物體內含量極微。從動物體內提取抗菌肽產量低、費時長、工藝復雜、費用昂貴，無法實現大規模生產，這成為制約抗菌肽進入實際應用的最大障礙。因此，開展抗菌肽基因工程研究具有重要意義。
   目前，已進入臨床應用的基因工程藥物多數是采用原核表達系統生產的，但由于抗菌肽對細菌的殺傷作用，不能用原核表達系統直接表達具有生物活性的抗菌肽，而如果采用融合蛋白的形式表達，將給表達產物的后處理帶來很大麻煩。因此，國內外的研究者多采用真核表達系統進行抗菌肽基因工程研究。

   近年來，以酵母為基因工程受體菌的研究引起人們的重視，酵母具有比大腸桿菌更完備的基因表達調控機制和對表達產物的加工修飾及分泌能力，并且不會產生內毒素，是基因工程中良好的真核基因受體菌。自1978年Hinnen等首先試驗酵母轉化成功后，已有人干擾素基因、乙型肝炎表面抗原基因、α-淀粉酶基因等數十種外源基因在酵母中獲得表達。國內研究者大量研究表明，利用酵母表達抗菌肽是一條可行的道路，如能在表達產率上得到進一步提高，將為抗菌肽早日進入臨床應用奠定良好的基礎。

lirong0805

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